一種苗期鑒定煙草赤星病抗性的新方法

侯 爍，朱承廣，趙 強，向小華，程亞增，閆杏杏， 蔣彩虹，程立銳，楊愛國，王元英*

（1.青島農業大學，青島 266109；2.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101)

一種苗期鑒定煙草赤星病抗性的新方法

侯 爍1,2，朱承廣2，趙 強2，向小華2，程亞增2，閆杏杏2， 蔣彩虹2，程立銳2，楊愛國2，王元英2*

（1.青島農業大學，青島 266109；2.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101)

煙草赤星病抗性的高通量鑒定是快速篩選和培育煙草抗赤星病品種的前提條件。以15份對赤星病表現不同抗性水平的煙草種質為材料，采用鏈格孢菌菌餅接種苗期離體葉片，以發病葉片病斑面積作為抗性評價指標，對15份煙草種質的抗性進行評價，并與其田間成株期赤星病抗性進行比較分析。結果表明，采用苗期菌餅接種，供試15份煙草種質的病斑面積差異顯著，感病品種病斑平均面積明顯大于抗病品種；各品種苗期赤星病鑒定結果與成株期抗性鑒定結果基本一致，且苗期病斑面積大小與3個不同年份、同一地點的成株期平均病級指數間相關性均達到顯著水平，分別為0.78、0.74和0.66。表明本研究探討的苗期離體葉片菌餅鑒定法可以用于煙草赤星病早期鑒定，病斑面積可以作為評價指標準確反映不同煙草品種間赤星病的抗性差異。

赤星病；離體鑒定；病斑；病級指數

煙草赤星病是一類由鏈格孢菌引起的煙株成熟后期病害，其主要危害煙草葉片，影響煙葉的產量和品質[1]。由于煙草赤星病的發病條件受溫度、濕度等環境因素影響較大，使得煙草赤星病的接種鑒定成為一個難題。因此，建立一個在可控條件下快速準確的鑒定方法十分必要。首先科學的接種鑒定株都能發病且接種后病原菌要處于相對一致的有利于發病環境當中；二是科學的調查標準與適時的病情調查，調查標準可靠，主觀誤差盡可能小，病情調查時期適當[2]。目前，針對煙草赤星病抗性接種鑒定主要有3種方法：田間鑒定法[3]、離體葉片鑒定法[4-5]和毒素鑒定法[6-7]。為了克服大田鑒定周期長以及鑒定結果受溫、濕度等環境因素影響大的缺點[8]，本研究在總結前人的研究基礎上，探討了一種苗期鑒定煙草赤星病抗性的新方法，為快速高通量篩選和培育煙草赤星病抗病品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

15份供試煙草種質來自中國農業科學院煙草研究所國家煙草種質資源中期庫（表1）。其中包括8份選育烤煙種質，4份引進烤煙種質，2份地方烤煙種質和1份引進雪茄煙種質。根據煙草品種資源信息，這15份煙草種質對赤星病的抗性各異，其中凈葉黃和Beinhart1000-1是煙草赤星病抗病育種工作中利用的主要抗源。供試煙草種質均采用1% AgNO3溶液浸泡10 min滅菌后使用。

供試煙草赤星病菌株由中國農業科學院煙草研究所煙草植物保護研究中心提供，為強致病力鏈格孢菌菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 育苗及田間種植 煙草赤星病苗期鑒定材料于中國農業科學院煙草研究所即墨農場溫室中進行育苗，將種子播種于假植盤中，覆膜保濕，出苗后揭去保鮮膜，20 d左右每個品種選取50棵健壯幼苗假植于50孔育穴盤中，進行苗期常規管理。40 d左右每份種質選取4棵生長健康、長勢一致的煙苗移栽至小花盆中，置于溫度為28 ℃，空氣相對濕度為65%的人工氣候室中生長。

煙草赤星病成株期田間鑒定材料育苗方法同上，2013、2014和2015年均在5月上旬移栽至農場大田，每個品種移栽1行形成一個小區，每行5株，行距1.2 m，株距0.55 m。常規水肥管理。

1.2.2 苗期煙草赤星病接種鑒定方法 （1）葉片選取：煙苗移栽至小花盆后，待煙株長至5～7葉期時從每株頂部往下選取第3或4片完全展開的葉片（圖1A），葉片用濕潤棉花包住葉柄處保濕，置于鋪有濾紙的濕潤海綿上，將海綿置于盛有600 mL蒸餾水，長×寬×高=2 cm×15 cm×8 cm的保鮮盒中。

（2）病原菌活化：將鏈格孢菌在PDA培養基上進行活化，于黑暗條件下28 ℃培養3～4 d。

（3）接種鑒定：采用5 mm打孔器沿菌落邊緣打取含白色菌絲的菌餅若干備用（圖1B）。每片煙葉背面沿主脈對稱接種4個菌餅，白色菌絲面朝下（圖1C），每片煙葉為一個重復，共3次重復。接菌完畢后將保鮮盒置于溫度為28 ℃，光/暗周期為16 h/8 h條件下人工氣候室培養，保鮮盒內濕度保持在90%左右（圖1D）。5 d后測量和統計病斑圓形面積（圖1E）。

1.2.3 田間煙草赤星病接種鑒定方法 （1）孢子懸浮液制備方法：煙草赤星病菌于PDA培養基上于28 ℃，黑暗條件下進行活化。待菌落鋪滿整個培 養皿后，進行分生孢子濃度檢測，分生孢子濃度約為3×106個/mL時用于接種。按無菌水：分生孢子=50:1的重量比配制成孢子懸浮液備用。

表1 16份煙草種質Table 1 The 16 tobacco germplasms

圖1 煙草赤星病接種流程Fig. 1 Tobacco brown spot inoculation process

（2）孢子懸浮液濃度計算方法：移液槍移取5 mL無菌水注入培養皿，用載玻片刮取菌落，洗脫過濾菌絲。用移液槍移取1 mL洗脫液注入血球計數板的凹槽至凹槽滿。顯微鏡觀察計數（20×），計數時讀取雙線格中菌數，共計25格。孢子懸浮液濃度計算方法如下：

10000×稀釋倍數 （此試驗稀釋倍數為5）

（3）田間病級調查：大田煙株長至9～10葉時利用劃傷懸滴接種法接種兩片底部葉，套袋保濕，3周后調查發病情況。煙草赤星病分級標準按照煙草病蟲害分級及調查方法（GBT23222—2008），以葉片為標準分級調查，共劃分為6個標準：0級，全葉無病；1級，病斑面積占葉片面積1%以下；3級，病斑面積占葉片面積2%～5%；5級，病斑面積占葉片面積6%～10%；7級，病斑面積占葉片面積11%～20%；9級，病斑面積占葉片面積21%以上。

病級指數=100×∑（代表數值×病級葉數）/（葉 片總和×發病最終病級代表數值）

抗性評價：免疫，病情指數等于0；高抗，0＜病情指數≤30；中抗，30＜病情指數≤50；中感，50＜病情指數≤70；高感，70＜病情指數≤100。 1.2.4 數據處理 數據、圖表處理及統計分析在Microsoft Excel 2003中進行，方差分析采用SPSS軟件處理。

2 結 果

2.1 苗期離體葉片赤星病抗性鑒定結果

使用菌餅接種煙草苗期離體葉片，5 d后進行表型變化觀察。結果表明，抗病品種葉片被侵染部位形成較小的病斑（圖2a），感病品種被侵染部位形成較大的病斑，葉片褪綠變黃現象嚴重（圖2b）。接種后5 d進行病斑面積測量統計和方差分析，供試煙草品種間病斑平均面積多重比較結果顯示（表2），15份煙草種質病斑平均面積差異顯著，病斑平均面積最大為127.58 mm2，最小為7.21 mm2，根據病斑平均面積對15份供試煙草種質進行赤星病抗性劃分，NC82、C151和小黃金1025表現為高度感病；大柳條和NC89表現為中度感病；長脖黃和革新三號表現為中度抗病；凈葉黃、K326、SpeightG-28、9201、紅花大金元、Beinhart1000-1、單育二號和潘圓黃表現為高度抗病。

圖2 不同煙草品種接種后5 d病癥Fig. 2 Disease symptoms of tobacco 5 days after inoculation

表2 不同煙草品種病斑平均面積多重比較Table 2 The multiple comparison for average lesion area of different tobacco varieties

2.2 田間赤星病抗性鑒定

使用劃傷懸滴法接種大田煙草葉片，將接種葉片套袋保濕，3周后進行病級調查統計，2013、2014、2015年病級統計分析結果表明（表3），C151、小黃金1025、大柳條、紅花大金元、K326、長脖黃、潘圓黃、和凈葉黃9個品種抗性表現相對穩定。其中，C151和小黃金1025三年抗性鑒定結果均表現為高度感病；大柳條、紅花大金元和K326三年抗性鑒定結果均表現為中度感病；長脖黃3年抗性鑒定結果均表現為中度抗病；潘圓黃和凈葉黃3年抗性鑒定結果均表現為高度抗病。NC89、NC82、革新三號、9201、SpeightG-28、單育二號和Beinhart1000-1七個品種各年份間抗性表現并不都相同。綜合3年抗性鑒定結果可知，NC89和NC82表現為高度感病；革新三號、9201和SpeightG-28表現為中度抗病；單育二號和Beinhart1000-1表現為高度抗病。

煙草赤星病苗期鑒定與大田鑒定比較結果顯示，苗期和大田期鑒定結果中NC82、C151和小黃金1025均表現為高度感病；大柳條均表現為中度感病，長脖黃、革新三號均表現為中度抗病，凈葉黃、Beinhart1000-1、單育二號和潘圓黃均表現為高度抗病，SpeightG-28、NC89和9201苗期與大田期抗感趨勢表現一致。說明苗期離體葉片菌餅鑒定法的鑒定結果較為可靠，該法可用于煙草赤星病抗病品種的初步鑒定與篩選。

表3 不同煙草品種田間赤星病抗性鑒定Table 3 Evaluation of different tobacco resistance to brown spot disease in the field

2.3 相關分析驗證

使用SPSS軟件進行苗期病斑平均面積與大田病情指數間相關分析，結果表明，苗期病斑平均面積與2013、2014和2015年大田病情指數之間的相關系數分別為0.78、0.74和0.66，均達極顯著水平（表4），進一步說明苗期病斑面積可以作為赤星病抗性的評價指標。

表4 苗期病斑平均面積與田間病情指間數相關系數Table 4 Correlation coefficients between average lesion area in stage and average disease rating in the filed

3 討 論

前人在煙草赤星病抗性鑒定方面進行了較多探索和研究。孢子懸浮液和AT毒素是進行赤星病接種鑒定最常用的兩種介質，無論苗期還是成株期兩種物質都能夠用來接種。孢子懸浮液制備比較簡單，接種濃度可控，但接種后發病慢，發病情況受孢子懸浮液濃度和溫、濕度等環境條件影響較大[9]；AT毒素活性強，接種后發病快，但AT毒素的提取和純化過程復雜[10-11]。因此，在煙草赤星病抗性鑒定過程中，大多數研究者選擇分生孢子懸浮液作為接種物質。

針對煙草赤星病的接種鑒定，研究者通常在實驗室和大田兩種環境中進行。大田鑒定通常以成熟期葉片為接種對象，采用劃傷接種或直接噴施孢子懸浮液的方法進行接種鑒定，鑒定結果準確性較高，但其周期長，工作量大[12]。實驗室鑒定方法多種多樣，有毒素培養基法、毒素浸根法、離體葉片鑒定法等[6-7]，本研究在總結前人基礎上，采用鏈格孢菌菌餅接種苗期離體葉片進行赤星病抗性評價，與大田鑒定相比，菌餅制備和接種方法比孢子懸浮液簡便，發病相對較快，周期短，省時省力，且溫、濕度可控，不受季節限制，受環境影響小。但與其他方法相比，本研究的離體葉片菌餅鑒定法也有不足之處，下一步可增加病害發生和侵染過程中一些調查指標，如病斑形成的快慢和侵染后是否造成葉片衰老變黃等，以便對不同種質赤星病抗性做出更為全面、客觀的評價。

本研究采用的苗期離體葉片菌餅鑒定法對不同煙草種質進行赤星病抗性早期鑒定，為開展煙草赤星病抗病育種和抗病分子機制研究奠定了基礎。

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A New Method to Evaluate Tobacco Resistance to Brown Spot Disease at the Seedling Stage

HOU Shuo1,2, ZHU Chengguang2, ZHAO Qiang2, XIANG Xiaohua2, CHENG Yazeng2, YAN Xingxing2, JIANG Caihong2, CHENG Lirui2, YANG Aiguo2, WANG Yuanying2*

（1. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

High-throughput resistance evaluation in vitro is important for the screening and breeding of tobacco varieties resistant to tobacco brown spot disease. In this study, detached leaves at the seedling stage of 15 tobacco germplasm materials with different resistance to tobacco brown spot disease were inoculated with plugs of Alternaria alternata. The lesion area was used to evaluate the disease resistance of the 15 tobacco germplasm materials after inoculation, and the tobacco resistance identified at the seedling stage was compared with that at the adult stage in the field. The results showed that the lesion areas of 15 tobacco varieties were significantly different after inoculation, and the lesion areas of the susceptible varieties was obviously larger than that of the resistant varieties. The resistance identified at the seedling stage and at the adult stage was similar. At the same location with three years’ field experiments, the correlation coefficients between lesion areas and disease indexes were 0.78, 0.74 and 0.66, all at a significant level. In conclusion, this method of inoculation of fungal plugs on detached seedling leaves can be used to effectively evaluate the resistance of tobacco varieties to brown spot disease at early stages, and lesion area can be taken as an index to accurately indicate the resistance of different tobacco varieties to brown spot disease.

tobacco brown spot; resistance evaluation in vitro; lesion; disease index

S435.72

1007-5119（2016）06-0072-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.013

國家煙草專賣局煙草基因組計劃重大專項項目“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標記開發及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009）

侯 爍（1990-），男，在讀碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。E-mail：15165235159@163.com。*通信作者，E-mail：wangyuanying@caas.cn

2016-05-16

2016-08-28