貴州不同倉貯環境對醇化片煙蛋白質及氨基酸含量的影響

陳 頤，楊佳玫，王玉平，盧志偉，蘇 宇，楊虹琦*

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；2.貴州中煙工業有限責任公司，貴陽 550009）

貴州不同倉貯環境對醇化片煙蛋白質及氨基酸含量的影響

陳 頤1，楊佳玫2，王玉平2，盧志偉2，蘇 宇1，楊虹琦1*

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；2.貴州中煙工業有限責任公司，貴陽 550009）

為探究不同倉貯環境及不同產地片煙蛋白質及氨基酸含量的變化規律，以位于貴州興義、貴陽和貴定的3個醇化庫中6個產地片煙為材料，對醇化片煙的蛋白質、游離氨基酸和游離脯氨酸含量進行了動態變化分析。結果表明：（1）片煙醇化過程中，3個醇化庫不同產地片煙的蛋白質含量持續下降，游離氨基酸含量在醇化12個月內上升，但醇化12個月后下降；（2）醇化過程中片煙游離脯氨酸含量持續升高，與游離氨基酸總量呈現不同的變化趨勢，所以醇化片煙中脯氨酸氧化分解較少。（3）醇化6～18個月時，清香型和中間香型片煙蛋白質含量的變化幅度存在顯著差異，但濃香型片煙的蛋白質含量變化幅度均差異不顯著；醇化12～18個月時，濃香型片煙游離氨基酸含量的變化幅度存在極顯著差異。（4）受環境溫濕度的影響，興義庫片煙蛋白質和游離氨基酸含量的變化幅度均大于貴陽庫和貴定庫片煙，并且同一醇化庫中不同產地片煙蛋白質和游離氨基酸的降解幅度均存在差異。因此，倉貯環境對片煙醇化過程中蛋白質和氨基酸含量有較大影響，進而將影響片煙醇化質量及效益。

片煙；醇化；倉貯環境；蛋白質；游離氨基酸

醇化也叫陳化，是指煙葉烘烤和復烤后，在自然條件下煙葉某些品質缺陷（如青雜氣、刺激性和異味）緩慢減少，香氣更加顯露，吸食品質明顯提高的過程[1-3]。倉貯環境是片煙醇化過程中化學成分變化的主要影響因子之一。目前研究普遍認為，影響煙葉醇化質量和倉儲損耗程度的因素主要有溫度、相對濕度、煙葉含水率和空氣含氧量[4-5]。因此，圍繞影響片煙倉貯主要環境因素及其對煙葉化學成分影響的研究，已成為國內外煙草研究工作者關注的熱點[6-7]。宋紀真等[8]對不同倉貯環境片煙感官質量變化的研究結果表明，不同倉貯環境對片煙的感官質量影響較大，其中低溫高濕的倉貯環境不利于片煙的自然醇化，而高溫適濕倉貯環境的片煙感官質量較優。程昌新等[9]對不同儲藏醇化措施的煙葉品質進行了研究，結果表明，黑膜覆蓋+噴施酶制劑的處理，煙葉總糖、總氮、蛋白質含量略有降低，還原糖含量略微升高，煙葉化學成分趨于協調，在煙葉感官品質方面也最優。

烤煙中對煙葉品質及煙氣質量影響較大的含氮化合物主要有蛋白質、游離氨基酸以及煙堿等。其中的蛋白質可分為難溶性蛋白質和可溶性蛋白質兩類，可溶性蛋白主要是殘留于煙葉中的酶蛋白，難溶性蛋白則是存在于細胞壁中，與纖維素和基質多糖形成共價連接的胞壁蛋白質分子。烤煙成熟調制過程中，大部分可溶性蛋白質被蛋白酶降解成氨基酸和寡肽，而胞壁蛋白受質膜和基質多糖的阻隔難以被蛋白酶降解[10]。但在煙葉醇化過程中，片煙中的胞壁蛋白在微生物分泌的蛋白酶作用下將降解為氨基酸[11]。煙葉中的氨基酸可分為常見蛋白氨基酸、稀有蛋白質氨基酸和非蛋白氨基酸三大類，這些游離氨基酸在高溫烘烤或游離基反應條件下發生酶促和非酶促棕色化反應，產生具有焦香和焦甜香成分[12-14]。協調片煙中蛋白質和游離氨基酸含量，是卷煙工業通過自然醇化促使煙葉的化學成分協調，提高煙葉感官品質，達到適宜工業可用性目標的有效途徑。本文系統研究不同倉貯環境下片煙蛋白質和氨基酸含量的動態變化規律，旨在為合理貯存烤煙原料、改善片煙質量提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2013年6月至2015年6月在貴州中煙貴州興義、貴州貴陽和貴州貴定標準貯煙倉庫進行。片煙均按文獻[15-16]進行養護管理，片煙裝箱水分統一控制在13%±0.5%，裝箱溫度控制在（40±3）℃，裝箱密度為200 kg/箱，煙箱距地面高度200 mm，每4～5個煙箱成堆成一垛，距墻壁距離300 mm。本試驗選取經打葉復烤后的湖南郴州、河南許昌濃香型中部片煙，貴州遵義中間香型中部片煙，四川涼山、云南保山和福建三明清香型中部片煙各3箱作為試驗分析材料。

1.2 試驗設計

從2013年6月開始，每隔6個月取樣1次，至貯存期達到18個月后，每隔3個月取樣1次，共計取樣6次，醇化周期為24個月。取樣方法為開箱取樣，棄表層片煙后，按照對角線取樣法從每個箱煙中取500 g片煙混合均勻，再從中取約2 kg片煙并分成兩份，一份切絲用于感官評吸，另一份粉碎并過60目篩，裝入樣品袋密封并保存于4 ℃冰柜中，用于化學成分檢測。

在片煙自然醇化過程中，采用干濕球溫度計定期監測片煙醇化庫環境溫濕度變化，同時記載醇化箱內片煙有無霉變和蟲害情況。

1.3 測定方法

片煙游離氨基酸和蛋白質的提取[17]：準確稱取煙樣（干燥、磨細、過60目篩）0.5 g于200 mL的錐形瓶中，加入10 mL 10%冰醋酸，封口超聲10 min后，過濾，濾液用于游離氨基酸含量檢測，濾渣及濾紙放入消化瓶中，于平板電爐上消化，并采用凱氏定氮法測定總氮含量[18]。

片煙游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸法提取和測定[17]：準確稱取煙樣（干燥、磨細、過60目篩）0.5 g于研缽中，加2～3 mL 3%磺基水楊酸研磨提取，定容5 mL，轉入沸水浴提取10 min。冷卻后以3000 r/min離心10 min，上清液用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量。

片煙游離氨基酸總量采用10%醋酸提取，茚三酮顯色法測定[17]；片煙蛋白質含量采用總氮含量乘以系數6.25的方法換算。

1.4 數據統計

所有數據均采用EXCEL、SPSS17.0等分析軟件進行方差分析、計算和統計作圖表。

2 結 果

2.1 3個醇化庫全年月平均溫濕度的變化

由圖1可知，3個醇化庫全年月平均溫度變化呈現“降-升-降-升”的形態，這是因為本試驗醇化0、12和24個月的取樣時間均在倉貯環境溫濕度相對較高的6月份，此階段3個倉庫的月平均溫度在19.74～28.13 ℃，月平均相對濕度在55.67%～78.78%。而醇化6個月、醇化18個月和醇化21個月的取樣時間均在倉貯環境溫濕度相對較低的12月或3月份，此階段3個倉庫的平均溫度在9.5～17.90 ℃，平均相對濕度在54.38%～73.47%。其中，興義庫的全年月平均溫度明顯高于貴陽庫和貴定庫，而貴陽庫和貴定庫的全年月平均溫度相差不大。3個倉庫的平均相對濕度差異較大，3月和6月份貴陽庫的月平均相對濕度最高，其次為興義庫，貴定庫的月平均相對濕度最低；12月份貴陽庫的月平均相對濕度下降至與興義庫相同。

圖1 3個片煙醇化庫月平均溫度和相對濕度的動態變化Fig. 1 The dynamic changes of monthly average temperature and relative humidity in three tobacco aging storehouses

2.2 3個醇化庫片煙蛋白質含量的動態變化

由圖2可見，在片煙醇化過程中，3個醇化庫不同產地片煙蛋白質平均含量從11%持續下降至6%以下。由表1可知，醇化6～12個月和12～18個月時，3個醇化庫中清香型和中間香型片煙蛋白質含量的變化幅度存在顯著差異，但濃香型片煙蛋白質含量的變化幅度差異不顯著。其中興義庫中云南保山、四川涼山、福建三明和貴州遵義片煙的蛋白質含量下降幅度最大，這說明興義庫月平均氣溫較高可加速蛋白質的分解速度。

2.3 3個醇化庫片煙游離氨基酸含量的動態變化

3個醇化庫不同產地片煙游離氨基酸含量的動態變化見圖3和表2。由圖3看出，在片煙醇化過程中，3個醇化庫不同產地片煙游離氨基酸的含量呈現先增加后持續下降的變化，并且除河南許昌煙葉的游離氨基酸含量是由2.5%左右下降至1.5%之外，其他產地片煙的游離氨基酸含量均由1.8%左右下降至1%以下。由表2可知，醇化6～12個月時，3個醇化庫不同產地片煙的游離氨基酸含量的變化幅度均存在顯著差異，并且均為興義庫片煙氨基酸含量的變化幅度最大。但醇化12～18個月后片煙游離氨基酸含量開始下降時，僅河南許昌和湖南郴州濃香型片煙游離氨基酸含量的變化幅度存在極顯著差異，其余產地片煙的氨基酸含量變化幅度的差異均不顯著。由于片煙在醇化0～12個月游離氨基酸含量的升高與同一時期片煙蛋白質含量下降存在對應關系，所以醇化過程中片煙氨基酸含量的升高，是蛋白質分解產生氨基酸導致的結果，而醇化12個月后片煙游離氨基酸含量下降說明片煙氨基酸在醇化過程中會繼續分解。

圖2 3個醇化庫片煙的蛋白質含量動態變化Fig. 2 The dynamic changes of the protein content in three tobacco aging storehouses

表1 3個醇化庫片煙蛋白質含量的變化幅度Table 1 The protein content variations range of tobacco strips in three aging storehouses %

圖3 3個醇化庫片煙游離氨基酸含量的動態變化Fig. 3 The dynamic changes of the free amino acid content in three tobacco aging storehouses

表2 3個醇化庫片煙游離氨基酸含量的變化幅度Table 2 The free amino acid content variations range of tobacco strips in three aging warehouses %

2.4 3個醇化庫片煙游離脯氨酸含量的動態變化

由圖4可知，在片煙醇化過程中，3個醇化庫不同產地片煙的脯氨酸含量由0.3%左右持續上升至0.5%以上。由表3可知，醇化6～12個月時，3個醇化庫不同產地片煙游離脯氨酸含量的變化幅度都存在顯著差異，并且均以興義庫片煙脯氨酸含量上升幅度最大，其余醇化時段不同產地片煙脯氨酸含量的變化幅度差異不顯著。醇化過程中片煙脯氨酸的含量與游離氨基酸含量呈現不同的變化規律，說明細胞壁蛋白降解產生的脯氨酸不能繼續氧化分解。

3 討 論

片煙中的含氮化合物主要包括烘烤后殘留的蛋白質、氨基酸和其他一些含氮雜環化合物。在自然醇化過程中，片煙含氮化合物一般經微生物作用和氧化作用被降解或揮發[19]。鞏效偉等[20]認為，片煙中的蛋白質是復雜的高分子化合物，性質比較穩 定，在醇化過程中，一般變化不大，而游離氨基酸是可溶性含氮化合物，在醇化過程中呈現下降的趨勢。但該文并未對醇化過程中蛋白質的含量進行追蹤監測。本試驗結果表明，片煙中的蛋白質含量在醇化過程中持續下降，游離氨基酸含量伴隨蛋白質的降解先升高后下降，而脯氨酸含量則呈現持續升高的變化規律。眾多研究表明[10]，在煙葉烘烤變黃期，鮮煙葉中的細胞質蛋白和膜蛋白已由蛋白酶催化分解為游離氨基酸，但受質膜和胞壁多糖的阻隔，存在于細胞壁中富含脯氨酸和羥脯氨酸的結構蛋白很難被胞內蛋白酶所降解，因而烤后煙葉始終含有10%左右的蛋白質。這些殘余蛋白質不去除，煙絲在燃燒時會產生臭味和刺激性，極大影響烤煙的感官評吸質量，這也是煙葉需要經過長時間自然醇化的主要原因。趙銘欽等[21]研究表明，烤后煙葉中仍存在微生物和酶活性，它們是煙葉醇化過程中促進蛋白分解的主要因素[22]。本試驗結果表明，煙葉醇化過程中蛋白質的降解還受到倉貯環境溫濕度的影響，環境溫濕度越高，微生物繁殖越快，蛋白質降解的幅度越大。片煙醇化過程中游離氨基酸和脯氨酸含量的升高與片煙蛋白質的降解密切相關，并且蛋白質含量下降伴隨著游離氨基酸和脯氨酸含量升高。這種蛋白質與氨基酸含量同步的變化足以說明片煙醇化過程中蛋白質發生了降解，并產生了許多游離氨基酸。前人對微生物氮代謝的研究結果表明[23]，微生物對氨基酸的轉化利用的方式有兩種：一種是通過脫氨基作用，將氨基酸分解轉變為氨氣和α-酮酸。其中的氨氣可以釋放到空氣中，而α-酮酸則留存于煙葉中，這可能是煙葉pH下降的原因之一。第二種方式是通過脫羧基作用，將氨基酸分解為CO2和胺，其中CO2可以釋放到空氣中，而胺則有可能與還原糖發生非酶棕色化反應生成美拉德產物。有研究表明[24]，甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸均可參與非酶棕色化反應，特別是含有羥基的氨基酸，在自由基的作用下易發生游離基反應形成美拉德反應的中間化合物席夫堿[25]，可見游離氨基酸的氧化分解與烤煙pH下降及煙葉致香物質形成存在一定相關性。

圖4 3個醇化庫片煙游離脯氨酸含量的動態變化Fig. 4 The dynamic changes of the free proline content in three tobacco aging storehouses

表3 不同醇化庫片煙游離脯氨酸含量的變化幅度Table 3 The free proline content variations range of tobacco strips in three aging storehouses %

植物細胞壁結構蛋白的特征之一是其氨基酸組成中富含脯氨酸和羥基脯氨酸，脯氨酸也是植物體內重要的滲透調節物質，它可以在干旱等逆境條件下起保護和穩定蛋白質結構的作用[26]。然而，值得關注的是游離氨基酸含量的變化與游離脯氨酸的變化趨勢完全不同，前者在醇化12～18個月升高后又下降，而后者則呈現持續升高的變化趨勢。醇化過程中游離脯氨酸含量持續升高的現象表明，微生物對游離脯氨酸的氧化分解和再利用能力很低，而對其他氨基酸的氧化分解和再利用能力較高。這可能與脯氨酸的側鏈基團與α-氨基形成了共價鍵，使之成為α-亞氨基酸，因而難于發生脫氨基反應有關[27]。有關醇化過程中哪些游離氨基酸組分易于被 微生物分解還需做進一步的研究。

4 結 論

本研究結果表明，醇化過程中，不同產地片煙的蛋白質含量均表現出持續下降的變化趨勢，而游離氨基酸含量同步升高；醇化12個月后，游離氨基酸含量開始迅速下降，表明醇化過程中蛋白質和氨基酸在不斷分解。蛋白質與氨基酸的下降幅度與倉貯環境溫度有關。興義倉庫環境溫度高于貴陽庫和貴定庫，因而其微生物和蛋白酶活性較高，片煙蛋白質和游離氨基酸的降解幅度也高于貴陽庫和貴定庫片煙。片煙醇化過程中，游離脯氨酸含量持續升高，并且與片煙游離氨基酸含量呈現不同的變化趨勢，表明醇化過程中胞壁蛋白質被分解，從而使片煙中脯氨酸的含量升高，并且脯氨酸不能進一步被氧化分解。

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Influence on Protein and Amino Acid Contents of Tobacco Strips by Different Storing Conditions in Guizhou

CHEN Yi1, YANG Jiamei2, WANG Yuping2, LU Zhiwei2, SU Yu1, YANG Hongqi1*

(1. Hunan Agricultural University, College of Biological Science and Technology, Changsha 410128, China; 2. China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd., Guiyang 550009, China)

The dynamic changes of proteins, free amino acids and proline in tobacco strips from six producing areas located in three aging storehouses of Xingyi, Guiyang and Guiding, which belong to China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd, were analyzed to study the patterns of changes of protein and free amino acid contents of tobacco strips under different storing conditions and from different producing areas. The results showed that: (1) During the aging process, the protein content of tobacco strips in different producing areas of three aging storehouses declined consistently. The content of free amino acids increased in the first 12 months of aging , then went down after 12 months of aging. (2) The free proline content increased consistently, and the changing pattern was different from that of free amino acids, suggesting that little of the free proline in tobacco strips was oxidized during the aging process. (3) During the 6th to 18th month of aging, there was significant change in the protein content of tobacco strips for strong flavor and middle flavor type, but not the tobacco strips of strong flavor type. During the aging process from 12 to 18 months, highly significant change in free amino acid content was observed in strong flavor type of tobacco strips. (4) Being affected by environmental temperature and humidity, the change in protein and free amino acid contents of tobacco strips in Xingyi storehouse was larger than that in Guiyang and Guiding, For tobacco strips stored in the same aging storehouse, significant difference of the extent to which protein and free amino acid decreased was observed between different tobacco producing areas. Thus, storing conditions had great compacts on protein and amino acid contents in tobacco strips during aging, and then affected the aging quality and profits of tobacco strips.

tobacco strips; aging; storing condition; protein; free amino acid

TS41+1

1007-5119（2016）06-0082-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.015

貴州中煙工業有限責任公司項目“煙葉醇化過程質量研究”（12121）

陳 頤（1987-），男，在讀博士研究生，主要從事煙草倉貯技術研究。E-mail：229781579@qq.com。*通信作者，E-mail：csyhq@sina.com

2016-07-14

2016-11-20