外周血循環腫瘤DNA基因突變檢測在非小細胞肺癌中的應用價值

徐敏　何婉　李嵐　朱美琴　陳亦欣　許瑞蓮

外周血循環腫瘤DNA基因突變檢測在非小細胞肺癌中的應用價值

徐敏何婉李嵐朱美琴陳亦欣許瑞蓮

518020 深圳，暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院腫瘤內科 深圳市腫瘤研究所

【摘要】目的探討高通量基因測序技術檢測外周血循環腫瘤DNA(ctDNA)基因突變在非小細胞肺癌(NSCLC)中的應用價值。方法用高通量測序技術同時檢測32例晚期NSCLC患者的外周血ctDNA和組織石蠟切片DNA(tDNA)的基因突變情況，并以tDNA為金標準，評價ctDNA診斷NSCLC基因突變的效能。結果32例NSCLC患者中，ctDNA檢出基因突變9種42例次，tDNA檢出基因突變11種40例次。以tDNA檢出的基因突變結果為金標準，外周血ctDNA診斷NSCLC基因突變的敏感度為75%～100%，特異度達95%～100%，與tDNA結果的總體符合率為91%～100%。結論高通量基因測序技術檢測NSCLC患者外周血ctDNA，可代替腫瘤組織切片了解基因突變情況。

【關鍵詞】非小細胞肺癌；高通量測序；循環腫瘤脫氧核糖核酸

全球肺癌的發病率和病死率高居各類惡性腫瘤之首，嚴重威脅人類健康。肺癌患者中約80%～85%為非小細胞肺癌(NSCLC)，約50%的患者確診時已為晚期，預后差。準確獲知腫瘤的生物學信息，從而在基因分型指導下進行個體化治療對于指導臨床用藥至關重要。目前臨床常規采用組織DNA(tDNA)檢測基因分型，但此檢測有創且對標本獲取有較高的要求。循環腫瘤DNA(ctDNA)是特指腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統的小片段DNA，ctDNA來自腫瘤細胞的體細胞突變，可以出現與原發腫瘤DNA相同的特征或基因改變[1]。外周血ctDNA可以被定性、定量和追蹤，將有可能為臨床腫瘤的早期診斷、預后判定及跟蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無創或微創的分子生物學檢測手段[2-5]。但外周血ctDNA是否可以替代tDNA成為常規基因檢測手段應用于臨床尚未可知。為此，筆者通過高通量基因測序技術檢測32例晚期NSCLC患者的外周血ctDNA中的基因突變情況，并以組織tDNA作金標準，評價其診斷效能，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2014年10月至2015年12月我院收治的晚期(ⅢB期以上)無法手術的NSCLC患者32例，所有患者均有原發組織的石蠟切片及血液樣本。其中男18例、女14例，年齡37～72歲、中位年齡55歲，腺癌23例、鱗癌9例。血漿樣本DNA提取后與組織切片送南京世和基因生物技術有限公司行基因檢測。

二、方法

1. 標本采集、血漿分離

入院次日清晨采集患者肘靜脈血5 ml，立即在室溫下以2 000×g離心10 min，分離血漿和血細胞，小心收集上層血漿，避免觸及白細胞或血小板及紅細胞下層。

2. 血漿樣本DNA提取

采用Qiagen DNA提取試劑盒，取血漿樣本，室溫下3 500×g離心15 min，棄上清，沉淀中加入1 ml試劑1裂解緩沖液；勻漿液37℃水浴靜置60 min后，加入10 μl試劑2， 50℃水浴消化3 h；按步驟分次吸取水相，加入1 ml試劑3～5，輕柔顛倒混勻約50次，室溫5 000×g 離心15 min；棄上清，向沉淀中加入1 ml 70%乙醇，重懸沉淀后，室溫5 000×g 離心10 min；棄上清，吸干乙醇并晾干，加入試劑6溶解DNA，37 ℃溶解12～14 h，直至DNA完全溶解；測量DNA濃度后備用。

3. ctDNA分離

采用薄膜柱吸附試劑盒從血漿中分離ctDNA：DNA定量后按照試劑盒說明取20 ng以上進行DNA文庫構建，具體步驟包括ctDNA大片段分離、ctDNA小片段回收、DNA末端修復和A接頭連接、將DNA兩端加上Illumina測序試劑盒的專用接頭、根據所需DNA片段大小進行磁珠篩選、使用PCR法擴增文庫用于后續的探針雜交捕獲和測序實驗。

4. 生物素標記探針捕獲基因

使用Geneseeq雜交富集探針對已建好的DNA文庫進行目標基因靶標富集及擴增，包括：DNA捕獲探針與文庫雜交；捕獲文庫產物的清洗和回收；捕獲文庫與鏈霉親和素磁珠結合；磁珠捕獲文庫清洗，去除非特異結合的文庫。

5. 高通量測序

捕獲后的文庫按照Illumina試劑盒說明書的操作步驟，在Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺上樣，DNA在試劑盒Flow cell上形成DNA簇，測序平臺通過單個堿基合成后暫停、熒光檢測、合成恢復的循環完成DNA高通量測序。

6. 數據分析

將高通量測序結果與中國人種hg19基因組數據對比，完成基因Mapping工作；同步分析多種基因突變類型；分析生成腫瘤特有突變和種系突變。

7. tDNA提取與檢測

腫瘤組織采用Qiagen DNA提取試劑盒提取后應用超聲破碎成300～350 bp，采用96 rxn xGen?Exome Research Panel v1.0試劑盒富集后建立高通量測序文庫，通過Illumina Hiseq 4000高通量測序平臺進行600倍深度測序，下機數據通過生物信息學平臺整理成樣本突變信息。

三、統計學處理

以tDNA結果為金標準，分析各病例外周血ctDNA對NSCLC基因突變的診斷效能，計算外周血ctDNA診斷NSCLC基因突變的敏感度、特異度及總體符合率。

結果

一、總體結果

32例NSCLC患者中，ctDNA檢出基因突變9種42例次，tDNA檢出基因突變11種40例次。

二、外周血ctDNA基因對NSCLC基因突變的診斷效能評價

以組織石蠟切片tDNA檢出的基因突變結果為金標準，外周血ctDNA對NSCLC基因突變的敏感度為75%～100%，特異度達95%～100%，與tDNA結果的總體符合率為91%～100%，見表1。其中，有2例患者tDNA中未檢出突變，但相應外周血ctDNA中分別檢測出EGFR exon 19缺失和ERBB2突變。

討論

目前臨床上用于NSCLC患者基因突變檢測的主要是經纖維支氣管鏡或肺穿刺活組織檢查獲取的tDNA，但是NSCLC在確診時超過70%的患者已為ⅢB 期、Ⅳ期，大部分不能手術，難以獲取腫瘤組織，而且腫瘤的生物學特性在經過一系列治療后可能已經發生改變，故每次治療前實時獲得腫瘤信息才能較準確地反映腫瘤細胞特性，疾病進展后再次獲取組織標本可謂難上加難。因此，僅僅通過tDNA進行NSCLC基因檢測為臨床治療、研究帶來很多不便，人們希望通過一些無創手段來獲取患者的基因信息。

表1

外周血ctDNA對NSCLC基因突變的診斷效能評價

注：EGFR為表皮生長因子受體，exon為外顯子，TP53為腫瘤抑制蛋白P53，KRAS為鼠肉瘤病毒原癌同源體，ERBB2為表皮生長因子受體2，PIK3CA為磷脂酰肌醇-3-激酶，FGFR4為成纖維生長因子受體4，DPYD為二氫嘧啶脫氫酶編碼基因，BRAF為鼠肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1

血液ctDNA的釋放被認為與腫瘤細胞的自行分泌或凋亡、壞死有關[6]。同時由于檢測的無創性，可以作為“液體活檢”，成為良好的預后和預測分子指標。早在1948年，法國學者Mandel等便發現了人類血液中存在循環DNA。而直到30年后，Leon等首次報道腫瘤患者ctDNA水平高于正常人，且與患者的預后及療效有關。隨后人們發現血清ctDNA水平升高與腫瘤轉移、臨床分期和患者生存有關，根據血清ctDNA水平可判斷患者的預后[7-8]。

2013年Dawson等[9]研究了30例接受了系統治療的轉移性乳腺癌女性患者，連續采集血漿標本，采用定向或全基因組測序分析識別體內基因改變，對ctDNA進行個體化定量分析。與同期檢測的CA15-3及CTC相比，ctDNA水平呈現更廣的動態范圍及與腫瘤負荷變化更強的相關性。在檢測中，ctDNA為19例中的10例女性提供較早的治療反應檢測信息。他們認為ctDNA是一種具有提示性、遺傳特性和高敏感度的轉移性乳腺癌生物標記。

然而，由于循環中存在的ctDNA極其微量，對其替代tDNA成為腫瘤分子檢測的“金標準”造成障礙。2014年Newman等[10]將高通量測序技術應用于NSCLC患者血漿ctDNA檢測，發現對Ⅱ～Ⅳ期的NSCLC患者檢測敏感度達100%，Ⅰ期的NSCLC呈中敏感度(50%)；對各期肺癌的特異度均為96%。研究還表明，當ctDNA比例低至0.019%的時候仍能夠被檢測到。有學者分別對10例樣本進行活組織檢查和癌癥個體化深度測序(CAPP-Seq)檢測EGFR和KRAS，結果顯示CAPP-Seq并不比金標準腫瘤活組織檢查的診斷效能差，其也能準確測定肺癌的基因型。高通量測序技術能一次對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行序列測定，可以檢測到低于0.5%的基因突變，是對傳統測序革命性的改變，且其所需的DNA樣本量較少，適用于ctDNA這種微量DNA的檢測[11]。

本研究通過高通量測序技術，分離外周血ctDNA并進行多基因聯合檢測。結果顯示，以組織石蠟切片檢測出的tDNA作金標準，血漿ctDNA的敏感度為75%～100%，特異度為95%～100%，與tDNA結果的總體符合率為91%～100%。其中，有2例患者組織切片中未檢出突變，但相應的血液中卻分別檢測出EGFR exon 19缺失和ERBB2突變，提示治療過程中腫瘤的基因突變可能發生了變化，組織切片無法反映治療前的實際基因突變情況。或者由于腫瘤具有異質性，組織標本因為取材受限無法反映真實的基因表達情況。

外周血ctDNA是一種特征性的腫瘤生物標記物，可實時反映腫瘤發生、發展或治療過程中的信息，且與傳統的組織活檢標本相比具有取材方便、無創、患者依從性好等優點。通過本研究，我們發現用高通量測序技術能夠檢出極微量的外周血ctDNA基因突變，且與tDNA有較高的符合率。因而通過外周血檢測NSCLC基因突變代替腫瘤組織是切實可行的，有望替代受到標本采集以及無法連續監測和隨訪追蹤等諸多限制的組織切片。希望將來經過更多臨床驗證后，高通量測序技術能夠得到臨床推廣，并將肺癌分子診斷和個體化治療提高到一個新的水平。

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The value of detection of gene mutations in peripheral circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer

XuMin,HeWan,LiLan,ZhuMeiqin,ChenYixin,XuRuilian.

DepartmentofMedicalOncology,ShenzhenPeople’sHospital,theSecondClinicalMedicalCollegeofJi’nanUniversity,ShenzhenCancerInstitute,Shenzhen518020,China

【Abstract】ObjectivesTo investigate the value of gene mutations in peripheral circulating tumor DNA(ctDNA)in non-small cell lung cancer(NSCLC)by next-generation sequencing. MethodsThe gene mutations in peripheral ctDNA and tDNA of tissued paraffin sections in 32 advanced patients with NSCLC were simultaneously detected by next-generation sequencing, and regarded the tissue tumor DNA as the correct standard to evaluate the efficiency of ctDNA diagnosing the gene mutations in NSCLC. ResultsAmong 32 patients with NSCLC, 42 samples of gene mutations in 9 types were detected in terms of ctDNA and 40 samples of gene mutations in 11 types were detected in tDNA. The result of tDNA gene mutations was regarded as the correct standard. Sensitivity of detection of gene mutations in peripheral circulating tumor DNA was 75%～100%, and specificity was 95%～100%. The concordance rate between result of tDNA and ctDNA was 91%～100%. ConclusionTo test mutations in NSCLC patients, detection of ctDNA is possible to replace tumor tissue paraffin sections by NGS.

【Key words】Non-small cell lung cancer; Next-generation sequencing; Circulating tumor DNA

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.008

基金項目：深圳市科技計劃項目(JCYJ20150403101146278)

通訊作者，許瑞蓮，E-mail：xuruilian@126.com

Corresponding author, Xu Ruilian, E-mail: xuruilian@126.com

(收稿日期：2016-02-24)(本文編輯：林燕薇)

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