冷蒿抗氧化防御系統(tǒng)對機械損傷的響應

賈　麗，劉盟盟，張洪芹，臧曉琳，寶音陶格濤，高　巖，張汝民（.浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地,浙江 臨安3300；.內(nèi)蒙古大學 生命科學學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特000）

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冷蒿抗氧化防御系統(tǒng)對機械損傷的響應

賈麗1，劉盟盟1，張洪芹1，臧曉琳1，寶音陶格濤2，高巖1，張汝民1
（1.浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地,浙江 臨安311300；2.內(nèi)蒙古大學 生命科學學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010021）

摘要：放牧對草地植物的直接影響包括動物的采食和踐踏。為了探討冷蒿Artemisia frigida的耐牧性，采用人工機械損傷（輕度、中度和重度）的方式處理盆栽冷蒿地上枝葉，分別測定冷蒿葉片和根系活性氧（ROS），丙二醛（MDA），抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）質量摩爾濃度，同時測定了抗氧化防御酶和抗壞血酸（AsA）-谷胱甘肽（GSH）循環(huán)酶活性的變化。結果表明：隨著機械損傷強度的增加，冷蒿葉片超氧陰離子（O2·-）和過氧化氫（H2O2）質量摩爾濃度升高，膜質過氧化增強；超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性隨機械損傷強度的增加而升高。在輕度和中度處理下，冷蒿葉片中抗壞血酸過氧化物酶（APX），脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR），單脫徑抗壞血酸還原并（MDHAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性增強，抗氧化劑（AsA和GSH）的還原力（ρAsA/ρDHA值和ρGSH/ρGSSG值）處于穩(wěn)定平衡狀態(tài)；重度機械損傷下AsA-GSH循環(huán)效率顯著降低（P≤0.05）。冷蒿根系抗氧化防御系統(tǒng)對機械損傷也表現(xiàn)出明顯的應激反應能力。綜上所述，機械損傷使冷蒿體內(nèi)ROS質量摩爾濃度升高，且冷蒿能夠在不同程度的機械損傷下快速、有效地啟動體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，清除體內(nèi)過量的ROS，維持一定的AsA-GSH循環(huán)效率，表現(xiàn)出較強的耐損傷能力。圖4表1參42

關鍵詞：植物學；冷蒿；抗氧化酶；抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)；機械損傷；活性氧類

浙江農(nóng)林大學學報，2016，33（3）：462-470

Journal of ZheJiang A&F University

放牧是天然草地最主要的利用與管理方式，影響草地生態(tài)系統(tǒng)植被結構和功能［1］，并可能引起草地養(yǎng)分狀況的變化，導致草地荒漠化和貧瘠化。適度放牧能夠增加草地生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和生產(chǎn)力［2］，過度放牧是威脅草地生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性和生產(chǎn)力的主導因素，特別是在干旱和半干旱地區(qū)［3-4］。放牧對草地植物最大的影響在于牲畜采食和踐踏造成的機械損傷。諸多研究表明：機械損傷可導致植物體內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species, ROS）水平顯著升高，抗氧化系統(tǒng)由于ROS的影響表現(xiàn)出不同的響應機制［5-6］。ROS是植物正常生長過程進行有氧代謝的副產(chǎn)物，受到生物脅迫或非生物脅迫時，打破植物體內(nèi)ROS生成與清除之間的動態(tài)平衡引起ROS積累，導致植物受到傷害［7-8］。過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）和超氧陰離子自由基（superoxide radical, O2·-）是最重要的ROS，其中O2·-是形成其他ROS的前體，作為前體比其本身對植物的傷害更具有毒性［9］。ROS的積累可加速細胞膜質過氧化，使細胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平升高，抑制抗氧化酶活性和抗氧化劑的水平，破壞生物膜的結構和功能［10］。同時，ROS作為信號分子，介導植物體內(nèi)抗氧化酶基因的表達，增強超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase, POD）活性消除ROS的影響［11］。除此之外，適度的脅迫環(huán)境可以啟動植物體內(nèi)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle, AsA-GSH cycle）。該循環(huán)中的抗壞血酸（ascorbate, AsA）和谷胱甘肽（glutathione, GSH）相耦聯(lián)起作用，有效清除由于逆境脅迫而過多產(chǎn)生的ROS［12-14］。以羊草Leymus chinensis和大針茅Stipa grandis為主的內(nèi)蒙古草原典型草原，在連續(xù)多年過度放牧壓力下均可退化演替為以冷蒿Artemisia frigida為主的單一優(yōu)勢種群［15-17］。近年來，對冷蒿的研究集中在冷蒿揮發(fā)性有機化合物［18］、群落結構特征［19-20］以及對土壤低磷環(huán)境適應性［21］等方面，關于冷蒿的耐牧抗損傷機制鮮見報道。本研究從生理生化的角度出發(fā)，擬解決以下問題：①揭示機械損傷后冷蒿體內(nèi)ROS產(chǎn)生狀況；②闡明機械損傷對冷蒿體內(nèi)抗氧化酶活性和AsA-GSH循環(huán)的影響；③探討冷蒿葉片和根系對機械損傷響應的差異及相關性。上述研究旨在揭示冷蒿在不同牧壓下的耐損傷機制，探討冷蒿在不同機械損傷下的適應對策；同時為退化草地恢復、草地生物多樣性保護以及可持續(xù)發(fā)展利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1采樣地概況

供試材料冷蒿采自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林浩特毛登牧場內(nèi)蒙古大學草地生態(tài)學研究基地，地理位置為44°10′2″N，116°28′56″E，海拔1 160 m。全年平均氣溫為-0.4℃，最冷月（1月）平均溫度-22.3℃，最熱月（7月）平均氣溫18.8℃，≥0℃年積溫為2 410.0℃，≥10℃積溫為1 597.9℃，無霜期91 d，植物生長期為150 d左右。年降水量為365.6 mm，降水多集中在6-8月，占年降水量的80%左右。本研究區(qū)域主要草原植物為羊草，糙隱子草Cleistogenes squarrosa，克氏針茅Stipa krylovii，大針茅，防風Saposhnikovia divaricata，冷蒿，瓣蕊唐松草Thalictrum petaloideum和阿爾泰狗哇花Heteropappus altaicus等。土壤為栗鈣土。

1.2試驗材料處理

2014年6月中旬在采樣地選取自然條件下生長健壯的返青期冷蒿植株，栽植于盛有采樣地原土的花盆中（直徑18 cm，高20 cm），1叢·盆-1。盆栽苗置于浙江農(nóng)林大學實驗室溫室中，自然光照，相對濕度為30%±2%，白天溫度為（25±2）℃，夜晚溫度為（20±2）℃。緩苗生長20 d后進行實驗處理。選取株高一致、生長良好、無病蟲害冷蒿12盆，隨機分為4組，為模擬動物采食對冷蒿的傷害，試驗以剪刀損傷冷蒿地上枝葉的方式處理冷蒿植株，損傷冷蒿地上枝葉1/4為輕度、損傷1/3為中度、損傷1/2為重度、不作處理為對照。3盆·處理-1，獨立重復1個·盆-1。在處理后6 h，對冷蒿葉片和根系分別取樣，地上部分剩余枝葉全部剪碎混勻后取樣，根系用清水洗去附著土壤，再用蒸餾水沖洗擦干后將整個根系剪碎混勻后取樣。樣品用液氮速凍后放置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存。

1.3方法

1.3.1ROS和MDA質量摩爾濃度測定O2·-測定參照SHAH等［14］的氮藍四唑法；過氧化氫測定參照RAI等［22］的方法；MDA測定參照HODGES等［23］的方法。

1.3.2抗氧化酶活性測定酶液提取方法：取0.2 g冷凍樣品液氮研磨，加5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol·L-1，pH 7.8）勻漿，10 000 g離心10 min（4℃）。上清液用于SOD，POD和CAT活性的測定。SOD活性測定參照GIANNOPOLITIS等［24］的方法；CAT和POD活性測定參照KUMARI等［25］的方法。

1.3.3AsA和GSH質量摩爾濃度測定AsA和GSH測定參照RAI等［26］的方法。

1.3.4AsA-GSH循環(huán)相關酶活性測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）活性測定參照NAKANO等［27］的方法；谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase, GR）活性測定參照SCHAEDLE等［28］的方法；單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascobate reductase, MDHAR）活性測定參照HOSSAIN等［29］的方法；脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase, DHAR）活性測定參照DOULIS等［30］的方法。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有的數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值±標準誤差，利用Origin 8軟件（美國OriginLab公司）進行統(tǒng)計分析和作圖。統(tǒng)計方法采用One-Way ANOVA進行檢驗，并進行Tukey多重比較（P＜0.05）。采用Two-Way ANOVA分析冷蒿組織×機械損傷處理之間相互作用的影響。

2　結果與分析

2.1機械損傷對冷蒿O2˙-，過氧化氫和MDA質量摩爾濃度影響

表1 機械損傷對冷蒿O2˙-，過氧化氫和MDA質量摩爾濃度的影響Table 1 Effect of mechanical damage on O·2-, H2O2and MDA content in Artemisia frigida

隨著損傷程度的增加，冷蒿葉片中O2·-水平逐漸升高，重度損傷下達到對照2.1倍（表1）；在中度和重度損傷下，冷蒿根系O2·-水平分別為對照的2.4倍和2.8倍。冷蒿過氧化氫水平隨著處理強度的增強而增加，在輕度、中度和重度處理下，冷蒿葉片過氧化氫水平與對照相比顯著升高21.0%，27.8%和41.7%；冷蒿根系過氧化氫水平在中度和重度處理下分別比對照顯著增加27.0%和56.0%。在輕度、中度和重度處理下，冷蒿葉片的MDA摩爾質量濃度分別比對照顯著增加28.7%，82.8%和107.7%，冷蒿根系MDA摩爾質量濃度分別比對照增加30.5%，48.1%和50.1%。從各處理間差異顯著性分析結果來看，輕度處理后，冷蒿葉片H2O2和MDA摩爾質量濃度顯著高于對照，說明冷蒿在機械損傷影響下遭受了ROS的傷害；冷蒿葉片的O2·-水平與對照相比無顯著差異，可能是由于O2·-非?；顫?，作為其他ROS的前體被轉化。雖然冷蒿葉片和根系的ROS和MDA水平都隨損傷程度的增加而升高，但冷蒿葉片中ROS 和MDA摩爾質量濃度在中度和重度損傷之間的差異不顯著，說明冷蒿的ROS產(chǎn)生被抑制。冷蒿根系的ROS和MDA摩爾質量濃度顯著低于葉片。這可能是由于機械損傷直接作用于冷蒿葉片，對根系的影響較小。

2.2機械損傷對冷蒿抗氧化酶活性的影響

冷蒿的抗氧化酶活性隨處理強度的增加而增強（圖1）。在輕度、中度和重度處理下，冷蒿葉片SOD活性與對照相比差異顯著，分別為對照的1.4，2.3和3.4倍；輕度處理下，冷蒿根系的SOD活性與對照相比無顯著差異，中度處理下根系SOD活性比對照顯著增加80.1%，但與輕度相比差異不顯著，重度處理下根系SOD活性比對照顯著增加140.0%，但與中度相比差異不顯著（圖1A）；且在各個處理下，冷蒿葉片的SOD活性顯著高于根系，這可能由于機械損傷直接作用于冷蒿葉片，對葉片和根系的抗氧化系統(tǒng)影響有所差異造成的。

冷蒿的CAT活性變化總趨勢是隨處理強度的增大逐漸增強（圖1B）。但冷蒿葉片的CAT活性在輕度處理與對照之間差異不顯著，中度處理與輕度處理之間差異不顯著，重度處理與中度處理之間差異不顯著；冷蒿根系的CAT活性3個處理之間的差異均不顯著；葉片的CAT活性顯著高于根系，說明冷蒿葉片和根系的抗氧化系統(tǒng)對機械損傷的響應是不同的。

在輕度、中度和重度處理下，冷蒿葉片的POD活性分別比對照增加30.6%，87.3%和132.8%；冷蒿根系POD活性分別比對照增加59.7%，87.8%和116.7%（圖1C）；冷蒿葉片和根系在各個處理間差異顯著，增幅明顯，說明POD因機械損傷的刺激活性增強，在消除過氧化氫中起重要的作用。

圖1 機械損傷對冷蒿抗氧化酶活性的影響Figure 1 Effect of mechanical damage on activity of antioxidant enzymes in Artemisia frigida

2.3機械損傷對冷蒿AsA水平的影響

冷蒿葉片和根系的AsA摩爾質量濃度隨損傷程度的增加逐漸降低，而脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）水平隨機械損傷程度的增加逐漸增加，AsA/DHA持續(xù)下降（圖2）。在重度處理下，DHA摩爾質量濃度高于AsA，ρAsA/ρDHA比對照降低64.3%。在不同損傷程度下，葉片的DHA摩爾質量濃度顯著高于根系。

2.4機械損傷對冷蒿GSH水平的影響

冷蒿葉片和根系的總谷胱甘肽水平隨損傷程度的增加而緩慢增加（圖3）。輕度處理下，冷蒿葉片GSH摩爾質量濃度與對照相比差異不顯著，中度處理下，葉片GSH摩爾質量濃度與對照相比顯著下降23.3%；與葉片不同，冷蒿根系GSH水平在不同處理間的差異不顯著。除對照外，在輕度、中度和重度損傷強度下，冷蒿葉片和根系之間的GSH水平差異不顯著。冷蒿葉片的還原型谷胱甘肽（GSSG）摩爾質量濃度隨機械損傷強度的增加而顯著增加，在輕度、中度和重度處理下分別為對照的2.2，3.6和3.7倍，差異顯著；冷蒿根系GSSG摩爾質量濃度重度處理下比對照顯著增加46.6%。隨機械損傷強度的增加，在中度和重度處理下，冷蒿葉片與根系之間的GSSG摩爾質量濃度差異極顯著。冷蒿葉片的ρGSH/ ρGSSG隨機械損傷強度的增加持續(xù)下降，在輕度、中度和重度處理下分別比對照降低56.8%，80.2%和82.2%，與輕度相比，中度和重度處理下的葉片ρGSH/ρGSSG增幅明顯減緩；冷蒿根系的ρGSH/ρGSSG隨機械損傷強度的增加小幅增加后降低，重度處理下根系ρGSH/ρGSSG比對照減少21.6%。根系的ρGSH/ρGSSG在不同機械損傷強度之間差異不顯著。

圖2 機械損傷對冷蒿抗壞血酸水平的影響Figure 2　 Effect of mechanical damage on AsA content in Artemisia frigida

圖3 機械損傷對冷蒿谷胱甘肽水平的影響Figure 3　 Effect of mechanical damage on GSH content in Artemisia frigida

2.5機械損傷對冷蒿AsA-GSH循環(huán)相關酶活性的影響

隨著損傷處理程度增加，冷蒿葉片和根系的APX活性逐漸增加（圖4A），在重度處理下與對照相比的增幅分別達到94.0%和132.8%；冷蒿葉片的APX活性顯著高于根系。

圖4 機械損傷對冷蒿AsA-GSH循環(huán)相關酶活性的影響Figure 4 Effect of mechanical damage on enzymes activity of AsA-GSH cycle in Artemisia frigida

冷蒿根系的GR活性隨損傷程度的增加而增強（圖4B）；在中度處理下，冷蒿葉片的GR活性高于其他處理，與對照相比的增幅為97.4%。在輕度和中度處理下，葉片與根系之間的GR活性差異極顯著；重度處理下，冷蒿葉片和根系之間的GR活性無顯著差異。

在中度處理下，冷蒿葉片和根系DHAR活性高于其他處理且差異極顯著，分別為對照的1.3倍和1.9倍（圖4C）；在重度處理下，冷蒿葉片和根系的DHAR活性與對照相比增幅分別為88.5%和106.7%，且葉片與根系之間差異顯著。

隨損傷程度的增加，冷蒿葉片和根系的MDHAR活性逐漸升高（圖4D）。在重度處理下與對照相比的增幅分別為88.5%和106.7%，冷蒿葉片的MDHAR活性顯著高于根系。

3　討論與結論

諸多研究表明：機械損傷可導致植物體內(nèi)ROS摩爾質量濃度顯著升高，抗氧化系統(tǒng)由于ROS的影響表現(xiàn)出不同的響應機制［5-6］。脅迫往往使ROS和MDA摩爾質量濃度升高［31］，抗氧化酶活性增強［32］。冷蒿試驗結果表明：隨機械損傷強度的增加，冷蒿體內(nèi)O2·-和MDA摩爾質量濃度升高，冷蒿SOD酶活性逐漸增強，由于SOD的作用，O2·-增幅明顯減緩；冷蒿體內(nèi)過氧化氫水平隨機械損傷強度的增加逐漸升高，過氧化氫的積累刺激冷蒿體內(nèi)CAT和POD應激反應使活性增強，由于酶系統(tǒng)的作用，過氧化氫的增幅逐漸減緩?？傊?，冷蒿在抗氧化酶防御系統(tǒng)作用下，有效消除因機械損傷過量積累的ROS，使重度處理下的ROS水平與中度相比無顯著差異。由于機械損傷處理直接作用于冷蒿的地上部分，對葉片的抗氧化系統(tǒng)影響更大，因此冷蒿葉片的ROS水平和酶活性明顯高于根系。

維持細胞內(nèi)較高的ρGSH/ρGSSG和ρAsA/ρDHA比值有利于維護植物體內(nèi)的氧化還原環(huán)境，減少脅迫所造成的ROS傷害［33］。MAHALINGAM等［34］認為AsA再生系統(tǒng)受到脅迫產(chǎn)生ROS的不利影響，導致AsA摩爾質量濃度下降。本試驗表明：隨著機械損傷強度的增加，冷蒿葉片中AsA和GSH摩爾質量濃度下降，DHA和GSSG摩爾質量濃度上升，與羅婭等［35］研究結果一致；在輕度和中度處理下，冷蒿體內(nèi)ρAsA/ρDHA與對照相比增幅不顯著，可能是因為冷蒿體內(nèi)的AsA再生酶（MDHAR和DHAR）活性增加，維持了AsA的摩爾質量濃度；與李曉云等［36］的研究結果相吻合。AsA-GSH循環(huán)清除過氧化氫的能力依賴于DHAR 和GR對還原型AsA和GSH庫的維護作用［37-38］。重度處理下，冷蒿葉片AsA和GSH因清除過氧化氫而被消耗［39］；且冷蒿葉片GR和DHAR活性與中度處理相比有所下降，不能提供充足GSH來減少DHA，使ρAsA/ρDHA降低。單長卷等［40］研究認為，嚴重脅迫下，冰草葉片內(nèi)AsA-GSH循環(huán)相關酶活性呈降低趨勢。冷蒿根系ρAsA/ρDHA和ρGSH/ρGSSG在重度處理下顯著高于葉片，可能是由于ROS為了傳遞應激反應的信號而進行的精密調(diào)制并引導冷蒿根系AsA-GSH系統(tǒng)新平衡［41-42］，因此在損傷脅迫下冷蒿根系GSH庫在避免機械損傷中發(fā)揮更重要的作用。總之，冷蒿體內(nèi)的AsA-GSH循環(huán)通過增強相關酶活性維持抗氧化劑的再生，在輕度和中度損傷脅迫下有效消除過氧化氫的同時保證細胞內(nèi)氧化還原的平衡，重度脅迫下由于根系GSH庫的維護作用，引導了冷蒿體內(nèi)AsA-GSH系統(tǒng)新平衡。

綜上所述，隨著機械損傷強度的增加，冷蒿葉片中的O2·-和過氧化氫摩爾質量濃度升高，MDA摩爾質量濃度升高；因機械損傷的刺激，冷蒿葉片內(nèi)的抗氧化防御酶活性逐漸增強；AsA-GSH循環(huán)相關酶活性隨機械損傷強度的增加而增強，通過維持非酶抗氧化劑AsA和GSH的再生，保障冷蒿體內(nèi)過氧化氫產(chǎn)生與消除之間的相對平衡；冷蒿根系的抗氧化各項指標在機械損傷影響下的變化趨勢與葉片相似，但是變化幅度低于葉片。說明冷蒿可以在酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)的共同作用下，使O2·-和過氧化氫摩爾質量濃度的增幅明顯減緩，有效消除機械損傷產(chǎn)生的ROS傷害，具有較強的抗氧化能力。

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Antioxidant defense system responses of Artemisia frigida to mechanical damage

JIA Li1, LIU Mengmeng1, ZHANG Hongqin1, ZANG Xiaolin1, Baoyintaogetao2, GAO Yan1, ZHANG Rumin1
（1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China；2. College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, Inner Mongolia, China）

Abstract:To understand the effects of mechanical damage on the antioxidant defense system of Artemisia frigida, we analyzed the changes of reactive oxygen species（ROS）level, antioxidant enzyme activities, and ascorbate-glutathione（AsA-GSH）cycle efficiency under light, moderate, and heavy mechanical damage. Results showed that with a mechanical damage treatment, the O·2-production rate, H2O2, and malondialdehyde（MDA）contentincreased significantly（P≤0.05）in leaves and roots of A. frigida and was significantly lower（P≤0.05）in roots than in leaves. Also, activities of superoxide dismutase（SOD）, catalase（CAT）, and peroxidase （POD）were significantly higher（P≤0.05）with the mechanical damage treatment compared to the control. The activities of ascorbate peroxidase（APX）, monodehydroascorbate reductase（MDHAR）, dehydroascorbate reductase（DHAR）, and glutathione reductase（GR）, as well as regenerating rates of AsA and GSH, and redox statuses（ratios of AsA/DHA and GSH/GSSG）with light and moderate mechanical damage were not signifi-cantly different（P≥0.05）from the control；whereas compared to the control efficiency of the AsA-GSH cycle was significantly lower（P≤0.05）with heavy mechanical damage. The antioxidant defense system in roots of A. frigida also showed obvious stress in response to mechanical damage capacities. It was concluded that with light and moderate mechanical damage A. frigida had an efficient metabolism in the ascorbate-glutathione cycle, which rapidly scavenged H2O2to alleviate the oxidative damage and, therefore, had a stronger tolerance to mechanical stress damage.［Ch, 4 fig. 1 tab. 42 ref.］

Key Words:botany；Artemisia frigida；antioxidant enzyme；AsA-GSH cycle；mechanical damage；ROS

中圖分類號：S812.6；Q946

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）03-0462-09

doi：10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.013

收稿日期：2015-03-20；修回日期：2015-04-09

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31270756, 31470704）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2014CB138805）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAC07B01）

作者簡介：賈麗，從事植物生理生態(tài)研究。E-mail：lnbx1986@163.com。通信作者：張汝民，教授，博士，從事植物生理生態(tài)研究。E-mail：ruminzhang@sohu.com