食管癌放化療中循環腫瘤細胞的變化及其臨床意義

許剛　王燕　王承偉　吳朝陽

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食管癌放化療中循環腫瘤細胞的變化及其臨床意義

許剛王燕王承偉吳朝陽

摘要目的：探討局部晚期食管癌放化療中循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）的動態變化，以及CTCs與食管癌臨床特征和預后的相關性分析。方法：利用免疫磁珠富集聯合免疫熒光檢測2011年5月至2013年5月江蘇大學附屬人民醫院48例局部晚期食管癌患者放化療前后的循環血腫瘤細胞，對比分析放化療前后的動態變化，并分析循環腫瘤細胞與患者臨床特征及2年生存率的關系。結果：循環血腫瘤細胞與腫瘤侵犯程度、淋巴結轉移狀態及臨床分期均顯著相關（P<0.05），治療前循環血腫瘤細胞陽性率為52.1%（25/48），治療結束后為20.8%（10/48），差異具有統計學意義（P<0.01）。放化療前后的循環腫瘤細胞均與患者的2年生存率密切相關（P<0.05），Cox回歸分析提示臨床分期及放化療后循環血腫瘤細胞水平是食管癌患者的獨立預后因子。結論：循環腫瘤細胞可以反映局部晚期食管癌患者的疾病進展程度，并且可以作為判斷預后的指標。

關鍵詞食管鱗癌同步放化療循環腫瘤細胞預后分析

作者單位：江蘇大學附屬人民醫院腫瘤放療科（江蘇省鎮江市212002）

循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）被認為是腫瘤轉移的重要因素之一，在許多惡性腫瘤的診斷以及預后中具有重要價值［1-2］。有報道顯示食管鱗癌患者放療后CTCs陽性率較治療前下降并與預后密切相關［3］，但食管癌的非手術治療方式主要為同步放化療，有關同步放化療前后的CTCs的動態變化仍鮮見報道。本研究采用免疫磁珠負性富集和免疫熒光染色技術檢測食管鱗癌患者外周血CTCs，測定其放化療過程中的動態變化，對CTCs與食管鱗癌患者的預后進行相關性分析。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年5月至2013年5月江蘇大學附屬人民醫院48例初治食管鱗癌患者的臨床資料，其中男性31例，女性17例，年齡46～72歲，中位年齡58歲。入組標準：局部晚期（除T1N0M0和M1b，AJCC2009）；ECOG評分0～2分；預期生存期>3個月；明確的食管鱗癌病理診斷；無嚴重內科疾病。排除標準：食管穿孔；惡病質；遠處轉移；病理為非鱗癌。

1.2 方法

1.2.1 治療方案放療設備為西門子醫用直線加速器，均采用三維適形放療技術，處方劑量為1.8～2 Gy/次，5次/周，總劑量61.2～62 Gy。同步化療方案采用順鉑聯合氟尿嘧啶，具體為氟尿嘧啶1 800 mg/m2靜脈泵入維持72 h，順鉑25 mg/m2（第1～3天），每4周1個療程，共化療4周期。

1.2.2 CTC的檢測于放化療前1天、放化療開始后2、4、6周以及放化療結束后1天分別采集入組食管鱗癌患者清晨空腹外周靜脈血10 mL。用紅細胞裂解液去除紅細胞，用Militenyi免疫磁珠去除白細胞，富集上皮來源的稀有細胞，利用免疫熒光染色技術鑒定CTCs。CTCs判定標準：1）細胞體積：大于周圍白細胞；2）細胞核：DAPI染色明亮、核較大或小，核漿比例較大，核分裂增多及病理性核分裂，多核巨細胞；3）標記物免疫熒光染色：胞漿抗CK8/18/19（+）、CD45 （-）。選定CTCs>3個作為評價標準［4-5］?；颊邩吮镜氖褂媒泜惱砦瘑T會認可。

1.2.3 隨訪48例患者均完成隨訪，無失訪患者。在治療結束后2年內每3個月隨訪1次，隨訪內容包括食管鋇餐、胸部CT及腹部B超，每6個月復查胃鏡及上腹部CT。末次隨訪時間為2016年1月20日，中位隨訪時間26個月。隨訪方式包括門診復診與電話隨訪。觀察近期療效及遠期生存，隨訪率100%。

1.3 統計學分析

采用SPSS15軟件進行統計分析。計量資料采用χ2檢驗，生存率采用Kaplan-Meier方法，Log rank檢驗差別顯著性。Cox回歸分析評估參考數的預后意義，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料與CTCs的相關性分析

T、N分期及臨床分期與CTCs有明顯的相關性，其中T1+T2及T3+T4的陽性率分別為31.8%（7/22）、69.2%（18/26），N0+N1及N2+N3的陽性率分別為23.8% （5/21）、74.1%（20/27）。Ⅱ及Ⅲ期的陽性率分別為34.7%（8/23）、68%（17/25），結果顯示T、N分期及臨床分期越高，CTCs陽性率越高，差異具有統計學意義（P<0.05），而性別、年齡、發病部位均與CTCs無相關性（表1）。

2.2 同步放化療過程中的CTCs的動態變化

同步放化療開始前有25例患者的CTCs檢測呈陽性，同步放化療過程中CTCs陽性率逐步下降，放化療結束后仍有10例患者呈陽性。具體為同步放化療前CTCs陽性率為52.1%（25/48），放化療2周為47.9% （23/48）、4周為31.3%（15/48）、6周為22.9%（11/48），放化療后為20.8%（10/48），從放化療4周開始差異具有統計學意義（表2）。

表1 患者一般資料與CTCs的相關性分析比較Table 1 Correlation analysis between clinical characteristics and CTCs

2.3 CTCs陽性率與預后的分析

隨訪兩年后所有患者的2年生存率為62.5%，放化療前CTCs陽性患者的2年生存率為52.0%，CTCs陰性患者生存率73.9%（χ2=5.694，P=0.017）；放化療后CTCs陽性患者的2年生存率僅為30.0%，而CTCs陰性患者則為71.1%（χ2=6.295，P=0.012）。放化療前后CTCs陽性與CTCs陰性的患者2年生存率相比差異具有統計學意義（均P<0.05，圖1，2）。進一步行Cox回歸分析提示臨床分期及放化療后循環血腫瘤細胞水平是食管癌患者的獨立預后因子（表3）。

表2 同步放化療前后CTCs陽性率的變化Table 2 Positive rates of CTCs before and after chemoradiotherapy

表2 同步放化療前后CTCs陽性率的變化（續表2）Table 2 Positive rates of CTCs before and after chemoradiotherapy

圖1 放化療前CTCs陽性與生存率的關系Figure 1 Correlation between CTCs and overall survival before chemoradiotherapy

圖2 放化療后CTCs陽性與生存率的關系Figure 2 Correlation between CTCs and overall survival after chemoradiotherapy

表3 食管癌患者2年生存率的Cox回歸分析Table 3 Cox regression analysis of two-year survival rate of patients with esophageal cancer

3 討論

目前同步放化療已成為食管癌非手術治療的標準治療方案，2015年第三版NCCN指南中食管癌根治性同步放化療的放療劑量為50～50.4 Gy，國內常用劑量為60 Gy，但是局控仍不令人滿意，有文獻報道在食管癌的同步放化療中，放療劑量的增加與局控呈正相關［6］，劑量>60 Gy則局控更佳［7］。故本研究中采用的劑量為61.2～62 Gy。

目前CTCs常被用于評價腫瘤患者復發轉移的風險及預后分析。但血液循環中腫瘤細胞數量極少，檢測困難，尚無標準的CTCs檢測方法。常用的CTCs檢測主要包括細胞計數法及核酸檢測法［8-9］，前者是免疫細胞化學及流式細胞術，后者主要包括聚合酶鏈反應技術和逆轉錄聚合酶鏈式反應。核酸檢測法檢測的是DNA或mRNA，不能進行形態學觀察；由于取樣時污染、假基因干擾等因素均可造成假陽性。與核酸檢測技術相比，基于細胞學的免疫富集方法，既可分離腫瘤細胞，又可進一步分析細胞表型。故本研究采用細胞計數法進行CTCs檢測。放化療前總體檢出率為52.1%，與文獻報道一致［10］。

有報道顯示食管癌患者治療前CTCs水平與TNM分期相關，但是結論并不完全一致，李軍等［11］的研究顯示CTCs陽性水平與腫瘤與細胞分化程度、淋巴結轉移及臨床分期密切相關，與T分期無明顯相關性。袁東紅等［12］的研究顯示CTCs水平與腫瘤細胞的分化程度、T分期、淋巴結轉移及臨床分期均明顯相關。國外Matsushita等［13］的研究顯示CTCs水平僅與遠處轉移及臨床分期相關，與T分期及淋巴結均無明顯相關。本研究顯示CTCs與T分期、淋巴結轉移及臨床分期均明顯相關，與年齡、性別及發病部位無明顯相關。結果不一致與CTCs檢測方法不同以及樣本量不同有關，但總體反映了CTCs陽性水平與腫瘤的惡性程度相關。

CTCs在食管癌治療前后的改變亦有文獻報道，手術李軍等［11］報道顯示食管癌患者術后CTCs總體水平較術前下降，但有5例患者術前陰性而術后轉為陽性，考慮與腫瘤大小及手術操作有關，有報道顯示手術可能會引起CTCs入血［14］。食管癌放療后亦可引起CTCs水平下降，Yin等［3］報道CTCs水平由放療前的69.4%降到放療后的55.5%。本研究顯示同步放化療前的CTCs陽性率為52.1%，同步放化療后為20.8%，顯示同步放化療較單純放療CTCs水平下降明顯，分析原因認為首先是化療的介入起到了放療增敏的作用，提高了原發病灶的局控，另一方面是化療直接殺死了部分CTCs。另有文獻報道CTCs陽性水平與食管癌預后亦密切相關，CTCs水平越高患者預后越差，尤其是治療結束后的CTCs水平［14-16］。本研究結果顯示治療前后的CTCs陽性患者2年生存率均較CTCs陰性的患者明顯下降，與文獻報道一致，進一步的Cox回歸分析表明臨床分期及放療后CTCs是食管癌同步放化療的獨立預后因子，所以CTCs水平可以作為食管癌患者預后監測指標。

綜上所述，本研究顯示CTCs水平可以反映食管癌的惡性程度，與腫瘤的TNM分期密切相關。同步放化療后CTCs水平較前明顯下降，而且放化療后的低CTCs水平患者預后更好。這一結果顯示監測CTCs水平在食管癌的診斷、治療及預后分析中均占有重要的地位。由于目前CTCs檢測技術水平有限，仍有假陽性及假陰性結果存在，影響了這一技術在臨床上的應用，未來的發展方向是提高CTCs檢測的技術水平，這將會在食管癌的個體化治療中發揮重要作用。

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（2016-03-07收稿）

（2016-04-17修回）

（編輯：武斌校對：張亻抿）

Changes of circulating tumor cells in locally advanced esophageal squamous cell carcinoma patients treated with concurrent chemoradiotherapy

Gang XU，Yan WANG，Chengwei WANG，Chaoyang WU
Correspondence to: Chaoyang WU；E-mail: wuchaoyang9@163.com
Department of Radiation Oncology，Jiangsu University Affiliated People's Hospital，Zhenjiang 212002，China

AbstractObjective: To investigate the changes of circulating tumor cells in locally advanced esophageal squamous cell carcinoma patients treated with concurrent chemoradiotherapy.The effect of these alterations on the patients'prognosis was also analyzed.Methods: Circulating tumor cells were detected by immunomagnetic enrichment and fluorescence in 48 cases of locally advanced esophageal carcinoma patients treated with concurrent chemoradiotherapy.The dynamic changes of circulating tumor cells were compared between pre- and post-chemoradiotherapy.Moreover，the association of these changes with the clinical characteristics and two-year survival rate were analyzed.Results: The positive rate of circulating tumor cells was closely associated with the T stage，lymph node metastasis，and clinical stage（P<0.05），and the positive rates in pre- and post-chemoradiotherapy were 52.1%（25/48）and 20.8%（10/ 48），respectively.The difference was statistically significant（P<0.05）.Kaplan-Meier analysis showed that the positive rate of circulating tumor cells predicted an adverse two-year survival rate in both pre- and post-chemoradiotherapy（P<0.05）.Cox regression analysis showed that the clinical stage and circulating tumor cells after concurrent chemoradiotherapy were independent prognostic factors in the patients with esophageal carcinoma.Conclusion: Circulating tumor cells can reflect the disease progression in patients with locally advanced esophageal cancer.These cells can also predict the prognosis of esophageal cancer patients treated with concurrent chemoradiotherapy.

Keywords:esophageal squamous cell carcinoma，concurrent chemoradiotherapy，circulating tumor cells，prognosis analysis

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.09.251

通信作者：吳朝陽wuchaoyang9@163.com

作者簡介

許剛專業方向為食管癌的放射治療及預后分析。

E-mail：xugang1981@126.com

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