利用蘋果渣發(fā)酵制備生物腐植酸的工藝研究

孫建國　李運華　王曉彬　李振

摘 要：通過單因素發(fā)酵實驗，以蘋果渣為發(fā)酵基質(zhì)，開展發(fā)酵制備生物腐植酸工藝研究。研究結(jié)果表明：復(fù)合微生物菌劑接種量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%，發(fā)酵時間20～25 d，黃腐酸含量達(dá)22%，活菌含量5.6億/g，為生物腐植酸規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：蘋果渣；黃腐酸

中圖分類號：TQ92 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）02-0166-03

生物腐植酸（黃腐酸）是由富含纖維素、木質(zhì)素的植物殘體及輔助材料，經(jīng)多種微生物在一定條件下發(fā)酵轉(zhuǎn)化而成。產(chǎn)品活性成分多，含有大量功能菌劑，具有改良土壤、增進肥效、調(diào)節(jié)作物生長、提高作物抗逆性和改善作物品質(zhì)等特點。該研究以蘋果渣為原料，進行微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃腐酸的工藝研究，為其規(guī)模化處置提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 發(fā)酵基質(zhì)

以蘋果渣為發(fā)酵基質(zhì)，來自果汁加工廠。蘋果渣中主要成分含量，見表1。

1.1.2 接種劑

是由木霉M21、放線菌F07、地衣芽孢桿菌X33、酵母菌J05組成的復(fù)合生物菌劑，有效活菌數(shù)≥100億/g，亳州市恒順生態(tài)科技有限公司提供。

1.1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺，蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，721分光光度計，光學(xué)顯微鏡，真空干燥箱等。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 生物菌劑接種量對發(fā)酵過程的影響

實驗設(shè)四個處理，兩次重復(fù)。T0為對照處理，處理T1、T2、T3生物菌劑接種量分別為3%、5%、7%。各處理物料含水率50%，尿素添加量2%。

1.2.2 尿素添加量對發(fā)酵過程的影響

實驗設(shè)四個處理，兩次重復(fù)。T0為對照處理，處理T1、T2、T3尿素添加量分別為1%、2%、3%。各處理物料含水率50%，生物菌劑接種量3%。

1.2.3 物料含水率對發(fā)酵過程的影響

實驗設(shè)四個處理，兩次重復(fù)，處理T1、T2、T3、T4物料含水率分別為40%、50%、60%、70%。各處理生物菌劑接種量3%，尿素添加量2%。

1.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵過程的影響

實驗設(shè)四個處理，兩次重復(fù)。

T1：發(fā)酵時間15 d；

T2：發(fā)酵時間20 d；

T3：發(fā)酵時間25 d；

T4發(fā)酵時間30 d。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 含水率、有效活菌數(shù)的測定

含水率、有效活菌數(shù)按照NY/T798-2004復(fù)合微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)方法測定。

1.3.2 溫度測定

在堆肥中心下層、中層和上層放置3支溫度計，于每天上午9：00和下午16：00記錄堆體溫度，取其算術(shù)平均值。

1.3.3 黃腐酸含量測定

稱取0.2 g試樣于250 ml錐形瓶中，加入70 ml水，于瓶口插上小玻璃漏斗，置于沸水浴中加熱溶解30 min，并經(jīng)常攪動，取出錐形瓶，冷卻后將溶液及殘渣全部轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用中速濾紙過濾，棄去最初的部分濾液。

而后，準(zhǔn)確吸取上述濾液5 ml于250 ml錐心瓶中，加入C（K2Cr2O7）=4.8 mol/l重鉻酸鉀溶液5 ml，緩慢加入濃硫酸15 ml，于沸水浴中加熱氧化30 min。

最后，將氧化后的溶液從水浴上取下，冷卻至室溫，加入70 ml水，3滴鄰菲羅琳指示劑，用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由橙色經(jīng)綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榇u紅色為終點。按下式計算出黃腐酸含量：

式中：V0為滴定空白試管所消耗的硫酸亞鐵體積，ml；

V為滴定樣品試管所消耗的硫酸亞鐵體積，ml；

N為硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/l；

0.003為碳的毫克重量，g；

a為樣品溶液滴定的體積，ml；

b為滴定時所吸取的樣品溶液的體積，ml；

G為配制樣品溶液時所加入的樣品質(zhì)量，g；

C為黃腐酸的含碳比（一般取為0.5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物菌劑接種量對發(fā)酵過程的影響

2.1.1 發(fā)酵過程溫度與黃腐酸含量變化

生物菌劑接種量對發(fā)酵溫度的變化，如圖1所示，從數(shù)據(jù)變化可以看出，各處理溫度變化均高于對照。隨著菌劑接種量的增加，溫度增幅最大，T1、T2、T3處理最高溫度分別為46.5 ℃、48.2 ℃、50 ℃，處理T3發(fā)酵溫度增幅最大。不同生物菌劑接種量黃腐酸含量變化，如圖2所示，處理T1、T2、T3發(fā)酵后黃腐酸含量均高于對照，分別為15%、18.4%、19.2%，處理T3黃腐酸含量最高。

2.1.2 發(fā)酵前后有效活菌數(shù)變化

生物菌劑接種量對發(fā)酵前后有效活菌數(shù)的影響，見表2，從表發(fā)酵前后有效活菌數(shù)變化，反映隨著菌劑接種量增加，菌株利用物料速度加快，活菌數(shù)增幅更快更多，物料分解效率越高。

通過上述實驗結(jié)果得出，隨著菌劑接種量增加，菌劑生長加快，物料營養(yǎng)很快被消耗，產(chǎn)熱促進溫度上升，提升物料的分解效率，促使黃腐酸含量與有效活菌數(shù)快速增長。但是，處理T2、T3間數(shù)據(jù)差異不顯著，考慮到成本因素，菌劑最佳接種量5%～7%。

2.2 尿素添加量對發(fā)酵過程的影響

2.2.1 發(fā)酵過程溫度與黃腐酸含量變化

有機物料發(fā)酵CN比一般在20～30較為合適，蘋果渣CN比52，有機碳含量較高，氮含量不足，影響菌劑生長，不利于物料發(fā)酵。通過添加尿素，增加氮含量，降低CN比，促進發(fā)酵進程。處理T1、T2、T3的CN比分別為34、25、20。尿素添加量對發(fā)酵溫度的變化如圖3所示，不同尿素添加量黃腐酸含量的變化如圖4所示，通過圖3、圖4數(shù)據(jù)變化可以看出，隨著尿素含量增加，溫度增幅愈大，黃腐酸含量增長越多。其中，處理T2、T3效果最佳。

2.2.2 發(fā)酵前后有效活菌數(shù)變化

尿素添加量對發(fā)酵前后有效活菌數(shù)的影響，見表3，從表數(shù)據(jù)可以看出，隨著尿素添加量的增加，活菌數(shù)增長迅速，合適的CN比可以促進菌株迅速繁殖，加快發(fā)酵進程。

上述實驗結(jié)果表明，物料發(fā)酵較適CN比20-30，即尿素添加量2%～3%，物料發(fā)酵進程加快，黃腐酸與活菌數(shù)含量最高。

2.3 物料含水率對發(fā)酵過程的影響

2.3.1 發(fā)酵過程溫度變化

無聊含水率對發(fā)酵溫度的變化如圖5所示，觀察圖5各處理發(fā)酵溫度變化，處理T1、T2最高溫度分別為49.5 ℃、49 ℃，說明40%、50%含水率比較有利物料發(fā)酵。處理T3、T4溫度增幅小，原因是含水率過高，不利于氧氣供給，影響了菌種生長，物料分解率下降，產(chǎn)熱少。

2.3.2 發(fā)酵過程黃腐酸含量與活菌數(shù)變化

無聊含水率對黃腐酸含量的影響，如圖6所示，看圖6黃腐酸含量變化，各處理黃腐酸含量分別為16%、16.4%、13.8%、10.2%，處理T1、T2黃腐酸含量最高。發(fā)酵前后的活菌數(shù)變化，見表4，處理T1、T2發(fā)酵后活菌數(shù)最高，分別為4.18億/g、4.25億/g。

綜上實驗結(jié)果表明，生物發(fā)酵腐植酸較適含水率40%、50%，其中50%含水率的黃腐酸含量提前4～5d達(dá)到最高值，物料最佳含水率50%。

2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵過程的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果，蘋果渣制備生物腐植酸發(fā)酵參數(shù)為：復(fù)合生物菌劑添加量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%。采用上述工藝參數(shù)，研究不同發(fā)酵時間黃腐酸與活菌含量變化。

2.4.1 發(fā)酵過程溫度變化

有機物料發(fā)酵分為發(fā)熱、中高溫與降溫、腐熟保肥階段。發(fā)酵時間對發(fā)酵溫度的變化，如圖7所示，各處理發(fā)酵最高溫度約50℃，無明顯區(qū)別，處理圖T1、T2因發(fā)酵時間短，缺少降溫階段的腐解。

2.4.2 發(fā)酵過程黃腐酸含量變化

從溫度變化來看，第11～17 d是發(fā)酵中高溫階段，從發(fā)酵18 d后，進入降溫腐熟保肥階段，即腐植酸累積階段。發(fā)酵時間對黃腐酸含量的影響，如圖8所示，發(fā)酵時間20 d，黃腐酸含量達(dá)到最高22%。

2.4.3 發(fā)酵前后活菌數(shù)變化

發(fā)酵時間對發(fā)酵前后有效活菌數(shù)的影響，見表5，發(fā)酵15 d，物料活菌數(shù)低于發(fā)酵20、25、30 d，后三者活菌數(shù)差異不顯著。

綜上所述，發(fā)酵13天，物料溫度達(dá)到最高，發(fā)酵18天后進入降溫腐熟保肥階段，即腐植酸累積期，考慮到肥效、黃腐酸與活菌含量因素，最佳發(fā)酵時間20～25 d。

3 結(jié) 語

利用蘋果渣發(fā)酵制取生物腐植酸，是一個極其復(fù)雜的反應(yīng)過程。微生物的生長繁殖速度，直接決定了物料腐解程度，從而影響生物腐植酸生成的數(shù)量與質(zhì)量。因此，選擇創(chuàng)造最佳的微生物生長環(huán)境，探求最優(yōu)生長因子，是影響發(fā)酵好壞的重要因素。研究結(jié)果表明，發(fā)酵制備生物腐植酸工藝參數(shù)為：復(fù)合微生物菌劑接種量5%～7%，尿素添加量2%～3%，物料含水率50%，發(fā)酵時間20～25 d，黃腐酸含量達(dá)22%，活菌含量5.6億/g。

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