泛素蛋白連接酶1在大鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜中的表達及意義

楊 波, 林新鐸, 王星人, 唐俊明, 楊建業, 張 蕾, 曹 騰, 姜峰波, 王家寧(. 武漢大學人民醫院心血管內科, 武漢40060; . 湖北醫藥學院附屬人民醫院臨床醫學研究所,十堰44000; . 湖北醫藥學院附屬人民醫院神經內科, 十堰44000)

?

泛素蛋白連接酶1在大鼠頸動脈球囊
損傷后新生內膜中的表達及意義

楊 波1, 林新鐸1, 王星人2, 唐俊明2, 楊建業2, 張 蕾2, 曹 騰1, 姜峰波3, 王家寧2
(1. 武漢大學人民醫院心血管內科, 武漢430060; 2. 湖北醫藥學院附屬人民醫院臨床醫學研究所,十堰442000; 3. 湖北醫藥學院附屬人民醫院神經內科, 十堰442000)

[摘要]目的 研究胞質泛素蛋白連接酶1(KPC1）在大鼠頸動脈球囊損傷后的蛋白表達情況，探討其在新生內膜形成過程中的生物學功能。方法 將成年雄性SD大鼠(450～500 g)隨機分為假手術組和頸動脈球囊損傷模型組，建模后以左側損傷動脈為實驗組，同時以假手術組的左側正常頸動脈為對照組。實驗組大鼠于損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分別處死并取材，采用 Western blot 檢測KPC1蛋白、內膜增殖細胞核抗原(PCNA)表達情況，以qRT-PCR檢測KPC1的mRNA表達，蘇木精-伊紅(HE)染色后比較內膜增生程度; 采用體外培養血管平滑肌細胞(VSMC)建立增殖模型，運用Western blot及qRT-PCR檢測其KPC1蛋白、KPC1 mRNA表達特征。結果 Western blot 結果顯示，頸動脈球囊損傷后實驗組KPC1蛋白表達水平明顯低于正常對照組(P<0.05)，而PCNA蛋白表達量明顯高于正常對照組(P<0.05); qRT-PCR檢測結果顯示，實驗組KPC1的mRNA水平明顯低于對照組(P<0.05); HE染色結果示頸動脈球囊損傷后1 d、3 d時光鏡下血管內膜增生不明顯; 7 d時光鏡下可見新生內膜，增生的VSMC向內膜下遷移，管腔開始狹窄; 14 d時，可見明顯新生內膜，VSMC排列紊亂，內彈力膜斷裂，管腔明顯狹窄，內膜厚度超過中膜; 28 d時，血管內膜繼續不規則增生，血管腔狹窄程度繼續加重，狹窄超過50%。體外培養并模擬VSMC增殖，提取細胞進行 Western blot和qRT-PCR檢測顯示，KPC1蛋白、KPC1 mRNA表達在血小板源性生長因子-BB刺激增殖后開始逐漸減低。結論 抑制KPC1基因表達可促進損傷內膜增生，其作用機制可能與促進VSMC增殖有關。

[關鍵詞]胞質泛素蛋白連接酶1 (KPC1); 新生內膜; 血管平滑肌細胞(VSMC); 增生

心血管疾病仍然是全世界最常見的死亡原因，約占所有死亡人數的30%[1]。動脈粥樣硬化可導致血流受限造成受損組織氧供障礙產生臨床癥狀，如心絞痛或間歇性跛行。不穩定斑塊破裂和血栓形成所導致的心肌梗死是高患病率和死亡率的重要原因。目前, 藥物洗脫支架(DES)已常規用于治療閉塞性動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈病變，降低再狹窄發生率。然而, 由于支架術后血管壁的延遲再內皮化，DES術后仍有大量患者出現晚期支架血栓形成或再梗塞等并發癥。因此, DES術后需要延長雙重抗血小板治療周期[2,3]。顯然, 再狹窄(ISR)仍然是心血管治療領域的重大挑戰，完全了解控制再狹窄進程的的分子機制是解決該醫學難題的關鍵所在。

血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和遷移在血管成形術或支架置入術后新生內膜形成過程中起著重要作用[4,5]。經皮冠狀動脈介入術后新生內膜過度增生是再狹窄的主要原因，能顯著縮小血管腔面積[6]。胞質泛素蛋白連接酶1(KPC1), 也稱環指蛋白123(RNF123), 是一類分子量為140 000的環指蛋白連接酶，定位于細胞質，能夠與另一催化亞基KPC2共同形成p27的泛素蛋白連接酶復合體KPC，促進p27多聚泛素化。有研究表明[7,8]，KPC1可介導p105、p27等多個分子的降解過程, 具有調節細胞增殖、分化、發育和凋亡等功能。那么在頸動脈球囊損傷后KPC1的表達情況如何，KPC1是否參與球囊損傷后VSMC活化增殖的調控，目前尚缺乏相關研究。因此，本研究通過建立大鼠頸動脈球囊損傷模型和體外培養VSMC增殖模型，觀察KPC1在VSMC中的表達變化，了解KPC1在新生內膜增殖過程中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級成年雄性SD大鼠, 體質量 450～500 g,購自湖北醫藥學院實驗動物中心[SYXK(顎)2011-0031]。異氟烷購自魯南貝特制藥有限公司; 麻醉機(Madison WI 537077550)購自美國Ohmeda公司; 2F球囊導管(CA92614-5686) 購自美國Edwards Lifesciences LLC公司。多聚甲醛購自天津市大茂化學試劑廠; 固體石蠟購自上海華申康復器材有限公司; 石蠟包埋機、石蠟切片機購自德國LEICA公司;防脫玻片購自韓國MEDIMEX公司; CS-Ⅵ 型攤片烤片機購自孝感市宏業醫用儀器有限公司; 蘇木精、伊紅購自珠海貝索生物技術有限公司。血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)購自美國Peprotech公司; KPC1抗體購自美國Abcam公司，工作濃度為1∶1 000; 山羊抗小鼠二抗購自武漢安特捷生物技術有限公司(工作濃度為1∶10 000); 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司，BIO～RAD顯影系統購自聯想生物科技有限公司。RNA提取試劑盒RNeasy Plus MiniKit 購自德國Qiagen公司; dNTPs、RNA酶抑制劑、反轉錄酶、rTaq DNA聚合酶均購自Life Sciences公司; 熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司; ViiA7實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 參照Wang等[9]采用貼壁法原代培養大鼠血管平滑肌細胞。大鼠脫頸猝死后常規消毒，取出大鼠胸主動脈立即置于含青霉素和鏈霉素的無菌生理鹽水中并反復沖洗，滴加少許DMEM培養基使組織保持濕潤，小心地從血管中解剖出中膜并切成塊(＜1 mm3)，均勻擺置于纖維蛋白包被的細胞培養瓶中。蓋好瓶蓋后輕輕翻轉培養瓶,讓瓶底朝上并向瓶內注入適量DMEM培養基，在37 ℃細胞培養箱內放置2～4 h使組織塊干涸并與瓶壁貼附后,將培養瓶慢慢翻轉平放，繼續靜置培養3～5 d。待有細胞從組織塊周圍游出后更換DMEM培養基進行傳代培養直到獲得足夠多的VSMC。使用血清饑餓48 h療法使細胞同步在 G0/G1期，隨后加入PDGF-BB刺激細胞增殖, 模擬體內VSMC受損傷后增殖條件，以未加入PDGF-BB為對照組。收獲對照組及實驗組各時間點(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)的細胞，加入適量細胞裂解緩沖液，提取細胞蛋白和mRNA進行分析。

1.2.2 qRT-PCR檢測KPC1 mRNA 表達水平 對照組于做完假手術后立即處死SD大鼠取左側正常血管，實驗組于球囊損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分別處死SD大鼠取左側損傷處血管，提取細胞總RNA，檢測各組KPC1的mRNA表達。參考SD大鼠KPC1的基因序列設計了一對引物，上游引物5'-CTGCGTCCAATAAGTCCAGC-3', 下游引物5'-GACGTCATCTTTCACCGCTC-3', 由上海生工生物工程有限公司合成, 擴增片段大小為4 471 bp。qRT-PCR反應體系為: 總體積為10 mL, 每組設3個復孔，2× SuperReal PreMix Plus 5 mL，上游引物(10 mmol/L)0.3 mL，下游引物(10 mmol/L)0.3 mL，cDNA模板1 mL，RNase-free ddH2O 3.4 mL，混勻后甩至管底，于ViiA7實時熒光定量PCR儀上設置反應條件為95 ℃ 15 min預變性，95 ℃ 10 s, 60 ℃20 s, 72 ℃ 30 s, 共35個循環。

1.2.3 模型建立 參照楊波等[10]建立頸動脈球囊損傷模型，在麻醉機作用下用異氟烷將SD大鼠麻醉后, 剃毛、常規消毒。取頸部正中切口, 切開皮膚及筋膜，鈍性分離，暴露左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，用顯微血管夾夾閉左側頸總動脈近心端，用2號線環緊頸內動脈遠心端，臨時阻斷血流，同時用4號線結扎頸外動脈遠心端。在頸外動脈血管近心端剪一斜形切口, 將2F球囊導管從頸外動脈切口逆行插入頸總動脈, 插入長度4 cm。向球囊內注入生理鹽水充盈球囊趕出汽泡，靜置30 s，再用1 mL注射器注入0.3 mL生理鹽水后關閉三通開關，將球囊旋轉并來回抽3次，以剝脫內膜，然后退出球囊。結扎頸外動脈近心端，松開顯微血管夾和2號線，恢復頸總動脈至頸內動脈血流，縫合頸部切口。術后即刻肌注青霉素20萬單位預防感染，連續3 d；如手術過程中失血過多可術后腹腔注射5 mL生理鹽水; 為防止血栓形成術后立即皮下注射普通肝素鈉100 U/kg，連續3 d。SD大鼠清醒后送回動物房飼養，所有實驗動物均用滅菌水、無菌飼料喂養。

1.2.4 損傷動脈的形態學觀察 對照組大鼠于假手術后立即處死, 取左側正常血管, 實驗組大鼠于損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分別處死, 取左側損傷處血管, 置于質量分數4%多聚甲醛溶液中固定。48 h后流水過夜，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。然后每份標本橫斷面非連續取3處切片, 切片厚度5 mm，脫蠟至水，以HE法染色。采用Image proplus 6.0圖片處理系統測量新生內膜面積和中膜面積，并計算新生內膜面積與中膜面積比值。新生內膜面積指血管腔表面與內彈力膜之間的面積; 中膜面積指內彈力膜與外彈力膜之間的面積。

1.2.5 Western blot 檢測 組織總蛋白提?。悍謩e取對照組和各時間點實驗組SD大鼠左側頸總動脈，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎后液氮研磨，按 500 mL/0.1 g 加入RIPA蛋白裂解液，放置4 ℃冰箱搖勻4 h后15 000 r/min 離心10 min，取上清用二喹啉酸(BCA)法測定蛋白濃度；細胞總蛋白提?。? 000 r/min，5 min后棄上清收集細胞，加入200～600 mL RIPA裂解液混勻(液體清澈透明)，放置4 ℃冰箱搖勻4 h后15 000 r/min 離心10 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度。按蛋白樣本量∶5×上樣緩沖液為4∶1比例處理蛋白，100 ℃煮5 min 后行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結束后行電轉印記將膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，轉移后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的Tris-HCl(TBS)緩沖液室溫封閉1 h，然后用抗KPC1、PCNA抗體4 ℃孵育過夜, Tris-HCl-Tween (TBST) 緩沖液漂洗 3 次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫孵育2 h，TBST 漂洗 3 次，每次5 min，最后滴加顯影劑暗室曝光。表達水平(相對灰度值)=實驗組灰度值／內參灰度值，取3次實驗結果的平均值進行半定量分析。

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計學處理。計量數據以± s表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗。采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 頸總動脈球囊損傷后血管內膜增生情況

頸總動脈球囊損傷后1 d、3 d時光學顯微鏡下血管內膜增生不明顯; 7 d時可見新生內膜，增生的VSMC向內膜下遷移, 管腔開始狹窄; 14 d時，可見明顯新生內膜，VSMC排列紊亂，內彈力膜斷裂, 管腔明顯狹窄，內膜厚度超過中膜; 28 d時，血管內膜繼續不規則增生，血管腔狹窄程度繼續加重，狹窄超過50%，表明模型建立成功(圖1)。

圖1 頸總動脈球囊損傷后各組血管形態學變化及內膜與中膜面積比1: Normal control group; 2: 1 day after injury; 3: 3 days after injury; 4: 7 days after injury; 5: 14 days after injury; 6: 28 days after injury. Hematoxylin-eosin (HE) staining.*: P<0.05 compared with normal control groupFigure 1 The vascular morphological changes and the ratio of intima to media area in each group after balloon injury of carotid artery

2.2 Western blot和qRT-PCR檢測

與正常對照組比較，實驗組KPC1表達量在損傷后即開始逐漸降低, 28 d時降至最低，而實驗組PCNA表達量在損傷后即開始逐漸升高，28 d達峰值。實驗組損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d KPC1及PCNA表達量與正常對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。qRT-PCR檢測結果與Western blot 檢測結果基本一致(圖2)。

2.3 KPC1在體外VSMC中的表達

提取細胞蛋白行Western blot檢測，顯示在不同劑量PDGF-BB刺激后，VSMC KPC1表達則逐漸減少，80 ng/mL時降至最低(P<0.05); 在20 ng/mL PDGF-BB刺激增殖后KPC1蛋白表達即開始降低，72 h后降至最低(P<0.05); qRT-PCR檢測結果與Western blot檢測結果基本一致(圖3、4)。

圖2 頸總動脈球囊損傷后KPC1及PCNA蛋白、KPC1 mRNA的表達情況1: Normal control group; 2: 1 day after injury; 3: 3 days after injury; 4: 7 days after injury; 5: 14 days after injury; 6: 28 days after injury.*: P<0.05 compared with normal control groupFigure 2 Expression of KPC1 and PCNA protein, KPC1 mRNA after balloon injury of carotid artery

圖3 VSMC在不同劑量PDGF-BB刺激增殖后KPC1表達情況1: Normal control group; 2: 5 ng/mL; 3: 10 ng/mL; 4: 20 ng/mL; 5: 40 ng/mL; 6: 80 ng/mL.*: P<0.05 compared with normal control groupFigure 3 Expression of KPC1 after different doses of PDGF-BB stimulating in VSMCs

圖4 VSMC在20 ng/mL PDGF-BB刺激增殖后各時間點KPC1表達情況1: Normal control group; 2: 6 hours; 3: 12 hours; 4: 24 hours; 5: 48 hours; 6: 72 hours.*: P<0.05 compared with normal control groupFigure 4 Expression of KPC1 after 20 ng/mL PDGF-BB stimulating at indicated time points in VSMCs

3 討論

自1978年首次報道[11]經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病后，該領域的研究增長迅速。雖然采用DES使得ISR 率顯著下降，但由于支架內不完全內皮化、抗血小板治療依從性差或不能耐受以及對聚合物涂層產生炎癥反應等，使患者術后仍有支架內血栓形成的風險(15%～30%)[12]。ISR是血管對機械性損傷的修復反應，其主要由兩個過程組成即新生內膜增生(neointimal hyperplasia) 和血管重塑(vessel remodeling)[13]。擴張球囊和放置支架時可壓裂或撕裂動脈粥樣硬化斑塊、內皮細胞、內膜以及動脈壁的內側層，這將導致細胞因子和生長因子釋放、黏附分子表達、巨噬細胞和其他炎性細胞浸潤、VSMC增殖和遷移、細胞外基質沉積[14]。新生內膜增生導致管腔變窄和冠狀動脈血流量減少，使患者反復出現癥狀以及重復血運重建，甚至在某些情況下出現血栓閉塞性心肌梗塞。其中VSMC的增殖和遷移在新生內膜形成過程中起最關鍵作用[9,15]，因此研究PTCA后反應性新生內膜增生的內在分子機制，進而探索出有效調節、平衡該過程的方法，也許可以為治療ISR提供新的思路。

Kamura等[7]于2004年發現一種新的胞質泛素連接酶復合體命名為KPC，由KPC1和KPC2 兩個亞基組成。KPC1基因定位于第4號染色體短臂1 區5帶(4p15)，編碼的蛋白質KPC1是一類分子量為140 000的環指蛋白連接酶，定位于細胞質，作為催化亞基。KPC2(又稱UBAC1)是UBL-UBA蛋白家族成員之一，分子量為50 000，定位于細胞質，起銜接蛋白的作用，通過其C-末端的UBL結構域可促進 p27運輸至26S蛋白酶體并對KPC1起到穩定作用。目前研究已證實[16-18]，KPC1可介導p50、p27等多個分子的降解過程，參與神經系統疾病、血液系統疾病、腫瘤疾病的調節，但幾乎還沒有關于KPC1在心血管系統方面的研究。

p105通常經bTrCPE3完全降解，在某些情況下也可經KPC1途徑形成大量的p50，這種選擇機制目前還不清楚。核轉錄因子p50-p65異源二聚體是致癌基因具有促進一些惡性腫瘤形成，包括神經膠質細胞瘤、乳腺癌等[19]。近期研究表明[20,21]，一些惡性腫瘤比正常組織表達更低的KPC1和p50，這與經典的KPC1/p27腫瘤細胞調節路徑相矛盾；過表達KPC1通過泛素化p105產生大量p50，形成具有抗腫瘤、抗炎癥反應、抑制腫瘤細胞增殖和遷移的p50-p50同源二聚體。研究小鼠模型中生長的人類惡性腫瘤表明，惡性抑制與這兩種蛋白的表達水平之間存在密切關系，增加組織中KPC1和p50的表達量可以保護其免受惡性腫瘤的影響[8]。本研究中大鼠頸總動脈球囊損傷組(實驗組)和正常對照組比較，KPC1表達量明顯降低，內膜與中膜面積比值增大，再狹窄程度嚴重，內膜PCNA陽性表達率高，這可能與KPC1降低后形成抑制細胞增殖和遷移的p50-p50同源二聚體減少有關，但KPC1影響血管再狹窄是否與p50-p50同源二聚體有關值得進一步探討。本研究同時采用大鼠胸主動脈體外培養原代VSMC，使用血清饑餓48 h療法致使細胞同步在G0/G1 期, 隨后加入PDGF-BB刺激細胞增殖, 模擬體內VSMC受損傷后增殖條件。提取細胞行 Western blot和qRT-PCR檢測顯示, 在PDGF-BB刺激后KPC1蛋白、KPC1 mRNA表達隨即開始降低, 這一結果進一步驗證了大體水平結論的正確性。

綜上所述，本研究首次報道了KPC1在大鼠頸總動脈球囊損傷后表達變化，指出KPC1依賴的p105泛素化降解為p50-p50同源二聚體，可能對球囊損傷后抑制VSMC過度活化增殖起到作用，提示KPC1可能是治療血管再狹窄的新靶點。血管再狹窄形成的過程涉及多種因素和基因，且多個信號通路可以相互影響，因此，尚需更多的研究來進一步了解血管再狹窄的機制。

參考文獻：

[1] Libby P, Braunwald E. Braunwald’s heart disease : a textbook of cardiovascular medicine[M]. Philadelphia:Saunders/ Elsevier, 2008.

[2] Joner M, Finn AV, Farb A, et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk [J]. J Am Coll Cardiol, 2006, 48(1):193-202.

[3] Chatterjee S, Pandey A. Drug eluting stents: friend or foe? A review of cellular mechanisms behind the effects of Paclitaxel and sirolimus eluting stents[J]. Curr Drug Metab, 2008, 9(6): 554-566.

[4] Polimeni A, De Rosa S, Indolfi C. Vascular miRNAs after balloon angioplasty[J]. Trends Cardiovasc Med, 2013, 23:9-14.

[5] Curcio A, Torella D, Indolfi C. Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting: approach to therapy[J]. Circ J, 2011, 75 (6):1287-1296.

[6] Lowe HC, Oesterle SN, Khachigian LM. Coronary in-stent restenosis: current status and future strategies[J]. J Am Coll Cardiol, 2002, 39(2):183-193.

[7] Kamura T, Hara T, Matsumoto M, et al. Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27(Kip1) at G1 phase [J]. Nat Cell Biol, 2004, 6(12):1229-1235.

[8] Kravtsova-Ivantsiv Y, Shomer I, Cohen-Kaplan V, et al. KPC1-mediated ubiquitination and proteasomal processing of NF-kappaB1 p105 to p50 restricts tumor growth[J]. Cell, 2015, 161(2):333-347.

[9] Wang JN, Shi N, Xie WB, et al. Response gene to complement 32 promotes vascular lesion formation through stimulation of smooth muscle cell proliferation and migration[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(8):e19-e26.

[10] 楊波, 吳冰, 唐俊明, 等. 大鼠頸總動脈球囊拉傷所致血管狹窄模型的建立[J]. 實驗動物與比較醫學, 2015, 35(2): 87-91.

[11] Gruntzig A. Transluminal dilatation of coronary-artery stenosis[J]. Lancet, 1978, 1(8058):263.

[12] Muzina A, Wei L. Use of intravascular ultrasound vs. optical coherence tomography for mechanism and patterns of in-stent restenosis among bare metal stents and drug eluting stents[J]. J Thorac Dis, 2016, 8(1):E104-E108.

[13] Forrester JS, Fishbein M, Helfant R, et al. A paradigm for restenosis based on cell biology: clues for the development of new preventive therapies[J]. J Am Coll Cardiol, 1991, 17 (3):758-769.

[14] Costa MA, Simon DI. Molecular basis of restenosis and drugeluting stents[J]. Circulation, 2005, 111(17):2257-2273.

[15] Wang JN, Shi N, Chen SY. Manganese superoxide dismutase inhibits neointima formation through attenuation of migration and proliferation of vascular smooth muscle cells[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 52(1):173-181.

[16] Teyssier J R, Rey R, Ragot S, et al. Correlative gene expression pattern linking RNF123 to cellular stress-senescence genes in patients with depressive disorder: implication of DRD1 in the cerebral cortex[J]. J Affect Disord, 2013, 151(2): 432-438.

[17] Lu C, Huang X, Zhang X, et al. miR-221 and miR-155 regulate human dendritic cell development, apoptosis, and IL-12 production through targeting of p27kip1, KPC1, and SOCS-1[J]. Blood, 2011, 117(16):4293-4303.

[18] Hristova NR, Tagscherer KE, Fassl A, et al. Notch1-dependent regulation of p27 determines cell fate in colorectal cancer[J]. Int J Oncol, 2013, 43(6):1967-1975.

[29] 景彩萍. NF-kB抑制劑對乳腺癌細胞增殖作用的影響及P65、MMP-9蛋白表達研究[D]. 延安: 延安大學, 2015.

[20] Siggers T, Chang AB, Teixeira A, et al. Principles of dimerspecific gene regulation revealed by a comprehensive characterization of NF-kappaB family DNA binding[J]. Nat Immunol, 2012, 13(1):95-102.

[21] 楊春妮，楊一兵. NF-kB及其信號傳導通路與腫瘤放射耐受的研究進展[J]. 中國現代醫藥雜志, 2015(12):106-109.

Expression and Role of KIP1 Ubiquitylation-promoting Complex 1 in Neointimal after Carotid Arteries Balloon Injury in Rats

YANG Bo1, LIN Xin-duo1, WANG Xing-ren2, TANG Jun-ming2, YANG Jian-ye2, ZHANG Lei2, CAO Teng1, JIANG Feng-bo3, WANG Jia-ning2
(1. Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China; 2. Institute of Clinical Medicine, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China; 3. Department of Neurology, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

[Abstract]Objective To study the expression of Kip1 ubiquitylation-promoting complex 1(KPC1) protein after carotid arteries balloon injury in SD rats and to explore its biological function in neointimal formation process. Methods The adult male SD rats (450-500 g) were randomly divided into sham group and carotid artery injury model group. The left damaged carotid arteries were considered as the experimental group after modelling, with the left normal carotid arteries of sham group being as control group. After 1, 3, 7 ,14 and 28 days of balloon injury, SD rats of the experimental group were sacrificed and harvested for histomorphology and molecular markers assay. Hematoxylin-eosin (HE)staining was used to assess the changes of neointimal formation in the carotid artery while Western blot and qRT-PCR were used to evaluate the expression of KPC1. What’s more, Western blot was also used to assess the levels of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). The proliferation model was established by culturing vascular smooth muscle cells (VSMCs) in vitro, then detected the KPC1 protein, KPC1 mRNA expression by Western blot and qRT-PCR. Results Western blot and qRT-PCR showed that the KPC1 expression levels of the experimental group were significantly lower than that of control group (P<0.05), while the PCNA expression was significantly higher than that of control group (P<0.05). Compared to 1 day and 3 days after carotid arteries injury, for VSMC hyperplasia, neointimal generation and luminal stenosis were observed at 7 days by HE staining. With VSMCs hyperplasia, neointimal and luminal stenosis were getting more and more serious, the thickness of intimal exceeded medial at 14 days. At 28 days, the irregular intimal hyperplasia was continued and the degree of vascular stenosis was more than 50%. After stimulation of VSMCs proliferation by platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB) in vitro, then Western blot and qRT-PCR data showed a gradual decreasing trend of KPC1 at protein and mRNA levels. Conclusion Inhibiting KPC1 expression can significantly decrease intima hyperplasia in this model, and its mechanism may be related to the promotion of VSMCs proliferation.

[Key words]Kip1 ubiquitylation-promoting complex 1(KPC1); Neointima; Vascular smooth muscle cells (VSMCs); Hyperplasia

[中圖分類號]Q95-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-5817(2016)03-0161-07

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.001

[收稿日期]2016-03-01

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81270221)

[作者簡介]楊 波(1963-), 男, 醫學博士, 主任醫師, 教授, 碩士生、博士生導師, 主要研究方向: 抑郁癥與心律失常。E-mail: yybb112@whu.edu.cn

[通訊作者]王家寧。E-mail: rywjn@vip.163.com