慢性束縛應(yīng)激對小鼠認知功能及海馬不同亞區(qū)星形膠質(zhì)細胞的影響

王彥永, 張忠霞, 孫美玉, 王銘維(. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 石家莊 05003;2. 河北省腦老化與認知神經(jīng)科學(xué)實驗室, 石家莊05003)

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慢性束縛應(yīng)激對小鼠認知功能及海馬不同亞區(qū)星形膠質(zhì)細胞的影響

王彥永1,2, 張忠霞1,2, 孫美玉1, 王銘維1,2
(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 石家莊 050031;
2. 河北省腦老化與認知神經(jīng)科學(xué)實驗室, 石家莊050031)

[摘要]目的 探討慢性束縛應(yīng)激(CRS)對小鼠認知功能的影響，觀察海馬不同亞區(qū)(CA1、CA3 和DG區(qū))星形膠質(zhì)細胞(AS)的激活情況，明確慢性應(yīng)激對海馬的損傷是否存在特異性靶點。方法 雄性KM小鼠24只按體質(zhì)量隨機分為對照組和應(yīng)激組，每組各12只。采用慢性束縛方法建立小鼠CRS模型，利用新異物體識別實驗(NORT)和Morris水迷宮(MWM)評測其認知功能，HE染色觀察細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)染色法對海馬CA1、CA3和DG區(qū)AS標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)進行染色，采用顯微鏡和圖像分析軟件對海馬上述亞區(qū)AS進行計數(shù)并分析GFAP的表達。結(jié)果 與對照組相比，應(yīng)激組小鼠NORT及MWM實驗的成績均顯著下降(P<0.05)，海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，CA1和CA3區(qū)AS細胞數(shù)及GFAP表達均顯著增加(P<0.05)，DG區(qū)兩者均無顯著變化(P>0.05)。結(jié)論 CRS能夠?qū)е滦∈笳J知功能障礙，海馬CA1、CA3區(qū)AS的活化可能是其機制之一。

[關(guān)鍵詞]慢性束縛應(yīng)激(CRS); 海馬; 星形膠質(zhì)細胞(AS); 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)

應(yīng)激是在外環(huán)境劇變的刺激下，機體出現(xiàn)的一種綜合應(yīng)答狀態(tài)，長期強烈的身心應(yīng)激可對機體多系統(tǒng)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷作用，不僅出現(xiàn)抑郁、應(yīng)激性精神紊亂，還會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[1]。而海馬在記憶獲得和保持的過程中，參與并發(fā)揮了不可替代的作用[2]，其機制在于海馬區(qū)域神經(jīng)細胞的活動。與一直作為研究重心的神經(jīng)元細胞相比, 神經(jīng)膠質(zhì)細胞, 尤其是數(shù)量最多的星形膠質(zhì)細胞(astrocyte, AS)，雖然數(shù)量要比神經(jīng)元高10倍以上，但其作用還未受到足夠關(guān)注[3]。短暫或溫和的應(yīng)激條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細胞會出現(xiàn)短暫的激活，啟動“自我防御”機制使機體恢復(fù)到穩(wěn)態(tài)，但如果過度活化，則可能導(dǎo)致機體的損傷。然而，關(guān)于海馬內(nèi)不同亞區(qū)AS是否在慢性應(yīng)激下發(fā)生激活并參與認知功能損傷，目前研究尚少。本研究采用慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress, CRS)模型，觀察其認知功能的改變及海馬不同亞區(qū)AS的激活情況，擬探討CRS作用于海馬的特異性靶區(qū)，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取3月齡清潔級雄性KM小鼠24只，體質(zhì)量28±2 g, 購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(冀)2013-1-003]。所有動物在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng), 室溫20 ± 2℃，相對濕度50% ± 5%，明暗各12 h [SYXK(冀)2013-0026]。

1.2 儀器與試劑

新異物體識別實驗(novel-object recognition task,NORT)檢測裝置及ANY-maze圖像追蹤系統(tǒng)購于上海欣軟信息科技有限公司; SLY-WMS Morris水迷宮(MWM)及其分析系統(tǒng)購于安徽淮北正華生物儀器有限公司; 兔抗小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(ab7260)購于美國Abcam公司; 辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(SP-9001, 生產(chǎn)批號: K15155A08)免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑顯色劑(ZLI-9018,生產(chǎn)批號：K152410A)均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物分組及模型建立

實驗動物在預(yù)適應(yīng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為對照組和應(yīng)激組，每組12只。采用50 mL的離心管作為容器對應(yīng)激組小鼠進行裝置束縛。在管壁的前端和側(cè)壁扎數(shù)個孔，保證空氣通暢。小鼠頭部朝向離心管的底部，尾部蓋上管蓋，頭部略高于尾部，以便尿液的排出。將此束縛容器固定于實驗臺上，每日在固定時間段(9∶00～17∶00)給予應(yīng)激組小鼠8 h的束縛應(yīng)激刺激，并禁飲食，連續(xù)14 d，制備CRS模型。在同樣時間段對照組小鼠也禁飲食。所有動物在非應(yīng)激期自由飲食。

1.4 新異物體識別實驗

CRS模型制備后1 h，采用NORT檢測兩組小鼠的認知功能。NORT測試裝置包括一白色不透明盒子(50 cm×50 cm×50 cm)，盒子正上方有照明，以避免明暗光線的差異對動物探索行為造成干擾；并安裝ANY-maze圖像追蹤系統(tǒng)用于實時監(jiān)測并記錄行為數(shù)據(jù)。用來辨識的物體A 和B為紅色等大長方體，C為粉色六邊體，底部固定于箱底，以避免實驗過程中被小鼠移動。

測試前將小鼠置于空盒內(nèi)適應(yīng)30 min。測試包括熟悉期和識別期兩個階段。熟悉期，在盒子的左右兩側(cè)分別放置物體A和B，兩側(cè)距離箱壁的距離均為5 cm，將小鼠背對物體放置在物體A、B中央(距A、B均為20 cm)，觀察并記錄5 min內(nèi)小鼠對每個物體的探索時間，之后將動物放回原來的鼠籠。間隔1 h后，進行識別期測試。將物體B更換為新物體C，記錄小鼠在5 min內(nèi)對原有舊物體A和新物體C的探索時間。每次測試結(jié)束，測試物體及測試箱都分別用體積分數(shù)75%乙醇、濕布、干布進行擦拭，以消除氣味對小鼠探索行為和探索物體時間產(chǎn)生的影響。

采用探索新物體的時間和新異物體的差異指數(shù)(DR)作為學(xué)習(xí)記憶的檢測指標(biāo)。DR=探索新物體C的時間/(探索新物體C的時間+探索舊物體A的時間)，探索時間越長，DR越大，說明學(xué)習(xí)記憶能力越好。

1.5 MWM實驗

MWM由一直徑1.2 m、高0.5 m的圓形水池和自動攝像系統(tǒng)組成，水池被池壁上4個等距離點均分為4個象限。一直徑0.14 m、高0.2 m的透明平臺置于水下1.5～2 cm處，并保持固定。攝像系統(tǒng)安裝于水池正上方。

實驗包括定位航行和空間探索兩部分。前4 d進行定位航行實驗，每日將小鼠分別從水迷宮的4個象限面向池壁放入水中，記錄其從入水到爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。每次的最大潛伏期設(shè)置為120 s，若在設(shè)置時間內(nèi)未找到，則記為120 s。將4次的算術(shù)平均值記為當(dāng)日的成績。第5日進行空間探索實驗。將水下的平臺撤掉，記錄小鼠120 s內(nèi)游過原平臺所在象限的時間、路程百分比及穿越原平臺所在位置的次數(shù)。

1.6 腦組織切片的制備

NORT之后1 h, 小鼠ip水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，暴露心臟。經(jīng)右心耳快速推注生理鹽水(約40 mL)，至流出血液顏色變淺，動物眼球變白。繼而快速推注質(zhì)量分數(shù)4 %多聚甲醛溶液(約20 mL), 可見鼠尾翹起。然后調(diào)整輸液器三通, 緩慢滴注4%多聚甲醛溶液, 30 min后處死取腦。腦組織用預(yù)冷4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，經(jīng)脫水、透明處理后, 石蠟包埋, 做冠狀面切片, 厚度5mm。每隔10張片子取1張，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.7 蘇木素-伊紅(HE)染色

石蠟切片先后經(jīng)二甲苯、下行梯度乙醇脫蠟后，經(jīng)蘇木精染色3 min，1%鹽酸乙醇分色3 s，0.5%伊紅染色5 min HE染色，上行梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后，用中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織神經(jīng)細胞的改變。

1.8 GFAP免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，滴加適量3%過氧化氫(H2O2)溶液，室溫孵育10 min；之后用非免疫性動物血清37 ℃孵育35 min；加入兔抗小鼠GFAP抗體(1∶100); 經(jīng)室溫放置1 h后，滴加生物素化山羊抗兔二抗，37 ℃孵育25 min；之后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育25 min；以上每一步驟間均用0.01 mol/L的PBS漂洗3次，每次5 min，之后滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察2～5 min，至出現(xiàn)組織著色；陰性對照以PBS代替一抗，其余染色過程相同；將DAB沖洗5 min后，進行蘇木素復(fù)染；切片經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后，用中性樹膠封片；采集并保存圖像。

1.9 海馬各區(qū)AS計數(shù)

每只小鼠海馬CA1、CA3、齒狀回(DG)區(qū)各取5張切片，顯微鏡下觀察GFAP陽性的AS表達，按盲法由第三人于400倍視野下對各亞區(qū)進行計數(shù)，得出5張片子的平均值為1只小鼠的數(shù)值。每組取12只小鼠，同法計數(shù)，再取12只小鼠的平均值。兩組小鼠選擇的切片部位相同。

1.10 海馬各區(qū)GFAP表達變化

每只小鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)各取5張切片，應(yīng)用NIS-Elements imaging software (Nikon)測定GFAP免疫陽性產(chǎn)物及同一張切片上胼胝體的吸光密度值(A)，以二者的差值為矯正吸光度(A')，每5張切片取平均值為1只小鼠的值，每組取12只小鼠，取均值為最終數(shù)據(jù)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CRS對小鼠認知功能的影響

NORT結(jié)果顯示，在熟悉期，兩組小鼠對物體A、B探索時間無顯著性差異(P>0.05)(表1); 在識別期，與對照組小鼠相比，應(yīng)激組小鼠對新物體C的探索時間顯著減少(P<0.01)，新異物體差異指數(shù)(DR)亦顯著降低(P<0.05)(表2)。

MWM結(jié)果顯示, 在定位航行實驗中, 應(yīng)激組小鼠尋找平臺的潛伏期明顯長于對照組(P<0.05)(表3);在空間探索實驗中, 與對照組相比, 應(yīng)激組小鼠在原平臺所在位置穿越的次數(shù)明顯減少(P<0.05)(表4)。

2.2 CRS對海馬神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠海馬區(qū)細胞排列整齊有序，細胞核呈圓形或橢圓形，形態(tài)完整，胞質(zhì)豐富，胞核飽滿，核仁清晰，核染色質(zhì)均勻未見明顯變化。與此相比，應(yīng)激組小鼠海馬神經(jīng)元細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核不規(guī)則，部分細胞膜內(nèi)陷成泡狀改變(圖1)。

2.3 CRS對海馬不同亞區(qū)AS數(shù)目的影響

應(yīng)激組海馬CA1區(qū)表達GFAP陽性的AS細胞數(shù)比對照組增加了25% (P<0.01)，CA3區(qū)增加了39.04% (P<0.01); 而DG區(qū)應(yīng)激組與對照組無顯著性差異(P>0.05)(表5，圖2)。

2.4 CRS對海馬不同亞區(qū)GFAP表達的影響

與對照組相比，應(yīng)激組小鼠海馬CA1、CA3 區(qū)GFAP表達增加 (P<0.01), 而DG區(qū)兩組無顯著差異(P>0.05)(表6)。

3 討論

表1 兩組小鼠NORT熟悉期結(jié)果Table 1 Performance of rats in two groups during acquisition phase in NORT

表2 兩組小鼠NORT識別期結(jié)果Table 2 Performance of rats in two groups during retrieval phase in NORT

表3 兩組小鼠逃避潛伏期的比較Table 3 Comparison of the daily escape latency between two groups s

表4 兩組小鼠穿越平臺次數(shù)的比較Table 4 Comparison of swimming time and swimming distance percentage in the platform quadrant and the crossing times between two groups

圖1 兩組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞染色結(jié)果 (HE×400)Figure 1 HE staining of neural cells in hippocampus of rats in two groups (HE×400)

表5 兩組小鼠海馬不同區(qū)域星形膠質(zhì)細胞數(shù)的比較Table 5 Comparison of astrocytes in different hippocampal subregions of rats in two groups

A: CA1區(qū) 對照組; B: CA1區(qū) 應(yīng)激組; C: CA3區(qū) 對照組; D: CA3區(qū) 應(yīng)激組; E: DG區(qū) 對照組; F: DG區(qū) 應(yīng)激組圖2 兩組小鼠海馬不同亞區(qū)GFAP表達免疫組織化學(xué)觀察 (×400)A: CA1 area, control group; B: CA1 area, stress group; C: CA3 area, control group; D: CA3 area, stress group; E: DG area, control group; F: DG area, stress groupFigure 2 Representative photographs of immunohistochemical staining of GFAP expression in different hippocampal subregions of rats in two groups (×400)

表6 兩組小鼠海馬不同區(qū)域GFAP表達A'值的變化Table 6 Changes of A' value of GFAP in different hippocampal subregions of rats in two groups

目前被廣泛認可的慢性應(yīng)激動物模型主要有：行為限制(束縛)模型、慢性不可預(yù)測性溫和應(yīng)激模型、交流箱模型等[4]。本研究采用國際通用的CRS模型, 與人類心身疾病的過程具有相似性[5]，制作簡單易行，操作方便，既沒有對動物造成身體上的損傷，又令其感到心身的束縛，是目前使用頻率較高的非損傷性刺激應(yīng)激模型之一。不同的慢性應(yīng)激對學(xué)習(xí)記憶影響的實驗結(jié)果爭議性很大，各類實驗研究結(jié)果的差異性可能是由于應(yīng)激強度、應(yīng)激類型和應(yīng)激持續(xù)時間、動物種屬等問題造成的[6]。本實驗的CRS刺激每日都在同一時段持續(xù)8 h，連續(xù)14 d，并且在結(jié)束后的1 h進行短期學(xué)習(xí)記憶的檢測。

本研究采用NORT和傳統(tǒng)的水迷宮實驗來評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力。在NORT實驗中，對小鼠采用連續(xù)14 d的CRS之后，顯示應(yīng)激組小鼠在熟悉期的探索時間與對照組沒有差異，說明其探索能力和記憶能力無差別; 而識別期對于新物體的識別程度低于熟悉物體，說明應(yīng)激組小鼠對物體的視覺認知能力及學(xué)習(xí)獲得能力沒有發(fā)生改變，而短期的情景與再認記憶發(fā)生損傷。在MWM實驗的定位航行實驗中，應(yīng)激組小鼠找到平臺的時間顯著長于對照組；撤掉平臺的空間探索實驗中，應(yīng)激組小鼠在原平臺所在象限游行的時間、路程百分比及在穿越原平臺所在位置的次數(shù)亦少于對照組，說明CRS亦損傷了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。

海馬作為腦內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體表達最高的部位，在受到應(yīng)激尤其是長時程的應(yīng)激后GCs的升高具有相對于其他部位更高的易感性，導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙與海馬結(jié)構(gòu)的損傷密切相關(guān)[7]。本研究的病理學(xué)觀察顯示，應(yīng)激組小鼠的神經(jīng)細胞確實損傷。與其他多數(shù)文獻不同，本研究沒有籠統(tǒng)的關(guān)注海馬結(jié)構(gòu)及其神經(jīng)元的變化，而是分別關(guān)注了海馬結(jié)構(gòu)的CA1、CA3、DG三個亞區(qū)，并且針對數(shù)量眾多，分布更為廣泛的神經(jīng)膠質(zhì)細胞及其作用靶區(qū)的特異性進行研究。

AS是含量最多的一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞，GFAP是AS中的特征性標(biāo)志物，可以反映AS的成熟度和活化狀態(tài)[8]。Czéh等[9]研究表明，受到慢性社會心理應(yīng)激后, AS的數(shù)量和細胞容量可下降25%。在母愛剝奪的大鼠應(yīng)激模型和慢性不可預(yù)測溫和多相應(yīng)激模型中，海馬區(qū)GFAP的陽性表達明顯減弱[10]，海馬AS數(shù)量降低[11]。

然而，另有報道[12]認為，AS并不全是積極作用，亦可能發(fā)揮消極作用，會因損傷的性質(zhì)、程度和時間不同而不同?？梢灾苯赢a(chǎn)生Ab并促使其沉積，加劇Ab誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，參與Ab誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化[13]。本研究中，經(jīng)過2周慢性束縛應(yīng)激后的小鼠海馬CA1、CA3區(qū)AS的數(shù)量及GFAP的表達均顯著增加，說明AS出現(xiàn)活化，而且影響了神經(jīng)元的正常功能。有文獻報道[14]，水腫的釋放、調(diào)節(jié)毒性水中當(dāng)AS發(fā)生活化時，與其共培養(yǎng)的神經(jīng)元產(chǎn)生突觸連結(jié)的數(shù)量明顯降低，GFAP 基因敲除的小鼠會出現(xiàn)神經(jīng)突向外生長的增加[15]。這些負性作用可能與炎癥反應(yīng)的激活、細胞毒素的釋放、調(diào)節(jié)毒性水腫、影響神經(jīng)元再生等有關(guān)[16]。

同時, 本研究表明, 長期CRS對小鼠海馬不同亞區(qū)AS及GFAP的影響具有區(qū)域性, 各亞區(qū)的活化情況不同，DG區(qū)的AS數(shù)量和GFAP表達無顯著變化, 而CA1、CA3區(qū)比DG區(qū)顯著增加, 可能是前者對于此種形式的應(yīng)激方式更加敏感，也有可能是DG區(qū)出現(xiàn)一過性活化后已趨于穩(wěn)態(tài)或發(fā)生可逆性變化。AS的活化情況與選擇的時間點和不同的應(yīng)激方式均有關(guān)，膠質(zhì)細胞的另外兩種類型小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的變化也可能參與了其中的改變，相關(guān)的機制均需在后續(xù)研究中深入探討。

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Impacts of Chronic Restraint Stress on Cognitive Function and Astrocytes in Different Subregions of Hippocampus in Mice

WANG Yan-yong, ZHANG Zhong-xia, SUN Mei-yu, WANG Ming-wei
(1. Department of Neurology, The First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, China; 2. Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, China)

[Abstract]Objective To explore the impact of chronic restraint stress (CRS) on the cognitive function of mice, and observe the activation of astrocyte (AS) in different subregions of hippocampus (CA1, CA3 and DG), thus to make clear whether the damage of chronic stress in hippocampus has specific targets. Methods According to the body mass, 24 male Kunming mice were randomly divided into control group and stress group, with 12 mice in each group. A chronic stress model of mouse was established by using chronic restraint method. The cognitive function was evaluated by novel object recognition test (NORT) and Morris water maze (MWM), cell morphology changes were observed by HE staining, while the glial fibrillary acidic protein (GFAP) as marker of AS in hippocampal CA1, CA3 and DG areas were observed by immunohistochemistry staining. The AS number and GFAP expression in subregions of hippocampus were counted and analyzed by using the microscope and image analysis software respectively. Results Compared with the control group, the NORT and MWM scores of stress group were both decreased significantly (P<0.05), AS numbers and GFAP expression in CA1, CA3 areas were both significantly increased (P<0.05), and in DG area there was no significant changes (P>0.05). Conclusion CRS could lead to cognitive dysfunction in mice, and the activation of AS in hippocampus CA1, CA3 regions may be one of the mechanisms.

[Key words]Chronic restraint stress (CRS); Hippocampus; Astrocyte (AS); Glial fiber acidic protein (GFAP)

[中圖分類號]R743 Q95-33

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1674-5817(2016)03-0168-06

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.002

[收稿日期]2016-01-19

[基金項目]河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃重點基礎(chǔ)研究項目(14967725D)

[作者簡介]王彥永(1976-), 男, 碩士, 副主任醫(yī)師, 副教授。E-mail: wyong7673@sohu.com

[通訊作者]王銘維。E-mail: mwwang2007@hotmail.com