雌激素灌胃法制備豚鼠子宮肌瘤模型

張玥晗, 文 靜, 朱海桃, 趙光宗, 李曉愚(重慶醫科大學. 0級臨床一系; . 0級臨床二系; . 實驗教學管理中心, 重慶 40)

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雌激素灌胃法制備豚鼠子宮肌瘤模型

張玥晗1, 文 靜1, 朱海桃1, 趙光宗2, 李曉愚3
(重慶醫科大學1. 2012級臨床一系; 2. 2013級臨床二系; 3. 實驗教學管理中心, 重慶 401331)

[摘要]目的 用雌激素灌胃法制備豚鼠子宮肌瘤模型, 探討不同劑量及給藥周期對子宮肌瘤形成的影響。方法 性成熟雌性豚鼠分為短周期組和長周期組，分別每周2次灌胃戊酸雌二醇(補佳樂)0.1 mg/100 g體質量6周和8周。空白對照組灌胃相同體積生理鹽水。灌胃結束后，ELISA法測定血清中雌二醇及孕酮水平; 計算肌瘤形成率、子宮臟器系數; 子宮組織制作石蠟切片，檢測子宮肌瘤模型是否成功建立。結果 短周期模型組成瘤率30%，長周期模型組成瘤率40%，總體成瘤率35%。血清學檢測顯示模型組動物血清雌激素水平明顯增高，孕激素水平下降; 病理組織學檢測證實造模成功。 結論 雌激素灌胃法是一種簡單有效的豚鼠子宮肌瘤模型造模方法。

[關鍵詞]子宮肌瘤; 豚鼠; 雌激素; 灌胃法

子宮肌瘤是女性生殖系統中最常見的良性腫瘤，約占女性所有良性腫瘤的51.87%，育齡期婦女高發，其發病率可高達77%，且呈逐年上升趨勢, 嚴重危害女性身體健康[1,2]。子宮肌瘤的發生、發展與體內性激素關系密切，但目前該病的病因和發病機制尚未完全闡明。建立子宮肌瘤動物模型是研究其發病機制和篩選治療藥物的常用手段。國外多采用自發子宮肌瘤的Eker大鼠模型，成瘤率高但價格昂貴[3]; 此外還有利用基因工程技術構建的轉基因小鼠模型、在免疫缺陷動物體內移植人類子宮肌瘤組織建立的異種移植動物模型等[4,5]。這些方法各有優勢, 但操作復雜, 對實驗室及其配套設備要求較高。國內多采用外源性性激素注射法建立子宮肌瘤模型，包括單一雌激素誘導法(單模法)[6]、雌激素孕激素聯合誘導法(雙模法)[7]、去勢后雌激素誘導法[8]等。用于外源性性激素注射的國內產品有苯甲酸雌二醇注射液和戊酸雌二醇注射液，但近年來該產品陸續停產，難以購買，臨床上也已廣泛采用雌激素口服制劑進行相關疾病的治療。近年有些研究項目組改用獸用雌激素注射液進行子宮動物模型建立，結果成瘤率低，造模效果不好[9]。為適應國內目前實驗條件，需建立一種簡便易行、行之有效的子宮肌瘤模型建模方法，本文探討用目前臨床上常用的口服雌激素藥物戊酸雌二醇，采用灌胃法建立豚鼠子宮肌瘤模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雌性豚鼠 40 只, 重慶醫科大學實驗動物中心提供[SCXK-(渝)2012-0001]，體質量400± 20 g, 未經生育交配。飼養條件: 室溫22±2 ℃, 相對濕度 50%～70%, 自然通風, 光照12 h, 黑暗12 h,每籠5只。以清潔級豚鼠飼料和凈化水飼養, 自由攝食和飲水，每日每只豚鼠給予100 g卷心菜補充維生素C。實驗前，動物先適應性飼養1周[SYXK-(渝)2012-0001]。

1.2 材料和儀器

戊酸雌二醇(商品名: 補佳樂, Delpharm Lille S.A.S生產，國藥準字20130009)，建模劑量參考Fujii 等[10]的方法，計算出每只豚鼠所需補佳樂劑量，將藥物研磨至粉狀后溶于無菌生理鹽水，配置終濃度為0.1 mg/mL，在振蕩器上充分震蕩混勻后制成混懸液備用。檢測雌二醇(E2)和孕酮(P)的ELISA試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司。酶標儀(南京華東電子); 組織切片機(杭州科迪); 生物組織脫水機(中威TSJ-SD)。

1.3 方法

1.3.1 造模 將40只豚鼠隨機分為4 組, 每組10只。短周期和長周期模型組，每只豚鼠分別按體質量100 g灌胃戊酸雌二醇懸濁液1 mL，每周2次，連續6周和8周; 同時設短周期和長周期對照組，同法灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 檢測項目 短周期模型組和對照組豚鼠6周后處死, 長周期模型組和對照組豚鼠8周后處死。處死前所有豚鼠于眶動脈取血1 mL, 3 000 r/min離心10 min 分離血清, ELISA法測定血清E2和P含量。

處死后豚鼠立即稱重，然后解剖觀察子宮與肌瘤形態。將子宮完整剪下并稱重，計算肌瘤形成率和子宮臟器系數 (子宮重量/體質量×100%)。子宮組織用體積分數10%甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理組織改變。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 豚鼠子宮肌瘤形成

短周期模型組有3只豚鼠造模成功，肌瘤形成率30%。肉眼可見造模成功豚鼠子宮體積增大、色澤晦暗、肌層增生，個別動物于子宮角處出現肌瘤樣結節，1～3個不等。造模期間死亡1只，死亡率10%，死亡原因為肺部感染。長周期模型組造模成功4只，肌瘤形成率為40%。其子宮形態改變較短周期模型組更為明顯，體積明顯增大、腫脹明顯。造模期間死亡3只，死亡率30%，其中2只死于肺部感染，1只死因不明。2組對照組動物子宮體積無增大、質地均勻、無結節或囊腫生長。其中長周期對照組死亡1只，死亡率10%。

2.2 子宮重量和子宮臟器系數

長周期和短周期模型組與相應的對照組比較,子宮重量、子宮臟器指數均明顯增加(P<0.05)(表1),說明造模成功。

表1 雌激素對豚鼠子宮重量和臟器系數的影響Table 1 The changes of uterine weight and organ coefficient after estrogen injection

2.3 血清E2、P含量

與相應對照組比較, 模型組血清E2含量均明顯增高(P<0.01), 說明造模成功。長周期模型組P含量低于對照組(P<0.05)(表2)。

2.4 病理組織學觀察

HE染色顯示, 正常豚鼠子宮平滑肌肌層較薄，平滑肌細胞排列整齊，肌纖維細長，流水樣排列(圖1A)。長周期模型組豚鼠子宮壁增厚，平滑肌細胞增生、增粗、排列紊亂。部分平滑肌細胞互相交錯，呈編織樣排列，細胞核肥大、深染，增生活躍，病變與人體平滑肌瘤樣增生相似(圖1B)。

表2 豚鼠血清E2、P含量Table 2 The serum E2 and P levels in guinea pigs

3 討論

人類疾病動物模型是研究疾病發病機制、臨床藥物篩選的重要手段，建立適宜的動物模型是人類疾病研究的重要基礎。

A: 對照組 B: 模型組圖1 豚鼠子宮平滑肌組織學觀察(HE×40)A: control group B: model groupFigure 1 Histological observation on uterine smooth muscle in Guinea pig

子宮肌瘤動物模型建立方法多種多樣，各有優缺點。Eker大鼠是自發性子宮肌瘤動物模型，其Tsc-2等位基因突變, 導致Tsc-2基因功能缺陷, 從而自發形成包括子宮肌瘤在內的一些良惡性腫瘤[11]。Everitt等[12]報道，雌性未妊娠Eker大鼠自發子宮肌瘤的發生率為65%。轉基因小鼠子宮肌瘤模型是通過抑制子宮肌層中SV40 標記基因的表達而建立[13],方法是在轉基因小鼠切除卵巢后，每日給予乙烯雌酚(100 mg/kg) 連續15 d后，通過組織病理學觀察可見子宮肌層平滑肌細胞增生形成渦旋狀肌束，組織形態學上與人類子宮肌瘤相似、并發生雌激素依賴性的子宮肌瘤。子宮肌瘤異種移植動物模型則是在免疫缺陷動物體內移植人源性子宮肌瘤組織而建立，其優點是成瘤率高，肌瘤結構與人類相同。Ishikawa等[14]在非肥胖糖尿病重癥聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的腎包膜下移植人子宮肌瘤組織，結果正常子宮肌層組織和子宮肌瘤組織的成活率接近100%，且異種移植瘤保留了原組織的組織學特征，是目前成瘤率最高的子宮肌瘤動物模型造模方法。雖然以上方法均可成功建立子宮肌瘤動物模型，但操作方法比較復雜，對實驗室條件要求高，費用比較昂貴。

陳海剛等[15]通過給予雌性未妊娠SD 大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液200 mg和300 mg每周2次, 持續8 周和10周, 結果顯示200 mg劑量8周組成功建立了與人子宮肌瘤相似的子宮肌瘤模型。鄒小麗等[16]給雌性未妊娠SD 大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg, 連續30 d, 每周1 次黃體酮(4 mg/kg), 25～30 d兩種激素同時注射，結果顯示造模成功。

本研究探討用目前臨床上常用的口服雌激素藥物戊酸雌二醇(補佳樂)作為外源性雌激素，通過灌胃的方法建立豚鼠子宮肌瘤動物模型造模。結果表明，0.1 mg/100g體質量劑量下，每周2次口服灌胃，6周即可成功建立子宮肌瘤動物模型，8周成瘤率進一步提高，但動物死亡率上升，且剩余存活動物的一般情況、進食狀態和精神狀態均變差。兩個模型組共20只動物中，建模成功7只，總體成瘤率35%，與文獻報道的雌激素注射法成模率(27%～41%)相近[17,18]。血清學檢測顯示，長、短周期模型組動物E2水平均明顯高于對照組，說明補佳樂混懸液能夠有效提高動物體內雌激素水平。隨著時間延長，孕激素水平逐漸降低，可能與體內性腺軸負反饋抑制有關。與雌激素注射建模法相比，采用雌激素藥物灌胃法建立子宮肌瘤動物模型，具有藥物來源廣泛、建模時間短、經濟等優點。李東華等[19]報道，雌孕激素協同造模過程中，初期可能出現大鼠活動減少、精神欠佳、生長緩慢、易激惹甚至出現脫毛、四肢炎性腫塊等現象，但本研究中未見類似表現。本研究中出現動物死亡的情況，死因多為肺部感染，是否與灌胃操作不當有關，尚需進一步探討。此外，由于本研究選用的補佳樂為進口藥物，其配方受控保密，無法查到藥物填料成分，所以本研究未設立藥物填料陰性對照組，藥物填料對實驗結果的影響還需做進一步研究。

綜上，雌激素灌胃建立子宮肌瘤模型，成瘤率與注射法接近，模型豚鼠病理學改變與人平滑肌瘤樣增生相似，是一種有效的動物模型造模方法，可用于子宮肌瘤發病機制、治療方法研究。

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Intragastric Estrogen Administration Induced Guinea Pig Model of Uterine Leiomyoma

ZHANG Yue-han1, WEN Jing1, ZHU Hai-tao1, ZHAO Guang-zong2, LI Xiao-yu3
(1. 2012 No.1 Clinical Department, 2. 2013 No.2 Clinical Department, 3. Experiment Teaching Center, Chongqing Medical University, Chongqing 401331, China)

[Abstract]Objective To establish the guinea pig model of uterine leiomyoma by intragastric administration of estrogen and to discuss the effect of different cycles of administration on formation of uterine leiomyoma. Method Mature female guinea pigs were divided into short term group and long term group, and intragastric administrated with estradiol valerate at 0.1 mg/100 g body weight twice a week for 6 weeks and 8 weeks respectively. The control was intragastric administrated with normal saline with same volume. After 6 or 8 weeks, the guinea pigs were sacrificed. The serum levels of estrogen and progesterone were measured by ELISA and the leiomyoma forming rate was measured. Histological changes were compared between treatment group and control group with HE staining. Results The leiomyoma forming rate in short term group was 30% and long term group was 40%. The average total rate was 35%. The serum level of estrogen in model animals was increased significantly and the progesterone decreased in long term group. Histopathological examination confirmed that the guinea pig model of uterine leiomyoma were established successfully. Conclusions Intragastric estrogen administration was a simple and effective method for establishing uterine leiomyoma guinea pigs model. [Key words] Uterine leiomyoma; Guinea pigs; Estrogen; Intragastric administration

[中圖分類號]Q95-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-5817(2016)03-0195-05

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.007

[收稿日期]2016-01-25

[基金項目]重慶市大學生創新創業計劃項目201410631021;重慶醫科大學大學生科學研究與創新實驗項目201423

[作者簡介]張玥晗(1994-), 重慶醫科大學2012級臨床一系本科生。E-mail: 824025990@qq.com

[通訊作者]李曉愚(1976-), 39歲, 男, 博士研究生、講師, 主要從事病原生物學研究工作。E-mail: penet@qq.com