tuftsin及其衍生物T肽的抗癌作用研究進展

安映紅，袁守軍

(1.空軍總醫院臨床檢驗中心生化室，北京　100142；2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理室，北京　100850)

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tuftsin及其衍生物T肽的抗癌作用研究進展

安映紅1,2，袁守軍2

(1.空軍總醫院臨床檢驗中心生化室，北京100142；2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理室，北京100850)

摘要：tuftsin是機體脾臟產生的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬細胞和粒細胞，提高促吞噬的能力；其對腫瘤細胞并沒有直接殺傷效應，但可以通過增強效應細胞的細胞毒功能殺傷腫瘤細胞，在抗感染和抗腫瘤方面具有不可替代的作用。但由于其肽鏈短、易被水解的特性，至今難以成藥而應用于臨床。tuftsin的系列衍生物以及與其他藥物聯用卻可提高其抗癌活性，具有廣闊的研究前景；尤其是衍生物T肽具有明顯的抗腫瘤作用，其作用機制基本明確，可望成為新型抗腫瘤生物反應調節劑。

關鍵詞：tuftsin； T肽；生物抗癌；中性粒細胞；巨噬細胞；生物反應調節劑

tuftsin是1970年Najja和Nishioka研究淋巴細胞激肽的生物功能時發現的一段生理活性肽，由脾臟產生，結構為蘇-賴-脯-精氨酸(Thr-Lys-Pro-Arg，TKPR)[1-2]。陸續的研究證明該肽具有天然的促吞噬作用，能夠促進天然免疫細胞：巨噬細胞和中性粒細胞的趨化、游走、吞噬和細胞毒作用，發揮明顯的抗腫瘤、抗病毒活性，具有獨特的靶向天然免疫細胞的調節功能[1]。然而由于其較短的肽鏈及體內半衰期使得其至今難以成藥并應用于臨床。因此多種擬tuftsin衍生物被研發以期解決這一難題，也一度成為研究的熱點。本文主要對tuftsin的生物特點、衍生物研究進展進行綜述，并重點闡述tuftsin衍生物之一，T肽在術后殘瘤模型中的應用價值。

1體內tuftsin的生物活性特點

tuftsin的分子質量為500.59，是免疫球蛋白IgG的Fc段在脾臟降解產生的四肽，其作用方式較為廣泛[1,2]。tuftsin最基本的功能就是促吞噬和調節免疫功能[1]，可促進中性粒細胞、枯否細胞的增殖及吞噬作用，刺激白細胞胞飲、遷移；明顯增強巨噬細胞對病毒微生物的作用[1]。tuftsin還可促進炎性細胞因子釋放及體內再分布[3]。在升高血壓、情緒調節、提高智力、抗焦慮、止痛及加快神經移植后修復方面，tuftsin都有一定的作用，尤其在抗腫瘤方面有較強活性，如：對L1210白血病具有明顯的免疫抗癌活性[4]。血清的tuftsin水平可以反映脾臟的免疫功能，從而間接反映腫瘤患者或者有腹腔臟器疾患的機體免疫狀況，其低血清濃度與嚴重的感染發生高度相關[5]。脾功能損害的病人血清tuftsin水平會下降并導致中性粒細胞的活性降低，增加感染發生率[5]；對狗或人切除了脾臟后，會造成白細胞吞噬活性明顯降低[6]。而且，tuftsin以及其衍生物還能影響一些細胞因子，如TNF和IL-10、IL-17等[7-8]的表達；tuftsin還是免疫球蛋白來源的新型生物活性肽，在調節免疫反應中具有重要的作用。tuftsin的這些生物功能的發揮是通過特異性地結合到細胞表面受體實現的。巨噬細胞、中性粒細胞等細胞表面都有tuftsin受體特殊的結合位點。1989年，Moore等[9]鑒定出tuftsin的一個能與神經降壓肽(neurotensin)結合的受體位點。2006年,Mathew等[10]研究發現，神經菌毛素(neuropilin 1,NRP-1)也為tuftsin的受體之一，他們認為tuftsin與NRP-1結合，影響TGF-β信號通路；tuftsin還可與VEGF165競爭性結合NRP-1，從而阻斷VEGF165與其受體的結合，阻止腫瘤血管生成[10]。

2tuftsin 及其衍生物的應用

tuftsin 的廣泛生物學作用激起研究者對其生物學應用不斷開發的興趣。但在二期臨床研究中發現靜脈給藥tuftsin對早期惡性腫瘤病人的治療作用非常有限[11]。不過與化療藥聯合使用效果明顯，如對非小細胞肺癌的治療[12]，以及使頭頸部腫瘤術后NK細胞的活性恢復[13]等。實際上，由于tuftsin的肽鏈非常短，導致在體內的半衰期很短，進入機體后由于蛋白酶水解，難以發揮生物學作用。近十幾年來tuftsin的單獨應用研究已經非常少見。通常研究者以tuftsin結構為基礎，合成一些衍生物來進行研究，在抗微生物感染、抗病毒及抗腫瘤應用上取得過較好的研究結果。在抗微生物感染方面，Smith 等[14]將慶大霉素與tuftsin連接用于治療銅綠假單胞菌引起角膜炎，有良好的效果。

tuftsin衍生物還可抗寄生蟲感染，如Thr-Lys-Pro-Arg-NH-(CH2)2-NHCOC15H31能夠治療瘧原蟲感染的小鼠[15]；tuftsin與米替福新連接，可增強米替福新對內臟利士曼原蟲的療效[16]；tuftsin與制霉菌素脂質體連用具有治療患白細胞減少BALB/C小鼠的新型隱球菌感染[17]。在制備疫苗方面，研究者將分支狀流感病毒M2e與tuftsin連接成多肽疫苗能更好地刺激機體免疫反應[18]。Fridkin等[19]將3′-疊氮基-3L脫氧胸苷(AZT)連接到HIV感染的巨噬細胞上，在其表面形成AZT與tuftsin的結合，具有治療AIDS的潛力。抗腫瘤方面也有多種應用，如使用抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibodies,Ab2) ,與tuftsin連接后形成的融合蛋白能模擬CA125的功能，對患宮頸癌的小鼠免疫功能產生保護作用[20]。

但幾乎所有的tuftsin相關的研究均沒有后續更深層次的探討。TP(T peptide)是近年來研究較為深入的一個tuftsin的新型衍生物，大量實驗證據表明TP具有明顯、廣泛的抗癌活性[21-24],并能夠調節細胞的免疫抑制狀態[25]。下述著重介紹TP近年來的研究應用。

3tuftsin 衍生物TP的抗癌研究

基于tuftsin肽鏈短，難以成藥的特點，本研究團隊對tuftsin短肽進行修飾，以分子質量小，免疫原性弱的賴氨酸為核心，合成了新結構的tufsin分支肽(synthetic tuftsin branched polypeptide,TP)。TP擁有4個tuftsin樣結構(Fig 1)，體內藥物代謝研究表明，該結構在體內半衰期約2～4 h[26]，與原tuftsin四肽相比(T1/2=2.8 h)[27]明顯增加了對水解酶的抵抗能力。體外實驗研究表明,TP明顯增強巨噬細胞對腫瘤細胞殺傷活性，并且對多種腫瘤細胞具有較強的殺傷力，如小鼠惡性黑色素瘤細胞B16-F10及人肺癌細胞A549[24]。TP還能促進小鼠巨噬細胞Ana-1細胞大量分泌TNF-α和 NO，而且給予TP的小鼠外周血中TNF-α和 NO 的含量也明顯升高，TNF-α的含量為92.45±0.12，是正常對照組的1.67倍，模型對照的1.47倍；NO的含量為85.99±4.4，是正常對照組的2.54倍，未手術模型對照的2.20倍，手術模型對照的1.45倍[24]。這些數據充分說明，TP能明顯增強機體免疫力并提高機體免疫系統對抗腫瘤的能力。但是這個新結構的藥物應用于動物體內時，使用常規的動物移植瘤模型，卻并未體現出良好的藥效[23-24]。那么，為什么TP在體外能增強巨噬細胞的促吞噬、細胞毒活性，卻不能在體內殺死實體腫瘤細胞，值得研究者進一步思考。

Fig 1　TP structure：Four tuftsin peptides are connected via a flexible linker lysine

臨床中所見的腫瘤大多數為實體瘤，實體瘤具有抗原性弱，抗原遞呈功能降低，并釋放大量免疫抑制因子，致使機體免疫功能低下，免疫漏逸等的特點，手術切除是目前治療實體瘤的首選模式。 但外科手術實際上僅僅能切除肉眼可見的腫瘤原發灶或轉移灶，一些微小病灶及顯微鏡可見的易播散的癌細胞卻很難被發現。而且手術過程中還能激發大量不良因子產生，刺激癌細胞入血，從而發生遠端轉移。在荷S180小鼠肉瘤的異種移植瘤模型中，可以觀察到手術后殘瘤迅猛生長，生長速度超過未手術組10倍以上[24]，盲目采取手術切除腫瘤，很可能加快腫瘤的轉移和復發。手術切除了大部分的實體瘤，減輕腫瘤負荷。但是接下來，用以防止腫瘤復發為目的的輔助治療，要克服的最重要的難題是如何選擇性的殺死殘余癌細胞而不破壞健康的正常細胞。手術后的放化療在清除了大部分腫瘤病灶的同時，也導致機體的免疫機能進一步惡化，往往伴隨免疫細胞數量、質量大大下降，甚至產生免疫抑制。調節機體免疫狀態，控制或者延緩術后癌癥患者的復發，可成為臨床癌癥治療的重要模式。

因此，依據當前術后腫瘤的治療模式，本研究團隊認為：將TP應用于術后提高機體免疫力，預防癌癥復發的層面上可能會有較好的效果。而理想的動物腫瘤模型應該能模擬并真實地反映人類腫瘤自然發生、發展的過程，體現與之有相同病理、生理的特征。因此，通過大批動物實驗摸索建立了動物術后殘瘤模型。應用該模型，研究團隊發現TP對S180肉瘤、H22肝癌腹水瘤、Lewis肺癌、B16-BL6黑色素瘤等4種鼠源移植瘤以及HT-29結腸癌、HepG2肝癌、MCF-7乳腺癌、BGC-823胃癌等4種人源移植瘤手術后的殘瘤生長具有明顯的抑制作用，最高抑制率可達到80%；對于免疫缺陷小鼠的殘瘤生長抑制率稍有下降但也能達到50%左右。可見對于這種免疫增強類藥物，要想使免疫細胞能發揮出看得見的明顯作用，特殊的動物模型設計非常重要，而且腫瘤微環境可能是TP在殘瘤機體發揮作用的關鍵原因。中晚期的癌癥患者機體免疫力是受到深度抑制的，腫瘤塊內的微環境為腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等提供保護作用，腫瘤細胞在不斷逃脫機體的免疫監視而存活并不斷生長最終形成實體瘤。因此，此時無論用藥物怎樣刺激免疫細胞都可能無法讓免疫細胞接近、有效識別腫瘤細胞并剿滅腫瘤細胞。而手術后的殘瘤微環境中腫瘤細胞、免疫細胞暴露，微環境外活化的免疫細胞就有機會直接接觸腫瘤細胞，從而產生吞噬或細胞毒作用。本課題組又使用現已應用于臨床的胸腺肽做了類似的實驗，結果也驗證了上述結論，但效果遠不及TP[25]。所以殘瘤模型的建立可以說為一大類增強免疫功能的藥物提供了一種新的評價模型，有助于更多此類藥物的研發。

4TP的抗癌作用機制研究

正常小鼠免疫系統功能包括：獲得性免疫功能，執行者如T淋巴細胞和B淋巴細胞等；天然免疫功能，執行者如NK細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等。TP不僅可以明顯抑制小鼠移植瘤術后殘瘤的生長，而且對免疫缺陷的小鼠，如裸鼠、SCID和NOD-SCID也有較明顯的抑制率，抑制作用雖有所下降但仍能保持50%左右的抑制率，可見天然免疫系統在TP抗癌過程中發揮主要的作用。

tuftsin的基本功能是促吞噬，主要效應細胞是天然免疫細胞：巨噬細胞(macrophages， MΦ)和中性粒細胞(neutrophils，Nc)[1-2]。在抗腫瘤免疫調節過程中巨噬細胞是一群重要細胞，可直接或者通過遞呈腫瘤相關抗原誘導機體免疫應答殺傷腫瘤細胞。腫瘤間質中存在的腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAM)在腫瘤微環境的調控下可以變換表型，演變為抑制腫瘤生長的M1型和促進腫瘤進程的M2型。研究發現，TP可結合巨噬細胞表面特異性抗體，激活 NF-κB 信號通路，增強巨噬細胞的吞噬、細胞毒功能，同時介導巨噬細胞向 M1 型極化，促使分泌 Th1 相關的促炎因子，如 TNF-α、IL-12、NO、IFN-α/β以及趨化因子CXCL9、CXCL11 等[24-25]。TP還可逆轉 M2 巨噬細胞的表型，促使 Th1 相關炎性細胞因子表達增加。體外 IL-4 誘導的Ana-1 巨噬細胞M2 巨噬細胞代表基因 Arg-1表達下調，M1 巨噬細胞代表基因 iNOS、IL-12轉錄水平和蛋白水平表達上調，明顯 M2 極型被扭轉[24-25]。可見調節巨噬細胞通路是TP發揮抗癌作用的機制之一。

后續又研究了TP調節另一個重要的靶細胞——中性粒細胞的功能所發揮抗癌作用。中性粒細胞作為非特異性免疫細胞的作用越來越受到科學界的重視。不只是與炎癥相關，如絲氨酸蛋白酶等參與炎癥反應[28]，而在腫瘤生物學中也起重要作用，類似于巨噬細胞的調節作用。陸續的研究證明，TP也能調節腫瘤相關中性粒細胞(tumor associated neotrophils，TAN)向抑制腫瘤生長的表型N1型極化。而對tuftsin類衍生物能夠通過這兩大類天然免疫細胞發揮抗癌作用的研究國內國外還都沒有過報道。

綜上所述，研究者們通過大量的實驗研究證明，TP通過誘導機體外周的未被活化的巨噬細胞或中性粒細胞發生抑制腫瘤生成的表型極化，釋放殺傷性細胞因子，增強細胞毒功能，在殘瘤微環境中發揮明顯抗癌效應，由此來改變機體的整體免疫狀態，增強對抗癌癥的能力。

對于TP抗癌藥效及作用機制的研究，不僅奠定了TP新藥物申報的基礎，也為進一步研發同類免疫增強藥物提供可供借鑒的動物模型及方法。

5展望

腫瘤就是在不斷的逃脫機體免疫系統的監視而形成的，提高機體的免疫力可成為預防癌癥發生及復發的最有效方法。目前腫瘤的免疫治療方法多樣，如過繼免疫療法(adoptive immunotheray)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)療法、細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killers，CIK)等，但療效有限，副作用很大，那么最安全有效的方法還應該能尋找到直接有效的提高癌癥患者的自體免疫力藥物，不需要繁雜的體外培養，不需要移植。現有的證據表明，免疫細胞殺死癌細胞的數量可能需要超過癌細胞一個數量級以上，因此對于中、晚期惡性腫瘤病人，腫瘤負荷達到幾百克至上千克，腫瘤細胞數量達到數十萬億計，用免疫細胞殺死如此眾多的癌細胞是不太可能的。在手術之后，使用一些藥物直接活化體內的免疫細胞，并用于治療殘余腫瘤，預防殘余腫瘤復發，延長生存期比較現實可行，TP等類藥物也許是最具這種輔助治療潛力的免疫治療藥物。但tuftsin類衍生物(如TP)能夠進入臨床試驗還需要對其分子機制進行更深層次的研究。

(致謝：本綜述中所介紹到的實驗均在軍事醫學科學院放射醫學研究所腫瘤藥理研究室完成。感謝李琳娜、王珊珊、楊德宣、郭萬軍、宣自學等人的協助。)

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Research progress on anti-cancer effects of tuftsin and its derivatives

AN Ying-hong1，2,YUAN Shou-jun2

(1.CenterforClinicalLaboratory,AirForceGeneralHospital,PLA,Beijing100850,China;2.DeptofPharmacologyandToxicology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,China)

Abstract:tuftsin, a physiologically active peptide, can promote phagocytosis, basically stimulates the macrophages or neutrophils and improve their phagocytotic function. tuftsin can not directly kill tumor cells. Due to its short structure and the characteristics of being susceptible to hydrolysis, it is difficult for tuftsin to be made into medicine and applied clinically. However, derivatives of tuftsin-series and combination of tuftsin with other drugs can greatly enhance the cytotoxic effect on tumor cells of tuftsin. It has a broad prospect of research, especially derivative-TP has a significant anti-tumor effect. Its mechanism is clear and its is expected to become a new type of anti-tumor biological response regulator.

Key words:tuftsin；T peptide；biological anticancer； neutrophils,；macrophages；biological response modifier(BRM)

收稿日期:2016-01-06,修回日期:2016-02-14

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 30973564); 國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項綜合新藥研究開發技術大平臺項目(No 2012ZX09301003-001)

作者簡介：安映紅(1980-)，女，博士，主治醫師，研究方向：腫瘤藥理學，Tel:010-66928545,E-mail:rainning_sky@163.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.002

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0747-04

中國圖書分類號：R-05；R341.6；R730.5；R977.6

網絡出版時間：2016-5-25 15:39網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.004.html

◇講座與綜述◇

袁守軍(1962-)，男，博士，研究員，博士生導師，研究方向：腫瘤藥理學，通訊作者，E-mail:yuansj@nic.bmi.ac.cn