丹參素衍生物對斑馬魚促血管新生作用的研究

崔國禎，徐燕玲，孫安露，單璐琛，王玉強，李銘源

(1. 遵義醫學院珠海校區生物工程系，珠海市中藥基礎及應用研究重點實驗室，廣東 珠海　519041;2. 澳門大學中華醫藥研究院中藥質量研究國家重點實驗室，澳門　999078; 3. 暨南大學藥學院新藥研究所，廣東 廣州　510632)

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丹參素衍生物對斑馬魚促血管新生作用的研究

崔國禎1,2，徐燕玲2，孫安露1，單璐琛3，王玉強3，李銘源2

(1. 遵義醫學院珠海校區生物工程系，珠海市中藥基礎及應用研究重點實驗室，廣東 珠海519041;2. 澳門大學中華醫藥研究院中藥質量研究國家重點實驗室，澳門999078; 3. 暨南大學藥學院新藥研究所，廣東 廣州510632)

摘要：目的觀察丹參素衍生物(ADTM)對斑馬魚胚胎血管新生的影響，并探討其可能作用的信號通路。方法選擇正常血管轉基因斑馬魚和血管生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRI)誘導血管損傷轉基因斑馬魚兩種模型，分別給予50、100、200 μmol·L-1的ADTM干預處理，以0.1%的DMSO為空白對照，分別觀察不同濃度的ADTM對斑馬魚腸下靜脈血管(SIVs)的直徑和內皮細胞數以及節間血管(ISVs)生長的影響，并對VRI和ADTM處理后的斑馬魚做轉錄組學研究。用熒光定量PCR的方法對轉錄組測序的4個基因進行驗證。結果>對于正常轉基因斑馬魚模型，ADTM處理后，斑馬魚的SIVs血管直徑明顯增加，內皮細胞的數目輕微增加；在VRI損傷模型中，ADTM表現出修復ISVs損傷的效果。轉錄組分析表明，19個明顯變化的基因富集在胰島素信號通路。熒光定量PCR的結果與轉錄組中獲得的序列吻合。結論對于正常和血管損傷的斑馬魚模型，ADTM均有促血管新生的效果，其作用機制可能與胰島素信號通路的激活有關。

關鍵詞：丹參素衍生物；血管新生；血管修復；斑馬魚；轉錄組；胰島素信號通路

川芎和丹參是我國傳統醫學中廣泛應用的中藥，我們的meta分析研究結果表明，丹參川芎注射液對心絞痛有良好的治療效果[1]，其中的主要成分丹參素(DSS)和川芎嗪(TMP)是預防或治療心腦血管疾病的活性物質。但是，這些中藥單體療效不強，且作用機制不明確，限制了其進一步的應用。為了提高丹參素的治療效果，充分發揮其藥效特色，我們對川芎嗪和丹參素進行了系統的化學結構修飾、藥效和作用機制研究。我們發現丹參素與活性分子川芎嗪偶聯修飾后得到的化合物ADTM(Fig 1A)[2]，其化合物的作用與臨床上用的藥物治療效果相似，但具有比臨床的藥物作用范圍更廣闊和毒性小等特點[3]。同時，本課題組尚未發表的實驗結果表明，ADTM在體內外對神經毒素6-羥基多巴胺誘導的帕金森綜合癥有明顯的保護作用。其次，利用化學蛋白質組學的方法，找到了該化合物的藥物作用靶點[4-5]。

斑馬魚是一種用來研究器官發育和疾病模型的常見模式生物之一，具有胚胎透明、可直接觀察內部器官、受試品用量少、篩選周期短和實驗操作簡便等獨特優勢。作為小型體內實驗動物模型，斑馬魚在分子水平上85%與人類相同，心血管系統早期發育極為相似。48 hpf(受精后小時)背動脈與軸靜脈形成簡單循環網，72 hpf功能性管脈系統形成，腸下靜脈血管(SIVs)呈現，在促血管新生藥物篩選方面得到廣泛的應用[6，7]。本研究用轉基因斑馬魚研究ADTM對血管新生的干預作用。

1材料與方法

1.1動物

血管轉基因斑馬魚Tg(fli1:EGFP)和Tg(fli1:nEGFP)購于國際斑馬魚資源中心，斑馬魚按照發表的方法飼養與繁殖[8]。這兩種轉基因斑馬魚分別在血管和血管的內皮細胞核表達綠色熒光蛋白。

1.2化合物

丹參素衍生物ADTM按照發表的文章合成(純度>98%)[2]；血管內皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRI)購于Calbiochem公司(貨號：676481)。

1.3動物分組與藥物處理

1.3.1ADTM對正常斑馬魚模型的影響選擇狀態良好，發育至48 h受精后的血管轉基因斑馬魚Tg(fli1:EGFP)胚胎，將其放入28.5℃培養基的12孔培養板中，每孔12個胚胎。以0.1%的DMSO為空白對照，以50、100、200 μmol·L-1的ADTM為藥物處理組。藥物作用48 h后，在熒光顯微鏡下觀察不同濃度ADTM對斑馬魚SIVs的影響(Fig 1B)。

1.3.2ADTM對VRI誘導血管損傷斑馬魚模型的影響選擇狀態良好、發育至22 h的血管轉基因斑馬魚胚胎，將其放入28.5℃培養液的12孔板中，每孔12個胚胎。預先加入VRI 300 nmol·L-1，在28.5 ℃培養箱內孵育3 h，用培養液洗3遍后，加入培養基繼續培養21 h后(此時，VRI處理后的斑馬魚，表現為SIV缺失)，分別加入50、100、200 μmol·L-1的ADTM為藥物處理組，以單獨加0.1% DMSO為空白對照組。培養48 h后，在熒光顯微鏡下觀察藥物對斑馬魚ISVs的影響。

1.3.3觀察方法按照本課題組發表的方法觀察血管生成情況，并進行定量分析[9-10]，用軟件AxiovisionLE 4.1測量隨機選取的3條斑馬魚的SIVs直徑(Fig 1C)。關于斑馬魚SIVs內皮細胞的數量的計算，采用直接計數的方法實現。在VRI誘導血管損傷模型中，我們將從主動脈(DA)或者脊椎主靜脈(PCV)發芽延伸并連接到背部脊索血管(DLAVs)的ISVs定義為完整血管(intact)，而一些已經從DA或者PCV延伸出，但是并無與DLAVs相連的ISVs定義為缺陷型血管(defective)，然后分別對每條斑馬魚的完整型和缺陷型血管進行統計分析。

Fig 1　Schematic illustration of experimental plan in normal zebrafish

A:Chemical structure of ADTM;B:A schematic illustration of drug treatment in normal zebrafish;C:Lateral view of vascular-specific transgenic zebrafish, the part indicated by dashed line represents SIV.

Fig 2　Effects of ADTM on diameters of zebrafish±s,n=12)

A: embryo treated with 0.1% DMSO at 24 hpf for 48 h;B～D: embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1ADTM, respectively;E:ADTM significantly increased SIVs diameter in a concentration-dependent manner.#P<0.05vscontrol group

1.4提取斑馬魚幼魚的總RNA

藥物處理后，用總RNA抽提試劑盒(RNeasy Mini kit, QIAGEN，德國)進行RNA提取，提取藥物處理組(VRI+ADTM)與模型組(VRI)各30條斑馬魚幼魚總RNA。質量鑒定合格后，進行斑馬魚幼魚轉錄組的測定。

1.5斑馬魚轉錄組的測定及其分析

參照本課題組前期報道的方法[11]，對斑馬魚的轉錄組進行測序和生物信息學數據分析。首先在Illumina Hi-2000基因組分析平臺上進行雙端測序；對末端RNA序列進行了配對，用Illumina基因組分析儀的fasta格式處理數據；用Cuffdiff軟件進行差異基因分析；在DAVID數據庫中對差異表達基因進行GO功能注釋、分析和KEGG pathway顯著性富集分析。

1.6斑馬魚轉錄組測序數據的驗證

為了驗證斑馬魚轉錄組測序數據的準確性，從轉錄組的基因表達譜中選取了4個基因(GSK-3β、BRAF、Sema3ab和IL1B)，按照報道的方法[11]，用RNA為模版，用隨機引物進行反轉錄，合成cDNA第一條鏈，然后設計特異性引物進行熒光定量PCR(qPCR)分析。

2結果

2.1ADTM對正常斑馬魚血管新生的影響

不同濃度藥物處理組斑馬魚胚胎48 h后，SIVs的直徑明顯增加，并呈現劑量依賴關系(Fig 2)。藥物處理組與對照組比較有統計學意義(P<0.05)，該結果初步表明ADTM具有促血管生成活性的作用。血管內皮細胞是構成血管的最主要的細胞之一，我們采用內皮細胞核轉基因斑馬魚研究ADTM對內皮細胞數量的影響。結果表明(Fig 3)，不同濃度藥物處理組斑馬魚胚胎48 h后，SIVs內皮細胞數量微弱增加，藥物處理組與對照組比較沒有統計學意義(P>0.05)。

2.2ADTM對VRI誘導血管損傷斑馬魚模型的恢復干預作用

VRI誘導血管損傷轉基因斑馬魚模型實驗(Fig 4)發現，VRI處理后，ISVs和SIVs以及DLAVs都出現了明顯的缺失。在不同濃度ADTM處理斑馬魚幼魚48 h后，顯示了明顯的修復ISVs的效果，而且對SIVs區域也有一定程度上保護效果，并呈濃度依賴性(Fig 5)。

2.3ADTM對斑馬魚促血管新生信號通路的調控

為了更深入地了解ADTM在斑馬魚內的促進血管新生的分子機制，我們通過轉錄組學的技術分析經過ADTM處理后，斑馬魚體內的基因表達水平的變化。由于血管新生是一個全身性、整體性的機體調節的過程，所以我們研究斑馬魚整體的基因表達的變化。本研究中，模型組(VRI組)和藥物處理組(VRI+ADTM)基因表達庫中，每個庫有核苷酸序列標簽的總數量為4.6～6.8百萬個。兩個庫中的核苷酸序列標簽對應VEGA數據庫，發現已有注釋的基因大約是2.1～3.2百萬個(約占整體的46%)。

Fig 3　Effects of ADTM on number of zebrafish SIVs endothelial±s,n=12)

A:embryo treated with 0.1% DMSO at 24 hpf for 48 h;B～D:embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1ADTM, respectively;E:ADTM slightly increased endothelial cells of zebrafish SIVs.

然后，我們通過DEGseq分析，得到兩組之間基因表達差異有顯著性(P<0.01)的有1 513個基因。KEGG pathway富集分析發現，胰島素信號通路富集最為明顯，19個明顯變化的基因(P<0.01)富集在該通路，結果見Fig 6，上調基因：Cb1、CrkⅡ、GRF2、INSR、IRS、P13K、FOXO1、GSK-3β、FBP、PHK、PKA、LAR、SOS、MNK；下調基因：GK、PEPCK、GYS、PP1、S6。文獻報道[12]，胰島素激活IRSR、PI3K和GSK-3β等可引起胰島素信號通路的活化，由此確定ADTM激活胰島素信號通路。

Fig 4　Schematic illustration of experimental plan on VRI induced vascular insufficiency in zebrafish

2.4用qPCR的方法對轉錄組測序數據的驗證

對挑選的4個關鍵基因(GSK-3β、BRAF、Sema3ab和IL1B)進行熒光定量PCR驗證。實驗結果表明(Tab 1)，4個基因的PCR結果變化趨勢與轉錄組中獲得的序列完全吻合，說明這4個基因確實在斑馬魚體內表達，并且斑馬魚轉錄組測序結果準確可靠。

3討論

血管創傷、缺血性心臟病、傷口愈合緩慢和閉塞性脈管炎等都是臨床常見病，是影響人類健康的重要因素之一，而血管生長不足則是這些疾病共同的重要病理生理基礎。因此，開展促血管新生作用的研究對諸多血管新生不足相關疾病的防治有著重要意義。我們先前建立的斑馬魚模型，用來評價藥物對斑馬魚血管生成的作用效果，其中特定增強型綠色熒光蛋白(EGFP)表達在內皮細胞，允許實時觀察血管系統體內動態變化的過程。斑馬魚憑借其獨特的優勢成為干預血管新生藥物篩選的理想模型。VRI是一種可以抑制血管內皮生長因子受體1-2的化合物，在抗血管新生和抗癌方面有潛在的開發價值[13]。用VRI來模擬血管新生功能缺陷的模型，具有靶點清晰、針對性強等優勢[8]。本研究以斑馬魚為模型，探討丹參素衍生物對斑馬魚正常血管新生的干預作用，以及對VRI損傷血管的修復效果。研究發現，ADTM處理48 h后，明顯增加正常斑馬魚的SIVs血管直徑，對VRI誘導的血管損傷有明顯的修復作用。以上結果表明，ADTM有促血管新生的作用。其次，轉錄組學研究表明，ADTM的促血管新生作用可能與胰島素信號通路的激活有關。

Fig 5　Effects of ADTM on VRI induced vascular insufficiency in±s,n=12)

A:Embryo treated with 0.1% DMSO at 48 hpf for 48 h;B: Embryo treated with 300 nmol·L-1VRI at 48 hpf for 48 h;C～E:Embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1ADTM, respectively before VRI exposure;F:ADTM restored VRI-induced vascular insufficiency in zebrafish.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsVRI group

轉錄組是特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉錄組測序(RNA-Seq)是最近發展起來的利用深度測序技術進行轉錄分析的方法，這種技術已經改變了我們對真核轉錄認識的程度和復雜性，與其它技術相比，RNA-Seq能更準確地測量哺乳動物轉錄水平[14]。我們的研究結果表明，ADTM的促血管新生作用可能與胰島素信號通路的調控有關。近幾年胰島素抵抗綜合征的發病率和死亡率在不斷增加，其中大部分是由于心血管疾病的影響而增加的風險[15]。文獻報道表明，血管內皮細胞是胰島素作用的重要細胞，胰島素在維持血管內皮正常功能中起重要作用。對胰島素耐受或血管內皮細胞功能紊亂進行治療，可以降低心血管疾病的病變和死亡率[16]。因此，ADTM通過激活胰島素信號通路，發揮促血管新生和血管修復的效果。

Tab 1　Comparison of fold change in expression of selected genes by transcriptome and qPCR

Fig 6　Analysis of insulin signaling pathway in gene expression profile of ADTM and VRI treated zebrafish

The insulin signaling pathway is overlaid with gene expression color criteria and ratios of gene expression from KEGG pathway: red triangle, significantly upregulated by ADTM(ADTM+VRvsVRI，P<0.01); blue triangle, significantly downregulated by ADTM(ADTM+VRIvsVRI，P<0.01); no triangle, not significantly changed or not detected.

綜上所述，ADTM對正常和血管損傷的斑馬魚模型，均有促血管新生的效果，其作用機制可能與胰島素信號通路的激活有關。ADTM表現出心臟保護、神經保護和促血管新生的藥理學作用，具有“腦心同治”的功效，其一藥多種功能的作用機制及其多種功能間是否存在共同的藥物靶點或信號通路，值得進一步研究和探索。

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Effect of Danshensu derivative on angiogenesis in zebrafish

CUI Guo-zhen1,2，XU Yan-ling2，SUN An-lu1，SHAN Lu-chen3，WANG Yu-qiang3，LI Ming-yuan2

(1.ZhuhaiKeyLaboratoryofBasicandAppliedResearchinChineseMedicine,DeptofBioengineering,ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,ZhuhaiGuangdong519041,China; 2.StateKeyLaboratoryofQualityResearchinChineseMedicineandInstituteofChineseMedicalSciences,UniversityofMacau,Macao999078,China; 3.InstituteofNewDrugResearch,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

Abstract:AimTo investigate the pro-angiogenic effects of Danshensu derivative ADTM and explore its underlying possible signaling pathway using zebrafish embryos asinvivomodels.MethodsThe angiogenesis activities of ADTM were determined in experimental models of normal and VEGFR tyrosine kinase inhibitor Ⅱ(VRI)-induced vascular defective zebrafish embryos. Embryos were treated with various concentrations(50，100，200 μmol·L-1) of ADTM for indicated time. The diameter and the numbers of endothelial cells of zebrafish SIVs were evaluated, respectively. In VRI model, the number of intact and defective ISVs in each zebrafish embryo was counted. The total RNA of zebrafish embryos was extracted and transcriptional profiling was analyzed by deep sequencing. Quantitative real-time PCR(qPCR) was performed to 4 genes selected from transcriptional profiling to validate the data collected from transcriptome analysis.ResultsADTM significantly increased subintestinal vessels (SIVs) diameter in a concentration-dependent manner in normal zebrafish as well as restored VRI-induced blood vessels defect in VRI-exposed zebrafish. The transcriptome data analysis demonstrated that 19 significantly changed genes were mapped to insulin signaling pathway.The qPCR data are in good agreement with those obtained by deep sequencing and support the consistency between the two methods for determining relative expression levels in the zebrafish model.ConclusionIn zebrafish model, ADTM exhibits the effects of angiogenesis and blood vessel restoration. The underlying mechanism may be involved in the activation of insulin signaling pathway.

Key words:Danshensu derivative; angiogenesis; vascular repair; zebrafish, transcriptome; insulin signaling pathway

收稿日期:2016-01-19,修回日期:2016-02-26

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81460552，81328025)；珠海市優勢學科建設項目資助和澳門科技發展基金資助項目(No 078/2011/A3，134/2014/A3)

作者簡介：崔國禎(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：心腦血管藥理學，E-mail: cgzum@hotmail.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.012

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0795-06

中國圖書分類號：R-332；R322.123；R364.3；R347.8；R394.2

網絡出版時間：2016-5-25 15:39網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.024.html

李銘源(1972-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心腦血管藥理學，通訊作者，E-mail: simonlee@umac.mo