Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A3種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞株的建立與功能研究

吳佳俊，江宇峰，伍　超，馬　瀅，陳　寧，陶李芬芳，張雨露，趙享龍，楊　雁

(安徽醫(yī)科大學 1.藥理學教研室和天然藥物研究所，2.藥學院，3.生命科學院，安徽 合肥　230032)

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Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A3種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞株的建立與功能研究

吳佳俊1，江宇峰1，伍超1，馬瀅1，陳寧2，陶李芬芳2，張雨露2，趙享龍3，楊雁1

(安徽醫(yī)科大學 1.藥理學教研室和天然藥物研究所，2.藥學院，3.生命科學院，安徽 合肥230032)

摘要：目的建立Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞株，探究單純轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒及選擇性上調(diào)pSmad3C、pSmad3L對HepG2細胞功能的影響。方法采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將Smad3 WT(野生型Smad3基因)、Smad3 EPSM(Smad3L區(qū)磷酸化位點突變)、Smad3 3S-A(Smad3C區(qū)磷酸化位點突變)3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2 細胞中，經(jīng)G418篩選陽性細胞，Western blot法鑒定3種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的轉(zhuǎn)染效率。MTT法檢測細胞增殖情況。流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡。結(jié)果Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染相應質(zhì)粒的HepG2細胞高表達目的蛋白，提示穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建成功。MTT結(jié)果顯示，在缺乏TGF-β1刺激情況下，轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒后對HepG2細胞增殖幾乎沒有影響，TGF-β1能夠誘導穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的細胞增殖，且轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的HepG2細胞，較未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染Smad3 WT或Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞對TGF-β1誘導的細胞增殖反應減弱。細胞周期分析顯示，TGF-β1刺激下，轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組G0/G1期細胞數(shù)明顯增多，而轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒組G2/M期細胞數(shù)增加明顯。細胞凋亡檢測顯示，TGF-β1刺激下，較未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組細胞凋亡率明顯增加，而轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒組細胞凋亡率明顯降低。結(jié)論成功建立Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞株，為進一步探討開發(fā)能夠經(jīng)由調(diào)控pSmad3C、pSmad3L的藥物提供一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Smad3 WT質(zhì)粒；Smad3 EPSM質(zhì)粒；Smad3 3S-A質(zhì)粒；HepG2細胞；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

目前常用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)主要有兩種：瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[1]。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是將轉(zhuǎn)染的外源性基因整合進入宿主細胞染色體中，實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達，應用較為廣泛[2]。實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣法、電穿孔法、慢病毒載體基因轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染法等。電穿孔法、磷酸鈣法基因轉(zhuǎn)染效率較低；慢病毒載體基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染率雖高，但存在的潛在危害性較大；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法具有低細胞毒性，對多種類型的細胞都具有高轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點，是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)/Smad信號通路在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生發(fā)展過程中的作用隨階段不同而異，在HCC早期，TGF-β1可抑制上皮細胞增殖、誘導細胞凋亡，對腫瘤起抑制作用，在HCC晚期則促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移，推動腫瘤進程，TGF-β信號的雙重作用與Smad3的C末端和連接區(qū)磷酸化密切相關(guān)[4-5]。一方面，TGF-β通過活化I型TGF-β受體(TβRI)使Smad3C末端磷酸化形成pSmad3C，即TβRI/pSmad3C；另一方面，TGF-β可活化促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路，促進Smad3連接區(qū)磷酸化為pSmad3L，即MAPK/pSmad3L[5]。TβRI/pSmad3C介導的是腫瘤抑制信號，而MAPK/pSmad3L介導的是致有絲分裂和促進腫瘤發(fā)生信號[6]。提示，Smad3的不同位點磷酸化對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起反向調(diào)控作用，降低Smad3L磷酸化水平、恢復或提高Smad3C磷酸化水平，可能阻斷肝細胞向肝癌細胞轉(zhuǎn)化或肝癌細胞向正常肝細胞轉(zhuǎn)歸。有關(guān)Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對于HepG2肝癌細胞的增殖、周期及凋亡等功能研究未見相關(guān)報道。本研究擬采用脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染法，將攜帶Smad3不同位點磷酸化基因的質(zhì)粒(Smad3 EPSM：Smad3連接區(qū)磷酸化位點突變，選擇性磷酸化Smad3C；Smad3 3S-A：Smad3 C-末端磷酸化位點突變，選擇性磷酸化Smad3L；以正常野生型基因Smad3 WT為對照)轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細胞，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2及Smad3 3S-A-HepG2細胞模型，探討穩(wěn)轉(zhuǎn)后不同目的基因的表達對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡等功能的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，新生胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，Recombinant Human TGF-β1購自Peprotech公司，Lipofectamine?LTX and Plus Reagent購自Invitrogen公司，G418、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司產(chǎn)品，Western 及IP細胞裂解液和細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自貝博公司產(chǎn)品，質(zhì)粒和兔抗pSmad3L抗體源于日本關(guān)西醫(yī)科大學Matsuzaki博士惠贈，兔抗Smad3抗體購自Santa Cruz Biotechnology，兔抗pSmad3C抗體購自Cell Signaling Technology，YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺購自北京冠鵬凈化設備有限責任公司，Nap-co-6100 型CO2培養(yǎng)箱購自美國杜邦公司，各種規(guī)格移液器購自德國Eppendorf公司，多功能酶標儀購自荷蘭雷勃公司，流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2細胞

HepG2細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.3穩(wěn)轉(zhuǎn)Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-AHepG2細胞株的構(gòu)建

[7]

1.3.1G418篩選濃度確定將2.5×108cells·L-1的HepG2細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，24 h后細胞達到80%～90%匯合率，分別加入100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000 mg·L-1濃度的G418培養(yǎng)液。培養(yǎng)7～14 d，細胞全部死亡的最低濃度即為篩選濃度(600 mg·L-1)，維持濃度為篩選濃度一半(300 mg·L-1)。

1.3.2細胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)，當細胞密度為70%～80%時，進行轉(zhuǎn)染。實驗分為空白對照組、G418對照組、Smad3 WT轉(zhuǎn)染組、Smad3 EPSM轉(zhuǎn)染組、Smad3 3S-A轉(zhuǎn)染組。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，操作按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染前1 d，接種待轉(zhuǎn)染細胞于6孔板中，調(diào)整細胞數(shù)為每孔約5×108cells·L-1×2 ml培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，不含抗生素)中。待細胞達到80%～85%融合時轉(zhuǎn)染：分別用250 μL opti-MEM培養(yǎng)基稀釋4 μg Smad3 EPSM質(zhì)粒、Smad3 3S-A質(zhì)粒、Smad3 WT質(zhì)粒；250 μL opti-MEM培養(yǎng)基稀4 μL lipofectamine?，并在室溫下孵育5 min；將稀釋了的質(zhì)粒和稀釋了的lipofectamine?混合，在室溫下孵育20 min，促使二者復合物的形成，并在30 min內(nèi)與HepG2細胞混合孵育；棄去原先6孔板中的培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)基沖洗待轉(zhuǎn)染細胞兩次，然后在5個孔中每孔分別加入高糖的DMEM(無血清)1.5 mL，再分別加入500 μL混合物，前后左右輕輕晃動培養(yǎng)板使混勻；5% CO2、37 ℃、飽和濕度的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后，將無血清培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM(每孔2 ml)。

1.3.3G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)染48 h后，細胞用含600 mg·L-1的G418和含10%胎牛血清的培養(yǎng)液篩選2周左右，直到空白對照組細胞完全死亡，然后用含300 mg·L-1的G418和含10%胎牛血清的培養(yǎng)液維持篩選并擴增培養(yǎng)，篩選成功的陽性細胞分別命名為Smad3 WT-HepG2細胞、Smad3 EPSM-HepG2細胞及Smad3 3S-A-HepG2細胞。

1.4Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞株中Smad3、pSmad3C、pSmad3L蛋白水平

實驗分為轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞，無(或有)TGF-β1(9 pmol·L-1，1 h)刺激的轉(zhuǎn)染細胞組，和無(或有)TGF-β1(9 pmol·L-1，1 h)刺激的正常HepG2細胞組。分別收集對數(shù)生長期HepG2細胞(HepG2)、轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒的HepG2細胞(Smad3 WT-HepG2)、轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的HepG2細胞(Smad3 EPSM-HepG2)、轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞(Smad3 3S-A-HepG2)，調(diào)整細胞密度至2.5×108cells·L-1，種瓶(25 cm2培養(yǎng)瓶，4 mL)，待細胞單層鋪展面積達80%～90%，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)結(jié)束前1 h，于相應細胞組加9 pmol·L-1TGF-β1共培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，提取細胞總蛋白，Western blot檢測pSmad3C、pSmad3L、Smad3蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參[8]。

1.5MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞增殖的影響

收集對數(shù)生長期HepG2、Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2、Smad3 3S-A-HepG2細胞，調(diào)整細胞密度至1.0×104cells·L-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。實驗分為HepG2組、HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)組、Smad3 WT-HepG2組、Smad3 WT-HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)組、Smad3 EPSM-HepG2組、Smad3 EPSM-HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)組、Smad3 3S-A-HepG2組、Smad3 3S-A-HepG2+TGF-β1(9 pmol·L-1)組，每組設3個復孔。待細胞單層鋪展面積達80%時，更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，于相應組別加9 pmol·L-1TGF-β1共培養(yǎng)16 h，每孔加MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)上清液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，水平搖床上震蕩10 min后，置酶標儀上檢測各孔吸光度值(A570nm)[9]。實驗重復3次。

1.6流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞周期的影響

取對數(shù)生長期的HepG2、Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2及Smad3 3S-A-HepG2細胞，調(diào)整細胞密度至1.0×108cells·L-1接種于6孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞單層鋪展面積達90%時，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，加9 pmol·L-1TGF-β1共培養(yǎng)16 h，棄上清液，加PBS洗滌、胰酶消化，收集各組細胞液至EP管中，離心(1 000×g，5 min；下同)沉淀細胞，加預冷的PBS重懸細胞，離心，棄上清，加預冷的70%乙醇固定(4 ℃，過夜)。次日，離心，棄上清，加預冷的PBS洗滌，離心，棄上清，加300 μL預冷的PBS重懸細胞后，加入RNaseA溶液20 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL碘化丙碇(propidium iodide，PI)染液，混勻后4 ℃避光孵育1 h，上流式細胞儀檢測細胞周期分布，Multicycles軟件分析結(jié)果。

1.7FCM檢測轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞周期及凋亡的影響

細胞分組及處理同“1.7”，培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，采用Annexin V-FITC試劑盒檢測細胞凋亡率，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。Cell Questt軟件分析實驗。

1.8統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1動態(tài)觀察各組細胞篩選情況及形態(tài)學特征

篩選d 1 HepG2細胞呈典型梭形，各組細胞形態(tài)基本一致。篩選d 7 G418對照組及轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒的HepG2細胞組因抗生素G418長期高壓篩選作用，細胞有一定死亡。篩選d 14 G418對照組細胞最終全部死亡，而轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒組細胞仍有大部分存活(Fig 1)。

Fig 1　Inverted microscope observing screening solution of each cell results and morphological feature(×200)

2.2轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞中pSmad3C/L蛋白水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常HepG2細胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3種不同質(zhì)粒(Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A)組Smad3蛋白的表達量明顯增多，TGF-β1刺激后，轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組細胞pSmad3C/L蛋白水平明顯上調(diào)；轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組細胞pSmad3C蛋白水平上調(diào)明顯，而pSmad3L蛋白表達較正常HepG2細胞差異無顯著性；轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒組細胞pSmad3L蛋白水平明顯增加，pSmad3C蛋白水平較正常HepG2細胞微有上調(diào)(Fig 2)。上述結(jié)果表明，Smad3 WT-HepG2、Smad3 EPSM-HepG2及Smad3 3S-A-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建成功，外源性TGF-β1刺激是實現(xiàn)3種質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞選擇性高表達相應目的蛋白的必要條件。

2.3轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒后對HepG2細胞的增殖影響較小，無統(tǒng)計學差異，9 pmol·L-1TGF-β1刺激16 h后，對正常HepG2細胞，轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞的細胞增殖均有一定的促進作用(Fig 3)；轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的HepG2細胞，較未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染Smad3 WT或Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞對TGF-β1誘導的細胞增殖反應減弱，差異有顯著性，轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞，較未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組細胞，對TGF-β1誘導的細胞增殖反應略有增強(Fig 3)。提示選擇性上調(diào)pSmad3C蛋白水平能夠抑制HepG2細胞增殖，而上調(diào)pSmad3L蛋白水平，可能促進HepG2細胞的惡性增殖。

2.4轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞周期的影響

結(jié)果顯示，TGF-β1刺激下，轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒的HepG2細胞較正常HepG2細胞周期分布差異無顯著性；轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的HepG2細胞，較正常HepG2或轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒的HepG2細胞，表現(xiàn)出明顯的G1期阻滯，進入S期細胞數(shù)明顯減少；轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒的HepG2細胞，較正常HepG2或轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒的HepG2細胞，S期細胞數(shù)明顯減少，而G2/M期細胞數(shù)增多(Fig 4)。提示，選擇性上調(diào)pSmad3C蛋白水平，誘導HepG2細胞G1期阻滯；選擇性上調(diào)pSmad3L蛋白水平，促進HepG2細胞由S期進入G2/M期，推動細胞周期進程。

2.5轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒對HepG2細胞凋亡的影響

FCM檢測結(jié)果顯示，TGF-β1刺激下，轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組較正常HepG2細胞組，細胞凋亡率差異無顯著性；轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組，較轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組，細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Smad3 3S-A質(zhì)粒組，較轉(zhuǎn)染Smad3 WT質(zhì)粒組，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05,Fig 5)。提示，選擇性上調(diào)pSmad3C蛋白水平，促進HepG2細胞凋亡，而選擇性上調(diào)pSmad3L蛋白水平抑制HepG2細胞凋亡。

Fig 2　The target gene expression level of transfecting Smad3 WT,Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids

**P<0.01vsHepG2 or HepG2+TGF-β1;#P<0.05,##P<0.01vsSmad3 WT+TGF-β1.

Fig 3　Effects of transfecting Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids on cell proliferation in different groups stimulated by TGF-β1

**P<0.01vsSmad3 EPSM+TGF-β1;#P<0.05vsSmad3WT+TGF-β1.

Fig 4　Effects of transfecting Smad3 WT, Smad3EPSM and Smad3 3S-A plasmids on cell cycle distribution of

##P<0.01vsSmad3 WT

Fig 5　Effects of transfecting Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids on apoptotic rate of

#P<0.05,##P<0.01vsSmad3 WT

3討論

TGF-β是一類對于細胞生長、增殖、分化、凋亡等生命活動均具有調(diào)節(jié)作用的多功能細胞因子[10]。TGF-β首先結(jié)合靶細胞膜上的TGF-β受體，受體活化，進而磷酸化胞質(zhì)中的Smad蛋白，磷酸化的Smad蛋白異位入核，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響靶細胞的生物學功能[11]。目前研究表明，Smad3是參與TGF-β信號胞內(nèi)提取和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵節(jié)點，依賴TβRI活化的Smad3 C-末端(即pSmad3C)，介導的是腫瘤抑制信號；依賴絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的Smad3連接區(qū)(即pSmad3L)，介導的是致有絲分裂或促腫瘤發(fā)生信號[12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，最終發(fā)展成為HCC的慢性乙肝及慢性丙肝患者肝組織中pSmad3L大量表達，而pSmad3C則表達有限；反之，pSmad3C大量表達，而pSmad3L表達有限的慢性乙肝及丙肝患者則不發(fā)展為HCC[13]。提示，在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，pSmad3L發(fā)揮著類似癌基因的作用，而pSmad3C扮演著抑癌基因的作用。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展與革新，基因水平的干預或基因治療，已逐漸成為人類防病治病的應對策略。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)的逐步成熟，幫助人類實現(xiàn)外源基因?qū)胨拗骷毎D(zhuǎn)錄翻譯，產(chǎn)生功能蛋白而調(diào)控靶細胞生物學功能的設想。本實驗中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶正常Smad3基因的質(zhì)粒Smad3 WT、連接區(qū)磷酸化位點突變的Smad3基因的質(zhì)粒Smad3 EPSM、C-末端磷酸化位點突變的Smad3基因的質(zhì)粒Smad3 3S-A導入人肝癌細胞株HepG2，倒置顯微鏡動態(tài)觀察篩選過程，結(jié)果顯示，篩選d 14轉(zhuǎn)染組細胞仍有部分存活，而未轉(zhuǎn)染組幾乎全部死亡，因為轉(zhuǎn)入細胞的質(zhì)粒中含有抗性基因neo，其攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒形式，而未轉(zhuǎn)染組不含抗性基因neo，推測可能獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。Western blot法對篩選結(jié)果作進一步驗證，結(jié)果顯示，TGF-β1刺激下，轉(zhuǎn)染相應質(zhì)粒的HepG2細胞選擇性高表達相應質(zhì)粒攜帶的目的基因蛋白，提示，已成功獲得Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞株。

隨后，初步探究了轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A質(zhì)粒后HepG2細胞的功能學。結(jié)果顯示，單純轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒后對HepG2細胞功能幾乎沒有影響；與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒經(jīng)TGF-β1刺激后相比，當Smad3C末端磷酸化位點突變，經(jīng)TGF-β1刺激僅pSmad3L蛋白表達，能明顯抑制HepG2細胞增殖、誘導HepG2細胞G1期阻滯和促進HepG2細胞凋亡， 當Smad3鏈接區(qū)末端磷酸化位點突變，經(jīng)TGF-β1刺激僅表達pSmad3C蛋白，對HepG2細胞增殖略有促進作用、誘導HepG2細胞由S期向G2/M期轉(zhuǎn)變，并抑制HepG2細胞凋亡。提示，轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒本身對細胞本身影響較小，選擇性上調(diào)HepG2細胞中pSmad3C、pSmad3L蛋白水平，可影響HepG2細胞的增殖，推測選擇性增加pSmad3C蛋白水平可能通過誘導細胞周期阻滯和促進細胞凋亡，從而抑制肝癌細胞的增殖，發(fā)揮抗癌作用；選擇性上調(diào)HepG2細胞中pSmad3L蛋白水平，可能通過促進細胞周期進程和抑制細胞凋亡，從而促進肝癌細胞的惡性增殖，發(fā)揮促癌作用。

本研究證實了在HepG2細胞中選擇性調(diào)控pSmad3C/L蛋白水平或含量比值，能夠改善癌細胞的惡性程度，可能促進癌細胞向正常細胞轉(zhuǎn)歸。而研究中建立的Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞株，為下一步本課題組在細胞和分子水平研究能夠經(jīng)由pSmad3C/pSmad3L調(diào)控的藥物奠定基礎(chǔ)。

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Construction and functional study of three plasmids including Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A stably transfected HepG2 cell lines

WU Jia-jun1, JIANG Yu-feng1, WU Chao1, MA Ying1, CHEN Ning2, TAO Li-fen-fang2,ZHANG Yu-lu2, ZHAO Xiang-long3, YANG Yan1

(1.DeptofPharmacologyandInstituteofNaturalMedicine,2.CollegeofPharmacy,3.SchoolofLifeSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032China)

Abstract:AimTo construct three plasmids including Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A stable transfection in HepG2 cell lines to investigate phospho-domains of Snad3(pSmad3C or pSmad3L), their protein expression and roles in HepG2 cell proliferation, apoptosis and cell cycle.MethodsThree plasmids including Smad3 WT(Carry the wild Smad3 gene), Smad3 EPSM(Carry the mutated phosphorylation site in linker region of Smad3 gene) and Smad3 3S-A(Carry the mutated phosphorylation site in C-terminal of Smad3 gene) were respectively transfected into HepG2 cells by using a liposome transfection reagent. Verification of positive cells was done by screening with G418 via co-culture. Transfection efficiency was determined by Western blot.Cell proliferation was induced by exogenous TGF-β1in the respective stably transfected HepG2 cell lines. Cell proliferation was monitored by MTT. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry(FCM).ResultsThere was elevated protein expression of the respective phospho-domain sites in the stably transfected HepG2 cells for Smad3 WT(C-terminus and Linker), Smad3 EPSM(C-terminus) and Smad3 3S-A(Linker), which indicated successful stable transfection of HepG2 cell lines. The results from MTT experiment showed that TGF-β1could induce proliferation of HepG2 cells with or without the transfection of Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A plasmids, meanwhile transfected Smad3 EPSM plasmids could significantly inhibit proliferation of HepG2 cells induced by TGF-β1, and transfected Smad3 3S-A plasmids accelerate proliferation of HepG2 cells induced by TGF-β1. Cell cycle analysis showed that the G0/G1phase of HepG2 cells with stable transfection of Smad3 EPSM plasmid increased compared with HepG2 cells with or without stable transfection of Smad3 WT plasmid, meanwhile the G2/M phase of HepG2 cells with stable transfection of Smad3 3S-A plasmid increased. Compared with Smad3 WT transfected cells, apoptosis in Smad3 EPSM transfected cells was markedly increased, while that of Smad3 3S-A transfected cells decreased.ConclusionsThe three plasmids of Smad3 WT, Smad3 EPSM and Smad3 3S-A stably transfected HepG2 cell lines have been successively constructed. The construction of three plasmids transfected HepG2 cell lines provides the research foundation for studying medical as well as possible regulatory mechanism of pSmad3C/pSmad3L.

Key words：Smad3 WT；Smad3 EPSM；Smad3 3S-A；HepG2 cells；stable transfection；cell proliferation；cell cycle；apoptosis

收稿日期:2016-01-06,修回日期:2016-03-15

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81374012，81573652)

作者簡介：吳佳俊(1990-)，女，碩士生，研究方向：免疫藥理學，E-mail:1005883518@qq.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.017

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0825-07

中國圖書分類號：R329.24；R329.25；R329.28；R394.2；R735.7

網(wǎng)絡出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.034.html

楊雁(1964-)，女，博士，教授，博士生導師，通訊作者，E-mail：yangyan@ahmu.edu.cn