綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk /GCV系統重組慢病毒載體的構建及活性檢測

黃暨生，張廣獻，譚宇蕙，易華，羅惠，杜標炎

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州　510006）

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綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk /GCV系統重組慢病毒載體的構建及活性檢測

黃暨生，張廣獻，譚宇蕙，易華，羅惠，杜標炎

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】構建綠色熒光蛋白（GFP）示蹤的單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因（HSV1-tk）的重組慢病毒載體，并檢測該系統對人皮膚黑色素瘤細胞株A375的感染活性。【方法】構建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重組慢病毒表達載體pLV-tk-GFP，并使用限制性內切酶消化進行鑒定及序列測定；用該重組質粒與輔助質粒共轉染包裝細胞HEK293T，獲得重組活病毒并感染A375，以嘌呤霉素篩選穩定表達細胞株；使用熒光顯微鏡觀察GFP基因的表達，更昔洛韋（GCV）殺傷實驗驗證tk-GFP基因的活性。【結果】重組質粒pLV-tk-GFP經限制性酶切鑒定和DNA序列測定分析顯示，tk基因已連接到載體正確位置，序列無突變；包裝病毒并感染細胞后，熒光顯微鏡下觀察顯示tk-GFP基因在A375中表達；篩選得到穩定表達細胞株A375/ tk-GFP，GCV能顯著殺傷A375/tk-GFP細胞，表明tk基因活性正常。【結論】成功構建了重組pLV-tk-GFP慢病毒載體，該載體能包裝產生活病毒且在感染的人黑色素瘤細胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

關鍵詞：單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因；自殺基因系統；慢病毒；黑色素瘤

腫瘤自殺基因療法由于存在旁觀者效應，成為腫瘤生物治療中活躍的研究領域之一。單純皰疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韋（HSV1-tk/GCV）自殺基因系統是最早進入臨床試驗的自殺基因系統，在多種腫瘤（如白血病、神經膠質瘤、膀胱癌、肝癌、結腸癌和口腔癌等）的治療中均顯示了一定的抗腫瘤效果［1］。……