抗α烯醇化酶抗體在自身免疫性甲狀腺炎中的表達

張紅梅，秦娟，項陽，李靜，單忠艷，滕衛平

（中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科，中國醫科大學內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽　110001）

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抗α烯醇化酶抗體在自身免疫性甲狀腺炎中的表達

張紅梅，秦娟，項陽，李靜，單忠艷，滕衛平

（中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科，中國醫科大學內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽110001）

摘要目的對自身免疫性甲狀腺炎（AIT）患者外周血抗α-烯醇化酶抗體（ENO1Ab）表達及其與抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）產生和甲狀腺功能（甲功）變化的相關性進行分析。方法ELISA檢測患者抗ENO1總IgG及4種亞型滴度。羅氏E601檢測患者甲功和TPOAb、TgAb。結果與非AIT患者相比，無論是甲功正常還是減退的AIT患者，其血清抗ENO1總IgG和IgG1、IgG2、IgG3亞型的滴度均顯著升高，而IgG4水平無統計學差異。在AIT患者中，血清抗ENO1 總IgG和4種亞型的滴度均未顯示與血清游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、促甲狀腺素（TSH）、TPOAb、TgAb水平有明顯相關，并且甲減組與甲功正常組相比，其滴度及血TPOAb、TgAb水平也無統計學差異。結論在甲狀腺自身免疫反應中ENO1Ab的產生顯著增加，但可能不是影響甲功的主要抗體。

關鍵詞α烯醇化酶；自身抗體；自身免疫；甲狀腺炎

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自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）除可致甲狀腺破壞外，還可引起其他組織器官受累，其中AIT相關腦損害正逐漸受到多學科關注。α-烯醇化酶（α-eno1ase，ENO1）可作為自身抗原誘發免疫炎性反應［1］。國外已有研究［2-3］報道了抗

ENO1抗體（ENO1 antibody，ENO1Ab）在AIT病患者外周血中陽性檢出率較高（44%～83%）。因此，本研究主要針對AIT患者外周血ENO1Ab滴度與抗甲狀腺過氧化物酶抗體（anti-thyroperoxidase antibody，TPOAb）和抗甲狀腺球蛋白抗體（anti-thyrog1obu1in antibody，TgAb）的產生以及甲狀腺功能（簡稱甲功）的變化的相關性進行分析。

1　材料與方法

1.1研究對象

隨機選取2013年5月至2015年3月我院門診和病房新診斷的AIT患者44例。其中，甲功正常組22例，甲功減退組（甲減）22例；男2例、女42例；平

均年齡（42.09±14.52）歲。另選取沒有AIT并且甲功正常者36例（非AIT組），男8例，女28例；平均年齡（41.03±13.71）歲。所有入選者均否認腦血管疾病、風濕免疫病、惡性腫瘤和近期感染病史。AIT診斷標準［4］：血清TPOAb或TgAb升高，并且甲狀腺超聲顯示為彌漫性低回聲，可伴有網格狀改變或分布不均勻。非AIT患者主要來自于年齡匹配、為篩查有無甲狀腺結節或甲功異常而就診者，根據其甲功、TPOAb、TgAb測定以及甲狀腺超聲檢查結果確定為無AIT且甲功正常者。

1.2方法

1.2.1血ENO1Ab檢測：以重組ENO1蛋白（北京義翹神州生物技術有限公司，1 μg/孔）作為包被抗原，利用pH 9.6，0.05 mo1/L碳酸鹽緩沖液作為包被液，間接ELISA法檢測外周血抗ENO1總IgG和4種亞型滴度［5］。為測總IgG，血清1∶50稀釋；為測IgG1亞型，血清1∶200稀釋，IgG2亞型1∶15，IgG3亞型1∶15，IgG4亞型1∶5稀釋。辣根過氧化物酶標記山羊抗人總IgG以及IgG1、IgG2、IgG3、IgG4二抗（北京博奧森公司）的稀釋度均為1∶10 000。

1.2.2甲功檢測：利用羅氏E601全自動電化學發光免疫分析儀檢測血清甲狀腺功能（包括TSH、FT3、FT4、TPOAb、TgAb）。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行Mann Whitney U檢驗分析比較組間差異，采用Spearman相關分析進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1AIT與非AIT患者中血總IG和4種亞型滴度分析

與非AIT患者相比，無論是甲功正常還是已出現甲減的AIT患者，其血清中ENO1總IgG和其IgG1、IgG2、IgG3亞型的滴度均顯著升高，而IgG4亞型無明顯差異（圖1、2）。

2.2甲減組與甲功正常組血總IG和4種亞型差異及2組ENO1Ab陽性率分析

圖1　AIT患者血清抗ENO1總IgG滴度分析Fig.1 Serum level of total IgG against ENO1 in AIT patients with euthyroidism and hypothyroidism

在AIT患者中，甲減組與甲功正常組相比，抗ENO1總IgG和4種亞型的滴度以及血TPOAb、TgAb水平均無統計學差異。以非AIT組抗ENO1總IgG測定結果建立正常參考范圍，分析2組AIT患者中ENO1Ab陽性率。AIT甲減組和甲功正常組相比，血ENO1Ab陽性率（100%vs 95.5%）也無統計學差異。

2.3血清總IG及4種亞型與甲功和抗體的相關性

在全部AIT患者中，血清抗ENO1總IgG和4種亞型的滴度均未顯示與血游離甲狀腺素（free thyroxine，FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）促甲狀腺激素（thyroid stimu1ating hormone，TSH）、TPOAb、TgAb水平有明顯相關性，見表1。

3　討論

ENO1Ab在多種自身免疫疾病中可被檢測到［6］。特別是抗ENO1氨基端自身抗體在橋本腦病患者中陽性率顯著高于正常對照［7-8］。本研究較系統地分析了AIT患者中ENO1Ab表達及其與甲狀腺特異自身抗體和甲功的相關性。結果發現AIT患者血清ENO1Ab水平明顯升高，為IgG1、IgG2、IgG3亞型顯著增加；但血FT4、FT3、TSH水平與血抗ENO1總IgG及其亞型均無顯著相關；血清甲狀腺特異抗體TPOAb、TgAb也未顯示與ENO1Ab滴度明顯相關。提示在AIT這種經典器官自身免疫病中也有ENO1Ab這種非甲狀腺特異自身抗體產生；其影響可能不是以對甲狀腺細胞的損害為主。

圖2　AIT患者中血清中抗ENO1抗體IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型滴度分析Fig.2 Serum levels of IgG1，IgG2，IgG3 and IgG4 subtypes against ENO1 in AIT patients

表1　AIT患者血清ENO1Ab滴度與TPOAb、TGAb及甲功的相關性分析（r）Tab.1 Analysis of the correlations between serum ENO1Ab level and TPOAb，TGAb，as well as thyroid function（r）

既往研究［6］已發現，ENO1Ab在器官特異和非器官特異性自身免疫病中有較高水平表達，包括類風濕（6%～66%）、狼瘡（19%～80%）、系統性硬化癥（15%～30%）等。本研究又發現AIT患者中該抗體陽性率高達94.5%～100%。ENO1在原核及真核生物中均廣泛表達，例如幽門螺旋桿菌［2］和牙周炎致病菌牙齦卟啉單胞菌［3］等微生物中，由于這些微生物與人體ENO1蛋白在氨基酸序列上有高度一致性（51.4%～82%），其感染可能導致自身耐受被打破，而誘發針對人體ENO1的交叉自身免疫反應，導致ENO1Ab產生，并進一步引起細胞受損［9］。國外學者利用牙齦卟啉單胞菌ENO1蛋白進行免疫，小鼠體內產生抗環瓜氨酸ENO1抗體，并最終發生關節炎［3］。提示微生物感染確實可能打破人類機體對ENO1免疫耐受，誘發自身免疫反應。而對類風濕患者的研究顯示，從交叉自身免疫反應發生至臨床起病可能需要數年之久。但是如果針對ENO1蛋白的交叉反應均是這些自身免疫病的啟動因素，那么其在不同個體中啟動不同種自身免疫病的機制尚不清楚，是否受到某些自身免疫易感基因的調控還有待于進一步研究。此外，在各種已發生的自身免疫炎癥反應中，caspase-1通常被激活。研究發現，ENO1蛋白可作為caspase-1底物而被分解為多肽，這些多肽如在局部未被有效清除，則可作為自身抗原而誘導自身免疫反應和ENO1Ab產生。最新研究還發現，凋亡細胞表面SUPER蛋白是參與凋亡細胞被免疫細胞識別和處理的關鍵因素，該蛋白是指在活細胞中正常存在、在進化上高度保守、對蛋白酶敏感、普遍廣泛表達且暴露于細胞表面的蛋白。ENO1是凋亡細胞表面最豐富的酶，被認為是最典型SUPER蛋白，可作為自身抗原誘導針對原發病所致凋亡細胞的自身免疫反應，同時產生ENOAb1。而且單核和巨噬細胞在免疫炎癥狀態下被激活，IFN-γ等因子可刺激其ENO1從細胞質向細胞膜轉移增多，膜上過度表達ENO1也可誘導機體產生抗ENO1抗體［10］。目前筆者正在分別利用Tg和ENO1重組蛋白進行動物免疫，探討在AIT中ENO1Ab產生的具體機制。

由于ENO1在血管內皮、神經元等組織細胞內廣泛表達，針對ENO1的自身免疫反應可能是參與引起AIT患者甲狀腺外病變的重要機制，如橋本腦病和流產、腎小球腎炎［1，7-8，11-12］。研究發現，ENO1Ab可通過識別ENO1的膜聯形式和/或干擾它的功能而誘發免疫炎性反應，導致組織損傷。在狼瘡腎炎患者的腎小球中表達最多的是抗ENO1和膜聯蛋白A1 IgG2型自身抗體［13］。ENO1被認為是大腦中主要纖溶酶原受體。纖溶酶原與ENO1結合后刺激纖溶酶活化，可促進降解淀粉樣蛋白β，具有神經保護作用［14-15］。日本學者初步研究［7-8］已發現橋本腦病患者中血ENO1Ab陽性率高44%～83.3%，而本研究也發現AIT患者血ENO1Ab顯著升高，但還需進一步確定ENO1Ab是否為導致腦功能異常的直接病因，其潛在病理意義和產生機制還有待研究。

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（編輯于溪）

Expressionof Alpha-enolase Specific Autoantibodyinthe Patientswith Autoimmune Thyroiditis

ZHANGHongmei，QINJuan，XIANGYang，LIJing，HANZhongyan，TENGWeiping
（Department of Endocrino1ogy and Metabo1ism，Institute of Endocrino1ogy，The First Hospita1，China Medica1 University，Liaoning Provincia1 Key Laboratory of Endocrine Diseases，Shenyang110001，China）

AbstractObjective Toinvestigatetheexpressionofanti-ENO1autoantibody（ENO1Ab）inpatientswithautoimmunethyroiditis（AIT）andexp1ore its corre1ation with thyroid functions and the production of c1assica1 thyroid-specific autoantibodies，inc1uding anti-thyroperoxidase antibody （TPOAb）and anti-thyrog1obu1in antibody（TgAb）. Methods Serum 1eve1s of ENO1-specific tota1 IgG and four subc1asses were determined by ELISA using recombinant ENO1 protein as coat antigen. Serum FT4，FT3，TSH，TPOAb and TgAb were measured on Roche E601. Results As compared with the contro1s，serum 1eve1s of ENO1-specific tota1 IgG，IgG1，IgG2 and IgG3 werea11significant1y increased in both AIT patients with euthyroidism and hypothyroidism. Among a11 the AIT patients，neither serum titer ofENO1-specific tota1 IgG nor the four isotypes were significant1y corre1ated with that of FT4，FT3，TSH，TPOAb or TgAb. There were no significant differences in serum titers of ENO1-specific tota1 IgG between AITpatientswitheuthyroidismandhypothyroidism，aswe11asthe TPOAband TgAb.Conclusion Theproductionof ENO1Abcanbeobvious1yinducedinthyroidautoimmuneresponses；however，itmaynotbethemainpathogenicfactortoaffectthyroideconomy.

Keywordsα-eno1ase；autoantibody；autoimmunity；thyroiditis

中圖分類號R581.4

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0499-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.005

基金項目：國家自然科學基金（81273296；30972740）、遼寧省教育廳第四批遼寧特聘教授人才項目（2014-187）

作者簡介：張紅梅（1985 -），女，技師，本科.

通信作者：李靜，E-mai1：1ijingendocrine@126.com

收稿日期：2015-12-25