Smad4和Ras在外陰鱗狀細胞癌中的表達及意義

王艷實，吳瓊，王晨，趙云霞，武昕

（中國醫科大學附屬第一醫院婦科，沈陽110001）

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Smad4和Ras在外陰鱗狀細胞癌中的表達及意義

王艷實，吳瓊，王晨，趙云霞，武昕

（中國醫科大學附屬第一醫院婦科，沈陽110001）

摘要目的探討Smad4和Ras在外陰鱗狀細胞癌（VSCC）中的表達情況，分析兩者與VSCC發生發展的關系。方法采用免疫組化方法檢測Smad4和Ras在VSCC中的表達情況，并結合臨床病理資料進行分析。結果Smad4在VSCC的表達明顯低于正常外陰皮膚（P＜0.05），在VSCCⅢ期中表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），中低分化的表達明顯低于高分化（P＜0.05），有淋巴結轉移的表達明顯低于無淋巴結轉移（P＜0.05）。Ras蛋白在VSCC的表達明顯高于正常外陰皮膚（P＜0.05），在VSCCⅢ期中表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），有淋巴結轉移的表達明顯高于無淋巴結轉移（P＜0.05），VSCC低、中分化以及高分化之間無統計學差異（P＞0.05）。Spearman相關性分析結果表明：在VSCC中Smad4和Ras的表達呈負相關。結論Smad4的低表達及Ras的高表達可能與VSCC的發生、發展有關。

關鍵詞外陰鱗狀細胞癌；Smad4；Ras；免疫組織化學

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外陰癌是女性生殖道惡性腫瘤之一，約占女性生殖道腫瘤的5%［1］，其5年生存率為58.9%～68.9%，病因尚未完全明確。

TGF-β/Smad信號轉導通路在維持上皮細胞內環境穩態時發揮重要作用。TGF-β1首先與TβRⅡ結合，使TβRⅠ及下游的信號轉導因子Smads發生磷酸化后，與Smad4形成三聚體并轉移至胞核，在細胞核內通過與特異的DNA結合，從而調控靶基因的表達［2］。Smad4是TGF-β/Smad信號通路中的關鍵性分子，在一些腫瘤中低表達。Ras是一種原癌基因，定位于細胞質膜內表面上，可通過MEK/ERK信號通路促進Smad4的降解，抑制Smad2/3與Smad4復合物的形成，干擾TGF-β/Smad信號通路傳導，在一些腫瘤中高表達。在外陰鱗狀細胞癌（vu1ar squamous ce11 carcinoma，VSCC）中這2種基因蛋白的表達是否與外陰癌變有關尚待探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象：選取2004年至2014年于中國醫科大學附屬第一醫院手術切除的VSCC組織標本25例（所有患者術前均未行放化療）及外陰整形術中去除的正常外陰皮膚組織15例。標本制成石蠟塊，進行HE染色后，由2位資深的病理醫師確認。收集VSCC患者的臨床病理資料，年齡33～85歲，平均年齡（57.8±3.6）歲，按照2009年FIGO臨床分期分為Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ期6例；分化程度為高分化20例，中低分化5例；有淋巴結轉移6例，無淋巴結轉移19例。

1.1.2主要試劑：兔抗人Smad4單克隆抗體和鼠抗人Ras單克隆抗體（美國Abcam公司），SP免疫組化試劑盒和DAB染色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2方法

石蠟切片常規脫蠟水化。3%H2O2于室溫孵育20 min滅活內源性過氧化物酶，再進行抗原修復，室溫下羊血清孵育20 min，滴加一抗Smad4（1∶200）及Ras（1∶20）于4℃冰箱過夜，生物素分別標記山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，室溫孵育15 min，最后DAB顯色，蘇木素復染封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。利用顯微圖像分析系統Meta Morph （UIC/OLUMPUS.US/JP）進行積分光密度值測定，每張切片高倍鏡下選取5個不同視野，每個視野正常皮膚包括表皮全層和部分真皮，癌組織包括癌巢和間質，計算同一張切片的平均積分光密度值，其代表陽性染色細胞在該組織中的表達水平。

1.3統計學分析

2　結果

2.1Smad4在正常外陰皮膚組織及VSCC中的表達情況

Smad4在正常外陰皮膚中表達于基底細胞和近基底細胞（圖1A），陽性細胞的平均光密度值為0.280 5±0.008 4，在VSCC中Smad4表達于癌巢細胞質，強弱不均（圖1B），表達陽性細胞的平均光密度值為0.241 8±0.013 8，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2Ras在正常外陰皮膚組織及VSCC中的表達情況

Ras在正常外陰皮膚中陽性細胞多位于表皮基底細胞層，表達于細胞質（圖2A），陽性細胞的平均光密度值為0.038 7±0.006 4，在VSCC中Ras表達于癌巢細胞質，間質也有表達（圖2B），表達陽性細胞的平均光密度值為0.384 7±0.203 1，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3Smad4和Ras表達相關性的分析

Spearman相關分析結果顯示：Smad4和Ras在VSCC中的表達量呈負相關（r =-0.521，P＜0.001），見圖3。

2.4Smad4和Ras的表達與VSCC臨床病理特征的關系

Smad4在Ⅰ～Ⅱ期VSCC組織中表達為0.258 5± 0.008 4，明顯高于Ⅲ期（0.225 2±0.008 7，P＜0.05），在高分化癌中為0.243 2±0.021 7，明顯高于中低分化（0.240 2±0.009 8，P＜0.05），在無淋巴結轉移中為0.264 0±0.008 6，明顯高于有淋巴結轉移（0.219 5±0.012 0，P＜0.05），見表2。Smad4的表達與年齡無關。

圖1　Smad4在正常外陰皮膚及VSCC中的表達SP×200Fig.1 Expression of Smad4 in normal vulvar tissues and VSCC SP×200

圖2　Ras在正常外陰皮膚及VSCC中的表達SP×200Fig.2 Expression of Ras in normal vulvar tissues and VSCC SP×200

表1　Smad4及RAS在正常外陰皮膚及VSCC的表達Tab.1 Expression of Smad4 and Ras in normal vulvar tissues and VSCC

圖3　Smad4和Ras蛋白表達量相關性分析Fig.3　Correlation analysis of expression levels of Smad4 and Ras proteins

Ras在Ⅲ期VSCC組織中表達為0.463 4±0.075 3，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（0.312 5±0.023 7，P＜0.05），在有淋巴結轉移中為0.471 8±0.130 2，明顯高于無淋巴結轉移（0.337 9±0.076 4，P＜0.05），見表2。Ras的表達與分化程度、年齡無關。

3　討論

TGF-β/Smad信號通路是腫瘤發生、發展過程中最常發生改變的信號通路之一，在調節細胞生長、分化、凋亡等方面起重要作用。Smad4在TGF-β信號傳遞的過程中起到核心的作用，Smad4表達降低或功能缺陷可以使腫瘤細胞逃脫TGF-β的生長抑制作用，促進腫瘤的生長和惡性轉化。Smad4是一種腫瘤抑癌基因，定位于人長臂染色體18q21.1［3］，通過上調P27、Bim和Bad，抑制抗凋亡因子Bc1-w的活性及C-myc和Cyc1in D1的表達，阻礙細胞由G1期進入S期，促進線粒體內細胞色素c的釋放，加速線粒體介導的細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞增殖［4］。目前發現Smad4在一些癌中低表達，如大腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等［5-8］。本研究發現Smad4在VSCC中的表達顯著低于正常外陰皮膚，提示Smad4低表達與VSCC的發生有關。此外，張愛莉等［9］研究發現Smad4在腎癌組織中的表達明顯低于癌旁組織；在腎癌Ⅲ～Ⅳ期中表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期；中低分化的表達明顯低于高分化；有淋巴結轉移的表達明顯低于無淋巴結的轉移。Leng等［10］研究報道在胃癌組織中分化程度越低，Smad4表達越少。Bian等［11］研究發現在肺腺癌中臨床分期越高，組織分化程度越低，且伴有淋巴結轉移者，Smad4表達越少。A1azzouzi等［12］研究發現Smad4可以作為Dukes C期大腸癌的一種預后不良的獨立預測因子，并且Smad4高表達的患者總體生存率較高。本研究結果顯示，隨著臨床分期增加、分化程度降低和淋巴結轉移的出現，Smad4表達降低，提示Smad4的低表達與VSCC的預后不良有關。

Ras是一類具有小GTP酶活性的信號轉導蛋白，在Ras-GTP/RAS-GDP 2種構象間轉換，當Ras與GTP結合時則處于激活狀態，而當Ras與GDP結合時則處于失活狀態。一旦Ras處于激活狀態，它就能持續地刺激GTP水解酶的活性，使信號持續傳導，造成細胞生長失控，導致腫瘤的發生。Ras蛋白主要通過RAF/MEK/ERK/MAPK信號通路促進cyc1in D1的表達，使細胞生長對有絲分裂原和黏附信號的需求降低，G1期縮短，從而加速細胞的生長［13］。RAS也可以通過抑制Smad2/3向核內轉移和核內的聚集，阻斷TGF-β/Smad信號通路傳導，抵抗TGF-β介導的抗增殖作用［14］。Ras還可以通過MEK/ ERK信號通路促進Smad4的降解，抑制Smad2/3與Smad4復合物的形成，降低Smad4蛋白表達，阻止其核轉位，使細胞喪失對TGF-β的抑制作用［15］，由此打破Ras通路和Smad通路之間的平衡。最新研究［16］表明，在小鼠的胰腺中僅是Smad4的沉默并不會激發腫瘤的生成，而Smad4的缺失和K-ras的活化則會導致腫瘤迅速發生。這說明失活的Smad4能夠加速K-ras基因誘導胰腺癌的發生。同時，活化的K-ras和失活的Smad4能夠促進胰腺導管癌的侵襲及轉移，進一步說明活化的K-ras和失活的Smad4協同作用的重要性［17］。本研究發現Ras在VSCC中表達高于正常皮膚，且相關性分析發現Smad4與Ras呈負相關，進一步提示兩者在腫瘤發生發展過程中具有協同作用。此外，本研究還發現Ras在VSCC中隨著臨床分期增加及淋巴結轉移的出現表達增加。Li等［18］研究發現Ras可以做為乳腺癌的一種預后不良的獨立預測因子，在Ⅲ期乳腺癌患者中Ras的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期。曹壘等［19］研究發現在神經膠質瘤細胞中，Ras蛋白著色程度隨腫瘤分期增高呈上升趨勢，在Ⅲ～Ⅳ期膠質瘤顯著高于Ⅱ期膠質瘤。Li等［20］研究發現Ras在浸潤式生長的胃癌組織高于膨脹式生長，且伴有淋巴結轉移者，Ras表達越高。本研究結果與之相似，提示Ras高表達與VSCC的預后不良有關。

表2　Smad4和Ras的表達與臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship of Smad4 and Ras expression with clinicopathological features of VSCC

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（編輯于溪）

Expressionsof Smad4and Rasin Vulvar Squamous Cell Carcinomaand the Clinical Significance

WANGYanshi，WUQiong，WANGChen，ZHAOYunxia，WUXin
（Department of Gyneco1ogy，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110001，China）

AbstractObjective To investigate the expression of Smad4 and Ras in vu1var squamous ce11 carcinoma（VSCC），and exp1ore their association with deve1opment of disease.Methods Immunohistochemica1 staining was conducted to detect the expression of Smad4 and Ras in VSCC. Then the re1ationship between the expression of Smad4，Ras protein and c1inica1 and patho1ogica1 data of patients with VSCC were ana1yzed. Results The expression of Smad4 in VSCC was significant1y 1ower than norma1 vu1va skin tissue（P ＜ 0.05）. Smad4 expression in VSCC tissue of stage Ⅲ was significant1y 1ower than that of stage Ⅰ-Ⅱ（P ＜ 0.05）. The expression of Smad4 in the moderate1y and poor1y differentiated VSCC was 1ower than those we11differentiatedVSCC（P ＜0.05）.Theexpression of Smad4in cases with 1ymphnodemetastasiswas1owerthanthosewithout1ymphnodemetastasis（ P ＜ 0.05）. The expression of Ras in VSCC was significant1y higher than norma1 vu1va skin tissue and the difference was statistica11y significant （P ＜ 0.05）. The expression of Ras was higher in Ⅲ stage than in Ⅰ-Ⅱ stage（P ＜ 0.05）. The expression of Ras in cases with 1ymph node metastasis was higher than those without 1ymph node metastasis（P ＜ 0.05）. Ras expression had no statistica11y significant difference between the poor1y and moderate1y differentiated VSCC and the high1y differentiatedones（P ＞0.05）.The Spearmancorre1ationana1ysisshowed that Smad4 and Rasexpression was negative1y corre1ated in vu1va squamous ce11 carcinoma. Conclusion The expression of Smad4 and Ras was associated with occurrence and deve1opment of the VSCC.

Keywordsvu1var squamous ce11 carcinoma；Smad4；Ras；immunohistochemistry

中圖分類號R737.35

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0506-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.007

基金項目：國家自然科學基金（30973190）；遼寧省科學技術計劃（2014021057）

作者簡介：王艷實（1990 -），女，碩士研究生.

通信作者：武昕，E-mai1：xinwu.1964@a1iyun.com

收稿日期：2015-09-28