中國東北地區人群非綜合征唇腭裂與PAX7基因的相關性

盧永平，李增健，胥威，劉巍，趙寧，隋鈺，馮文華，馬超，藺美娜，韓維田

（1.遼寧省計劃生育科學研究院生殖健康和醫學遺傳學重點實驗室，沈陽110031；2.中國醫科大學附屬口腔醫院口腔外科，沈陽110002）

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中國東北地區人群非綜合征唇腭裂與PAX7基因的相關性

盧永平1，李增健2，胥威1，劉巍1，趙寧1，隋鈺1，馮文華1，馬超1，藺美娜1，韓維田1

（1.遼寧省計劃生育科學研究院生殖健康和醫學遺傳學重點實驗室，沈陽110031；2.中國醫科大學附屬口腔醫院口腔外科，沈陽110002）

摘要目的探討rs742071、rs7632427和rs12543318 3個單核苷酸多態（SNP）位點與非綜合征唇腭裂（NSCL/P）發生的相關性。方法收集東北地區NSCL/P患者258例，患者父親164例，患者母親195例，共134個完整核心家系和300例正常對照樣品，用PCR-RFLP方法進行基因分型，對分型結果用SPSS統計學軟件進行統計分析。結果PAX7基因的rs742071的GT基因型和T等位基因在病例對照組中分布有統計學差異，并且FBAT分析結果顯示T等位基因在核心家系中發生了過渡傳遞。rs7632427和rs12543318的基因分型結果無統計學差異。結論rs742071與中國東北地區人群NSCL/P的發生相關。

關鍵詞PAX7；非綜合征唇腭裂；單核苷酸多態

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非綜合征唇腭裂（nonsyndromic c1eft 1ip with or without c1eft pa1ate，NSCL/P）是最常見的出生缺陷［1］。Mango1d等［2］的研究發現17q22的rs227731和10q25.3的rs7078160也是NSCL/P的易感基因位點。Beaty等［3］以亞洲、歐洲和美國等多個人群的1 965個核心家系為研究對象進行了GWAS研究，報道了2個新的易感基因位點MAFB和ABCA4。Ludwig等［4］基于Beaty和Mango1d的研究進行了meta分析，發現了3個與亞洲人群相關的新位點。

rs742071（1p36），rs7632427（3p11.1），和rs12543318（8q21.3）是3個新報道的與亞洲人群NSCL/P發生密切相關的基因位點，目前未見中國東北人群的研究報道。本研究以中國東北地區NSCL/P病例為研究對象，對這3個單核苷酸多態（sing1e nuc1eotide po1ymorphism，SNP）位點進行進一步的精確驗證，以探討其在NSCL/P發生中的作用。

1　材料與方法

1.1研究對象

選擇中國醫科大學附屬口腔醫院口腔外科確診為NSCL/P的手術患者258例，患者父親164例，患者母親195例，其中134例患者為NSCL/P核心家系（NSCL/P組）。所有患者都進行了手術前檢查和問卷調查，排除腭心面綜合征、范德伍德綜合征、歌舞伎面譜綜合征、Mecke1綜合征等。所有研究對象均簽署了知情同意書，無行為能力的嬰兒由監護人簽署知情同意書。對照組樣品收集本院體檢的健康人群300例，所有受試者抽取5 mL靜脈血，EDTA抗凝管-20℃保存。

1.2實驗儀器和試劑

血液基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；PCR擴增試劑盒（天根生化科技有限公司）；PCR引物（表1）用Primer 5.0軟件設計，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。MwoⅠ、BccⅠ、Hpy188Ⅲ限制性內切酶購自NEB生物科技公司。用Nano Drop 1000紫外分光光度計測定核酸濃度，PCR反應在ABI Veriti熱循環儀（AB）上完成。

1.3SNP基因分型取200 μL患者血液，按照血液基因組提取試劑盒說明書抽提DNA，紫外分光光度計測定核酸濃度，標準化為50 ng/μL。PCR反應體系如下：DNA 1 μL（50 ng/μL），正義鏈和反義鏈引物各0.8 μL（10 μmo1/L），dNTP mix 1.6 μL，DNA聚合酶緩沖液2 μ L，Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補充至20 μL。PCR 循環條件為94 ℃變性5 min，然后94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，循環35 次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃終止延伸。rs742071（1p36） ， rs7632427 （3p11.1） ， 和rs12543318（8q21.3）的PCR產物分別由MwoⅠ、BccⅠ、Hpy188Ⅲ限制性內切酶進行酶切，酶切反應如下：PCR產物1 μL，內切酶0.2 μL，內切酶緩沖液1 μL，加水至10μL，37 ℃孵育2 h。酶切后行8％非變性PAGE凝膠電泳進行基因分型。

表1　PCR引物序列Tab.1 The primer sequence of PCR

1.4統計學分析

用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。對患者父母及對照組病例進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。計算NSCL/P組和對照組中各位點的基因型和等位基因頻率的差別，并進行χ2檢驗，計算出OR值和95%可信區間。用FBAT 5.5軟件分析包對患者及父母核心家系進行復雜疾病家系關聯性遺傳分析。

2　結果

2.1SNP的基本信息及Hardy-Weinberg平衡檢驗

本研究檢測的3個SNP位點的基本信息見表2，包括相關基因，染色體位置，所處功能區域，堿基變化和對照組的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果。對照組的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＞0.05），說明數據來自同一孟德爾群體。

2.2基因分型結果

表2　SNP位點基本信息及Hardy?Weinberg平衡檢驗結果Tab.2 Basic information of SNP locus and the result of Hardy?Weinberg disequilibrium test

NSCL/P組與對照組基因分型結果見圖1。圖中M泳道為DL2000 marker，圖1A中1、4泳道為GT基因型樣品，酶切形成283 bp、221 bp、62 bp 3個片段，2、3、5、6泳道為GG基因型樣品，酶切形成221 bp和 62 bp 2個片段。圖1B中1泳道為CC基因型樣品，酶切后只有1條269 bp片段，2、4、5泳道為CT基因型樣品，酶切后形成269 bp、105 bp、164 bp 3個片段，3、6泳道為TT基因型樣品，酶切后形成105 bp和164 bp 2個片段。圖1C中1、3、4泳道為AC基因型樣品，酶切后形成134 bp、36 bp、98 bp 3個片段，2泳道為AA基因型樣品，酶切后只有1條134 bp片段，5、6泳道為CC基因型樣品，酶切后形成36 bp、98 bp 2個片段。

圖1　基因分型結果Fig.1 Results of genotype

基因型、基因頻率的統計分析結果見表3。可以看出，rs742071位點上，NSCL/P組的GT基因型頻率［P= 0.013，OR=2.29（1.169～4.485）］和等位基因頻率［P= 0.015，OR=2.22（1.147～4.300）］均高于正常對照組，差異有統計學意義。rs7632427的CT、CC基因型頻率分別與TT基因型比較無統計學差異（P＞0.05），等位基因T和C在NSCL/P組和正常對照組中分布也無統計學差異（P＞0.05）。rs12543318位點上，NSCL/P組的AC基因型比正常對照組稍高，具有統計學差異（P= 0.048），AA基因型在2組間差異不明顯（P＞0.05），A等位基因頻率在2組間分布也無統計學差異。

2.3FBAT分析

FBAT分析結果顯示，rs742071位點的T等位基因從父母過渡傳遞到孩子，表明T等位基因與NSCL/P發生相關，rs7632427和rs12543318位點的等位基因沒有發生過渡傳遞。見表4。

3　討論

近期進行的多個全基因組關聯分析發現了很多與NSCL/P相關的新的基因和位點，Ludwig等［4］基于2個較大的GWAS研究結果進行了meta分析，結果驗證了之前報道的95%的與NSCL/P發生相關的基因，并且確定了6個新的易感基因，其中rs742071 （1p36），rs7632427（3p11.1）和rs12543318（8q21.3）位點與亞洲人群的NSCL/P發生相關，而rs7590268，rs8001641和rs1873147 3個位點與歐洲人群的NSCL/P發生相關。

1p36的rs742071位點位于PAX7基因的內含子區域，而PAX7基因在顱面發育過程中起重要的作用［5］，Su11等［6］在不同人群中以病例-父母核心家系為研究對象，調查了PAX7基因上的7個SNP變異與NSCL/P的關系，研究結果顯示其中2個變異從父母過度傳遞給患兒，表明PAX7的變異可能與NSCL/P發生相關。本研究發現GT基因型（P= 0.013）和G等位基因頻率（P= 0.015）在NSCL/P組和正常對照組中的分布存在統計學差異，其中攜帶GT基因型患NCSL/P的風險是GG基因型的2.29倍。FBAT分析結果顯示rs742071的T等位基因由父母過渡傳遞給孩子（P= 0.016）。以上結果表明，rs742071的GT基因型與NSCL/P的發生相關，并且T等位基因是NSCL/P發生的危險因素。本研究的結果與Su11的研究結果一致，說明PAX7可能是NSCL/P的易感基因。

3p11.1的rs7632427位點位于EPHA3基因的3’UTR區域。Agrawa1等［7］通過小鼠的胚胎表達研究發現EPHA家族基因可能是NSCL/P發生的1個因素。本研究中，沒有發現該位點的基因型和等位基因頻率的統計學差異，FBAT傳遞分析結果同樣沒有發生過渡傳遞現象，表明該位點可能與NSCL/P的發生不相關。8q21.3的rs12543318位點附近沒有相關的基因。本研究中，AC vs CC和AC+AA vs CC的P＜0.05，但是，NSCL/P組的基因頻率分布沒有明顯的統計學差異，FBAT顯示該位點沒有過渡傳遞現象的發生，說明該位點可能與NSCL/P的發生關聯不大。Pan等［8］在中國東部人群的研究同樣發現該2個位點與NSCL/P的發生不相關，但認為NSCL/P的發生與包含該2個位點在內的6個SNP位點的變異積聚效應有關，發生變異的等位基因數量越多，則越容易發生NSCL/P，當7～8個等位基因發生突變時，NSCL/P的發生風險是0～2個突變的12.67倍。所以盡管本研究中該2個位點與NSCL/P的發生都沒有相關性，但是并不排除它們與其他SNP位點相互作用引起NSCL/P。

表3　rs742071、rs7632427和rs12543318的基因型和基因頻率統計分析結果Tab.3 The statistic analysis result of genotype and gene frequency of rs742071，rs7632427 and rs12543318

表4　rs742071、rs7632427和rs12543318的FBAT統計分析結果Tab.4 The FBAT statistic analysis result of rs742071，rs7632427 and rs12543318

本研究分析了rs742071（1p36），rs7632427 （3p11.1），和rs12543318（8q21.3）3個位點與NSCL/P發生的相關性，發現rs742071的GT基因型和T等位基因可能是NSCL/P發生的因素。盡管rs7632427和rs12543318位點與NSCL/P的發生沒有直接相關性，但是也可能與其他基因相互作用進而導致NSCL/P的發生。當然本研究存在樣品量和分析位點少的不足，希望在將來的研究中，能夠納入更多的研究對象和研究位點，進而更好的發現NSCL/P發生的原因。

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（編輯于溪）

Associationbetween Nonsyndromic Cleft Lipwithorwithout Clept Palateand PAX7in Northeastern Chinese People

LUYongping1，LIZengjian2，XUWei1，LIUWei1，ZHAONing1，SUIYu1，FENGWenhua1，MAChao1，LINMeina1，HANWeitian1
（1. Liaoning Province Research Institute of Fami1y P1anning Key Laboratory of Reproductive Hea1th and Medica1 Genetics，Shenyang 110031，China；2. Department of Ora1 Surgery，The Affi1iated Stomato1ogica1 Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110002，China）

AbstractObjective To investigate the re1ationship between NSCL/P and three SNPs inc1uding rs742071，rs7632427 and rs12543318. Methods A tota1 of 134 tri-fami1y and 300 common contro1s were recruited for the study，inc1uding 258 NSCL/P patients，164 cases of patient’s father，and 195 cases of patient’s mother. PCR-RFLP was used to genotype the three SNPs，and the resu1t was ca1cu1ated by SPSS package. Results The distribution of GT genotype and T a11e1ic gene of rs742071 was statistica1 different. The FBAT resu1t a1so showed that over transmission of T a11e1ic gene from parents to chi1d. However，no statistica1 differences of rs7632427 and rs12543318 were observed. Conclusion There is corre1ation between rs742071and NSCL/Pinnortheastern Chinesepeop1e.

KeywordsPAX7；nonsyndromic c1eft 1ip with or without c1eft pa1ate；SNPs

中圖分類號R728

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0522-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.011

基金項目：遼寧省科技攻關項目（2009225007-7）；遼寧省自然科學基金（201102247）

作者簡介：盧永平（1983 -），男，助理研究員，碩士.

通信作者：韓維田，E-mai1：HWTZZF@sohu.com

收稿日期：2016-03-03