TNFAIP8在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌細胞增殖的影響

楊大磊，畢芳芳，于大海

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽110004）

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TNFAIP8在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌細胞增殖的影響

楊大磊，畢芳芳，于大海

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽110004）

摘要目的探討TNFAIP8在卵巢癌組織中的表達情況，以及TNFAIP8對卵巢癌細胞增殖能力的影響。方法采用免疫組織化學方法檢測189例卵巢癌組織中TNFAIP8蛋白的表達情況。通過雙向調控TNFAIP8基因的表達，觀察TNFAIP8對細胞增殖能力的影響。結果在189例卵巢癌組織中，TNFAIP8陽性表達率為84.66%（160/189），其陽性表達與卵巢癌的分級顯著相關。在卵巢癌細胞中上調TNFAIP8表達后，卵巢癌細胞的增殖能力顯著增加，而干擾其表達后，卵巢癌細胞的增殖能力顯著下降。結論TNFAIP8在卵巢癌組織中高表達，并且其高表達與卵巢癌的分級顯著相關。TNFAIP8過表達促進卵巢癌細胞的增殖，可能成為卵巢癌診斷治療的新靶點。

關鍵詞卵巢癌；TNFAIP8；增殖

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卵巢癌是導致女性死亡的主要惡性腫瘤之一［1］。盡管近年來卵巢癌的手術方式和藥物治療有了很大的進步，但由于卵巢癌發生的部位以及缺乏特異性癥狀和篩選方法，導致患者的整體生存率仍然很低［2-3］。因此，探索卵巢癌發生和進展的分子機制，對于深入理解該腫瘤的生物學行為并開發相應的靶向治療手段具有十分重要的意義。腫瘤壞死因子α誘導蛋白8（tumor necrosis factor α-induced protein 8，TNFAIP8）又叫SCC-S2、GG2-1和MDC-3.13，分子量為21 000，含有一個DED結構域。其作為一個腫瘤致癌基因，最初在人頭頸部鱗狀細胞癌細胞系中發現［4］，其過表達能夠被腫瘤壞死因子α和活化的核因子κB誘導，后來研究［5-9］發現TNFAIP8在前列腺癌、食道癌、肺癌、子宮內膜癌、結直腸癌等許多人類腫瘤中均發揮作用。過表達TNFAIP8能夠抑制caspase-8和caspase-3的活性，從而抑制細胞凋亡，促進乳腺癌細胞MDA-MB-435的體外增殖能力與侵襲能力［10］。TNFAIP8還能夠調節血管內皮細胞生長因子受體2、基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶9的表達［11］。然而，有關TNFAIP8在卵巢癌組織中的表達模式及其與臨床病理因素的相關性目前尚無報道，其在卵巢癌細胞中的生物學功能也未見報道。

本文中，我們研究了TNFAIP8蛋白在卵巢癌組織中的表達情況，并進行了臨床病理因素相關分析。此外，我們還在卵巢癌細胞中通過雙向調控TNFAIP8蛋白的表達，發現了TNFAIP8在卵巢癌細胞系中的促腫瘤作用，并為TNFAIP8促進卵巢癌細胞系增殖提供了證據。

1　材料與方法

1.1組織樣本

本研究通過中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準。189例卵巢癌標本來自中國醫科大學附屬盛京醫院病理科2007年至2010年的存檔蠟塊。根據WHO組織學分類標準，由2位病理醫師獨立做出組織學診斷。臨床病理信息從患者的病案記錄中獲得。所有患者在術前均未接受過化療或放射治療。

1.2免疫組織化學檢測

所有組織均經中性甲醛固定、石蠟包埋后，制成4 μm厚度的切片。切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化以及檸檬酸修復液中進行高溫高壓抗原修復2 min。采用過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，并采用正常山羊A血清孵育以減少非特異性結合位點。一抗使用單克隆鼠源性TNFAIP8抗體（1∶400，美國Abcam公司）4℃孵育過夜。以非免疫IgG代替一抗作為陰性對照。生物素標記的二抗（中國邁新生物科技有限公司）37℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木素復染，脫水，封片。每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞。根據計數細胞著色的百分比及著色的強度，對TNFAIP8的表達進行半定量評分。胞質著色視為陽性。根據細胞著色百分比分為4個等級：1，1%～25%；2，26%～50%；3，51%～75%；4，76%～100%。根據細胞著色強度分為3個等級：0，無染色；1，弱陽性染色；2，強陽性染色。TNFAIP8的表達又被劃分成3個等級：0分，無著色；1分，淺黃色顆粒；2分，深黃色或者黃褐色顆粒。每一張組織切片都對應一個百分比分數和著色分數，將二者相乘，所得的乘積（0～8分）即為該切片的最終得分。將得分≤4分定義為低表達，＞4分定義為高表達。

1.3細胞培養和轉染

人卵巢癌細胞系SKOV3從ATCC（美國Manassas）細胞庫獲得。細胞系用含有10%小牛血清（美國Invitrogen公司）的RPMI 1640（美國Gibco公司）培養基（美國Invitrogen公司）培養，并將其置于5% 的CO2細胞培養箱中培養。細胞在6孔板中培養24 h后，進行轉染。pCMV6-TNFAIP8質粒以及對照的空白質粒pCMV6購自美國Origene公司。TNFAIP8 siRNA和對照siRNA均購自美國Dharmacon公司。根據說明書，使用Attractene轉染試劑（德國Qiagen公司）對細胞進行轉染。轉染后48 h，采用PCR和Western b1ot檢測干擾效率。

1.4實時定量PCR

對于培養細胞或卵巢癌組織采用TRIZOL（美國Invitrogen公司）提取總RNA。采用ABI high capacity cDNA RT kit（美國App1ied Biosystems公司）進行反轉錄。使用ABI7900實時定量PCR儀，并使用TNFAIP8特異性探針（Hs00405413_m1）檢測其在組織與細胞中的含量，內參采用β- actin （Hs99999903_m1）。

1.5Western b1ot

采用Pierce細胞裂解液（美國Thermo公司）對細胞進行充分裂解，然后分別提取其總蛋白，取40 μg的總蛋白通過12%濃度的SDS-PAGE進行蛋白電泳，然后轉印到PVDF膜（美國Mi11ipore公司）上。1%脫脂奶粉封閉2 h，兔源性一抗TNFAIP8（1∶800，美國Sigma公司）4℃過夜。山羊抗兔鼠二抗（1∶2 000，美國Santa Cruz公司）37℃孵育2 h。ECL顯色，自動電泳凝膠成像分析儀采集結果。

1.6CCK8實驗

轉染24 h后，將腫瘤細胞以1 000/孔的密度接種在含10%小牛血清培養基的96孔板中，每孔加入20 μL CCK8溶液，37℃孵育4 h后，采用分光光度計檢測490 nm波長的吸收峰值進行定量。

1.7統計學分析

所有的數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗分析TNFAIP8表達與臨床病理因素之間的相關性。細胞增殖和TNFAIP8 mRNA數據的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1TNFAIP8在卵巢癌組織中高表達且與腫瘤分級顯著相關

為了研究TNFAIP8蛋白在卵巢癌組織中的表達情況，對189例卵巢癌組織及相應癌旁正常組織進行免疫組化染色，發現TNFAIP8蛋白主要定位于細胞質中（圖1）。TNFAIP8在正常卵巢組織中呈弱表達或不表達（圖1A），而在卵巢癌組織中呈中度表達或強表達，陽性率為84.66%（160/189）（圖1B～1H）。臨床病理因素的分析結果顯示，TNFAIP8的陽性表達與卵巢癌的分級（P= 0.031 0）顯著相關，而與患者年齡（P= 0.407 3）、組織學分型（P= 0.121 0）、FIGO分期（P= 0.290 9）不相關（表1）。

2.2TNFAIP8促進卵巢癌細胞的增殖

為了探究TNFAIP8在卵巢癌細胞中的潛在功能，在SKOV3細胞中分別轉染TNFAIP8質粒和特異性siRNA，上調和下調TNFAIP8的表達量，并通過Western b1ot和實時定量PCR驗證其轉染效率。結果發現，轉染TNFAIP8質粒后，SKOV3細胞中TN-FAIP8蛋白表達顯著上升，而干擾掉TNFAIP8后，其表達顯著下降（圖2A）。CCK-8增殖實驗結果顯示，轉染TNFAIP8質粒后，細胞的增殖能力顯著高于對照組，而干擾掉TNFAIP8后，細胞的增殖能力顯著下降（圖3）。

表1　TNFAIP8表達與臨床病理因素的關系Tab.1 Distribution of TNFAIP8 status in colorectal cancer according to clinicopathological characteristics

圖1　卵巢組織中TNFAIP8的表達模式Fig.1 Expression pattern of TNFAIP8 protein in ovarian tissues

圖2　Western blot及RT?PCR檢測TNFAIP8的轉染及干擾效率Fig.2 Transfection and interference efficiency of TNFAIP8detected by Western blot and RT?PCR

圖3　TNFAIP8對SKOV3細胞增殖的影響Fig.3 Effect of TNFAIP8on the proliferation of SKOV3

3　討論

TNFAIP8家族參與許多的生命過程，包括免疫平衡、細胞程序性死亡、信號轉導、腫瘤細胞的發生以及腫瘤的發展進程。它是新近發現的一種與腫瘤高度相關的蛋白，在人體內由TNFAIP8基因編碼而成。在腫瘤發展進程中它的主要功能為細胞凋亡的負性調節因子，主要通過抑制細胞凋亡酶功能從而抑制腫瘤壞死因子介導的細胞凋亡，并能夠導致半胱氨酸蛋白酶失活。

已有研究報道TNFAIP8在許多腫瘤中高表達，包括胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等，并且該蛋白高表達與腫瘤的發生發展顯著相關。有報道稱，胰腺癌細胞中TNFAIP8通過表皮生長因子受體信號通路參與癌細胞的局部浸潤轉移，影響胰腺癌的預后情況。然而，有關TNFAIP8在卵巢癌中的表達情況及其與臨床病理因素的相關性尚無文獻報道。本文中，我們發現TNFAIP8在卵巢癌組織中的表達顯著高于正常組織，并且其高表達與腫瘤的分級顯著相關。此外，我們在卵巢癌細胞系中雙向調控TNFAIP8的表達，發現上調TNFAIP8蛋白水平的表達能顯著增加細胞的增殖能力，而干擾掉TNFAIP8的蛋白表達后，細胞的增殖能力顯著下降。

TNFAIP8是近年來發現的一個抗凋亡分子，其過表達能夠被活化的核因子κB誘導［7］，有文獻［10］報道TNFAIP8在乳腺癌細胞中作為一個抗凋亡分子，促進乳腺癌細胞的增殖以及腫瘤的形成。還有文獻［9］報道TNFAIP8在大腸癌中高表達，并且能通過上調Cyc1in D1促進細胞周期，進而促進大腸癌細胞的增殖，以上結果說明TNFAIP8可能通過抑制凋亡和促進細胞周期的進程來促進腫瘤細胞的增殖。因此我們推測，在卵巢癌細胞中TNFAIP8可能也是通過抑制細胞凋亡和/或促進細胞周期的進程進而促進卵巢癌細胞增殖的，推測的準確性需要進行進一步實驗去驗證。

綜上所述，我們的研究發現TNFAIP8在卵巢癌組織中高表達，其高表達與腫瘤的分級顯著相關。此外，通過細胞學實驗，我們還發現TNFAIP8能促進卵巢癌細胞的增殖。TNFAIP8可能成為卵巢癌診斷和治療的一個新靶點。

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（編輯陳姜）

Overexpressionof TNFAIP8andthe Influenceon Cell Proliferationin Ovarian Cancer

YANGDa1ei，BIFangfang，YUDahai
（Departmentof Obstetricsand Gyneco1ogy，Shengjing Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110004，China）

AbstractObjective To study the expression of TNFAIP8 in human ovarian cancer and exp1ore its bio1ogica1 function in ovarian cancer ce11s. Methods The expression pattern of TNFAIP8 was ana1yzed in 189 ovarian cancer tissues by immunohistochemistry.TNFAIP8 siRNA and p1asmid were app1ied to exp1ore the inf1uence of TNFAIP8 on ce11 pro1iferation. Results TNFAIP8 was overexpressed in 160 of 189（84.66％）ovarian cancer specimens. There was a significant association between TNFAIP8 overexpression and grade. Up-regu1ated expression of TNFAIP8 in ovarian cancer ce11 can promote ce11 pro1iferation. Converse1y，dep1etion of TNFAIP8 in ovarian cancer ce11 inhibited ce11 growth. Conclusion TNFAIP8 is overexpressed in ovarian cancer and significant1y associated with grade of tumor. Overexpression of TNFAIP8 cou1d promote the pro1iferation of ovariancancerce11s， whichmakesTNFAIP8acandidateoftherapeutictargetsforovariancancertreatment.

Keywordsovarian cancer；TNFAIP8；pro1iferation

中圖分類號R321-33

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0526-05

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.012

基金項目：遼寧省科學技術計劃博士啟動基金（201501011）

作者簡介：楊大磊（1981 -），男，技師，碩士.

通信作者：畢芳芳，E-mai1：bifangfang168@163.com

收稿日期：2016-03-07