超廣譜β-內酰胺酶基因分型特點及其對抗生素敏感性分析

招鉅泉馬均寶劉紅軍

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超廣譜β-內酰胺酶基因分型特點及其對抗生素敏感性分析

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【摘要】目的 探討超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的基因分型特點及其對抗生素的敏感性。方法 選取2014年8月至2015年8月從佛山市南海區第四人民醫院收治的不同住院患者，及其不同部位有效分離出來的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，對所有菌株實施科學化的分離與鑒定，然后采用紙片擴散的藥敏實驗方式來明確超廣譜β-內酰胺酶的基因分型情況，觀察所有菌株對抗生素藥物的敏感情況。結果 從大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株中確認出來的超廣譜β-內酰胺酶菌株有120株，其中40株大腸埃希菌中攜帶TEM型基因占45%，80株肺炎克雷伯菌單獨攜帶有TEM 型β-內酰胺酶基因占25%。此外，超廣譜β-內酰胺酶細菌對于頭孢菌素類以及青霉素類抗生素的實際敏感性為0%～40%。結論 超廣譜β-內酰胺酶細菌的基因分型以TEM型為主，且具有相對較強的耐藥性。

【關鍵詞】超廣譜β-內酰胺酶；基因分型；抗生素；敏感性

1佛山市南海區第四人民醫院檢驗科，廣東佛山 528200

2佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東佛山 528000

3廣州達安臨床檢驗中心有限公司實驗室，廣東廣州 510000

現階段，大腸埃希菌以及肺炎克雷伯菌屬于臨床上比較常見的病菌，從某種程度上講也是醫院感染科比較常見的致病菌［1］。目前，隨著頭孢菌素在臨床中的廣泛使用，超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌的感染情況也越來越嚴重，這是β-內酰胺類型抗生素產生耐藥性的重要原因之一。超廣譜β-內酰胺酶主要是由質粒介導，非常容易在同一種屬或者是不同種屬之間的細菌進行傳遞，進而形成暴發流行，最終給治療帶來困難，包括患者的病死率不斷增高、住院時間日益延長、治療費用上升以及治療過程中的選擇性不斷狹窄等［2］。而且，隨著新型抗生素在臨床中的應用，相關人員更應該對超廣譜β-內酰胺酶抗生素的敏感性實施科學化分析研究［3］。為探討超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的基因分型特點及其對抗生素的敏感性，本研究選取2014年8月至2015年8月我院收治的不同住院患者及其不同部位有效分離出來的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，并將其作為分析研究對象，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2015年8月我院收治的不同住院患者及其不同部位有效分離出來的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，對研究中的所有菌株采用常規方法以及板條進行科學化鑒定，具體質控菌株是大腸埃希菌，型號為ATCC25922。

1.2 方法

1.2.1 紙片擴散法實施藥敏實驗 借助雙紙片協同試驗方法進行初篩，具體操作方法是將阿莫西林棒酸紙片放置于培養皿中央，然后在其周圍20 mm位置貼上頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片、頭孢曲松紙片以及氨曲南紙片?？股丶埰徲贠x-oid有限公司，在35 ℃條件下科學培養18 h，當阿莫西林棒酸紙片以及周圍其他紙片之間出現協同性抑菌作用時，則可初篩診斷為超廣譜β-內酰胺酶呈現為陽性。初篩實驗完成后，再采用濃度梯度方法進行確認，采用瑞士公司提供的標準化Etest（E試驗）試條，根據規范化方法進行操作。Etest試條主要包括含有或不含有棒酸的氨曲南藥物成分、頭孢他啶藥物成分以及頭孢噻肟藥物成分，其中棒酸可以使最小抑菌濃度（MIC）下降約8倍以上，可以診斷為ESBLs呈現為陽性。

1.2.2 核型的檢測方法與電泳檢測方法 采用美國公司提供的相關檢測工具，該檢測過程主要包括菌細胞的溶解、菌株DNA片段在凝膠電泳方面的分離、限制性內切酶EcoRⅠ對細菌DNA專業化的酶切情況，以及將大腸桿菌與肺炎肺炎雷伯菌rRNA所操縱的DNA探針和所分離出來的DNA片段之間的雜交情況。嚴格根據DNA具體位置以及強度實施自動化核型分析與比較。如果相似系數≥0.93，則可判定為相同核型。在脈沖場的凝膠電泳檢測方法中采用限制性內切酶類型SpeⅠ的消化細菌DNA，然后利用濃度為1%的瓊脂糖凝膠在CHEF-DRⅡ型電泳儀上實施檢測。脈沖時間控制在5～60 s，溫度13 ℃，電壓200 V，實際電泳時間控制在23 h，比較每一菌株在電泳條帶上的變化情況，當3條以上電泳帶存在差異時，則可認為是不同分型；當1～3條條帶存在差異時，可認為是不同亞型。在β-內酰胺酶的制備過程中，需要將細菌接種于5 ml胰大豆液中進行過夜培養，然后再選取劑量為0.5 ml，并稀釋至為9.5 ml相對新鮮的胰大豆液中，在37 ℃條件下進行振蕩培養約5 h，確保離心收集的細胞懸浮于250 μl 0.2 mol/L pH值為5.5的醋酸鈉中，將干冰和37 ℃的水進行反復凍融，冰浴約30 min，收集上清β-內酰胺酶粗提物，-37 ℃保存，將其作為電聚焦的電泳樣品。電聚焦電泳檢測過程，需要在含有兩性的電解質標準化聚丙烯酰胺的凝膠上實施，其兩性電解質pH在3.5～9.5、5.5～8.5以及4.0～6.5，并采用已知等電點值進行判定標準。

1.3 觀察指標 觀察超廣譜β-內酰胺酶的實際基因分型特征以及對抗生素的實際敏感性。

2 結果

2.1 超廣譜β-內酰胺酶檢出情況 經過紙片擴散法從大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株中確認出來的超廣譜β-內酰胺酶菌株有120株，其中包括大腸埃希菌40株和肺炎雷伯菌80株，得出大腸埃希菌的超廣譜β-內酰胺酶實際檢出率為40.0%，而肺炎雷伯菌的實際檢出率為53.3%；不同標本所進行分離出來的超廣譜β-內酰胺酶細菌存在差異性。120株超廣譜β-內酰胺酶菌株中，呼吸科檢出56例（46.7%），重癥監護病房（ICU）檢出30例（25.0%），老年科檢出25例（20.8%），燒傷科檢出9例（7.5%），不同科室的分離情況存在差異性。這種情況可能與抗生素應用情況有著密切關系。

2.2 超廣譜β-內酰胺酶基因分型情況 從基因分型情況上進行分析，40株大腸埃希菌中，單獨攜帶有TEM型β-內酰胺酶基因有18株（45.0%），單獨攜帶SHV型基因有3株（7.5%），同時攜帶SHVB-內酰胺酶基因基因與TEM型基因的有19株（47.5%）。80株肺炎克雷伯菌基因分型中，單獨攜帶有TEM型β-內酰胺酶基因有20株（25.0%），單獨攜帶SHV型β-內酰胺酶基因有8株（10.0%），同時攜帶SHV型基因以及TEM型基因的β-內酰胺酶基因有52株（65.0%）。

2.3 超廣譜β-內酰胺酶對抗生素藥物的敏感性情況 超廣譜β-內酰胺酶細菌對于頭孢菌素類以及青霉素類的實際敏感性為0%～40%。青霉素類與頭孢菌素類以及加酶抑制劑之間的合劑對于超廣譜β-內酰胺酶細菌的實際效果好于未加酶抑制劑的實際效果，而且哌拉西林他唑巴坦以及頭孢哌酮舒巴坦的抗生素敏感性相對較高，均＞30%。超廣譜β-內酰胺酶細菌對于亞胺培南、美羅培南以及多黏菌素B的敏感性均為100.00%，對于頭孢唑林、哌拉西林以及頭孢噻肟的敏感性均為0.00%。拉氧頭孢以及頭孢西丁的敏感性也相對較高，分別為78.03%以及68.25%，見表1。

表1 超廣譜β-內酰胺酶對抗生素的敏感性情況（%）

3 討論

現階段，從某種程度上講，超廣譜β-內酰胺酶的出現屬于第3代頭孢菌素最終選擇的結果，其中肺炎克雷伯菌以及大腸埃希菌屬于比較典型的代表菌，而且不同國家以及地區之間因抗生素使用情況的差異（使用種類以及數量）而不同，其基因分型也存在較大差異［4］。一般情況下，超廣譜β-內酰胺酶細菌雖然會對頭孢類抗生素具有較強耐藥性，盡管個別細菌體外試驗相對敏感，但體內治療效果卻不明顯［5］。此外，因細菌所攜帶的超廣譜β-內酰胺酶細菌質粒能夠同時攜帶喹諾酮類、氨基糖甙類以及磺胺類等藥物的耐藥基因，所以可以使超廣譜β-內酰胺酶細菌存在多種耐藥表型［6］。在基因分型方面，核型分析屬于自動過程，操作方法相對簡單、快捷，但是因所反映rRNA基因的相關區域酶切位點出現改變，且分辨率較低，所以只能進行初步分型，尤其是對于分型情況存在差異者，可以做出流行病學的不相關結論，核型相同的情況下需要進行脈沖場的凝膠電泳分型，其分辨率較高，能夠反映基因相關性，效果顯著［7］?？傊?，超廣譜β-內酰胺酶細菌具有較強耐藥性，且耐抗生素的種類相對較多，在臨床上應高度重視超廣譜β-內酰胺酶細菌的檢測以及監測，避免引起醫院大面積的流行感染。

本研究中，超廣譜β-內酰胺酶細菌具有較強的多重耐藥性，而且超廣譜β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌以及大腸埃希菌均攜帶了不同程度上的SHV型和TEM型β-內酰胺酶基因，超廣譜β-內酰胺酶細菌對于頭孢菌素類以及青霉素類抗生素的實際敏感率性為0%～40%。針對所需研究的第一亞群情況對β-內酰胺酶細菌情況進行基因分型調查，所分離出的β-內酰胺酶細菌菌株以及攜帶有TEM型的β-內酰胺酶細菌菌株情況與郭小兵等［1］研究的菌株類型相比較具有一致性，然而不同基因分型情況所占比率有較大差異［8］。說明超廣譜β-內酰胺酶細菌的基因分型以TEM型為主，且具有相對較強的耐藥性。

參考文獻

［1］ 郭小兵,代志峰,宋海容,等.CTX-M-38型超廣譜β-內酰胺酶快速檢測方法的建立［J］.鄭州大學學報（醫學版）,2014,11（1）:66-69.

［2］ 蔣鴻超,奎莉越,黃海林,等.兒童產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌Ⅰ類整合子及其與ESBLs基因關系的研究［J］.臨床兒科雜志, 2015,12（4）:345-347.

［3］ 賈芳,周學章.SHV-12型超廣譜β-內酰胺酶的原核表達及免疫原性分析［J］.寧夏大學學報（自然科學版）,2011,32（2）:164-167.

［4］ 侯佳惠,童郁,費靜嫻,等.銅綠假單胞菌超廣譜β-內酰胺酶、質粒介導AmpC酶基因分布及流行特征分析［J］.檢驗醫學,2012,27（1）: 39-43.

［5］ 徐艷霞,陳建麗,王和,等.兒童重癥監護室產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐藥基因及其流行病學特征［J］.中華實用兒科臨床雜志,2015,30（10）:738-742.

［6］ 王曉麗,陳趙慧,李興華,等.314株銅綠假單胞菌超廣譜β-內酰胺酶及AmpC酶的分布及多藥耐藥性分析［J］.中國實驗診斷學,2014,10（6）:978-981.

［7］ 郭桐生,崔恩博,鮑春梅,等.病毒性肝炎后肝硬化住院患者血液感染大腸埃希菌超廣譜β-內酰胺酶基因型調查［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志,2013,27（5）:348-350.

［8］ 劉亞麗,徐和平,肖盟,等.評估紙片擴散法與Vitek2-compact GN13測定腸桿菌科細菌體外藥敏及ESBLs可靠性的研究［J］.中華微生物學和免疫學雜志,2015,12（2）:139-145.

【中圖分類號】R446.5

【文獻標志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.05.088

作者簡介：招鉅泉（1964.03-），大專學歷，副主任檢驗師。主要從事微生物學方向的研究