PA-MSHA對膿毒癥/嚴重膿毒癥大鼠腸道ICAM-1、VCAM-1表達的影響

方喆琦，李新宇，魏玉英，安宗仁，段　越，于　洋

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PA-MSHA對膿毒癥/嚴重膿毒癥大鼠腸道ICAM-1、VCAM-1表達的影響

方喆琦1，李新宇2，魏玉英2，安宗仁1，段越1，于洋1

【摘要】目的研究銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株（pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin，PAMSHA）預給藥對膿毒癥/嚴重膿毒癥大鼠腸道細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesionmolecule-1，ICAM-1）及腸血管細胞間黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）表達的影響。方法SPF級雄性SD大鼠共40只，隨機分為5組，空白組、膿毒癥組、嚴重膿毒癥組給予生理鹽水注射液皮下注射0.3 ml/d，PA-膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組預先PA-MSHA皮下注射0.3 ml/d，連續給藥7 d，第8天根據Gonnert人糞便懸液腹腔注射法改良制造大鼠膿毒癥/嚴重膿毒癥模型。成模后監測生命體征，留取一部分腸組織，制作普通病理切片蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色鑒定，另取部分腸組織并用酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）大鼠腸ICAM-1、VCAM-1表達水平。結果（1）HE染色結果顯示與空白組對比，各組均發生形態改變；（2）五組之間腸道ICAM-1（F=33.337，P＜0.001）、VCAM-1（F=12.714，P＜0.001）表達水平差異有統計學意義；（3）進一步比較ICAM-1表達水平可知，膿毒癥組表達水平高于PA-膿毒癥組（P＜0.05），嚴重膿毒癥組表達水平低于PA-嚴重膿毒癥組（P＜0.05）；（4）比較VCAM-1表達水平，膿毒癥組表達水平高于PA-膿毒癥組（P＜0.05），嚴重膿毒癥組表達水平與PA-嚴重膿毒癥組相比差異無統計學意義（P=0.262）。結論（1）腹腔感染導致的膿毒癥/嚴重膿毒癥均可使大鼠腸道ICAM-1、VCAM-1表達水平升高；（2）PA-MSHA預給藥能抑制膿毒癥大鼠腸道ICAM-1、VCAM-1的表達水平；（3）在嚴重膿毒癥大鼠組中，所測得ICAM-1和VCAM-1水平不能準確反映出PA-MSHA對其作用，可能與腸上皮細胞和炎性細胞大量壞死有關。

【關鍵詞】膿毒癥；銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株；細胞間黏附分子-1；血管細胞粘附分子-1

E-mail: 124617095@qq.com

作者單位： 1.832003，新疆石河子大學醫學院臨床醫學院；
2.830000，新疆軍區烏魯木齊總醫院重癥醫學科

膿毒癥是指宿主存在嚴重的、危及生命的感染和器官功能障礙，機體對病原體做出不恰當的免疫反應引起的全身炎性反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS）［1]。Angus等［2]研究表明膿毒癥已成為重癥監護病房非心臟患者死亡的主要原因。腹腔感染導致的膿毒癥并發多器官功能障礙 （multiple organ dysfunction syndrome， MODS）也是外科重癥監護病房患者常見的死亡原因之一［3]。炎性細胞向感染部位移行是其發揮抗感染作用的重要前提，細胞間黏附分子在其中發揮了重要作用，ICAM-1、VCAM-1均屬于CAM免疫球蛋白超家族中的成員。膿毒癥時，活化的內皮細胞表面的ICAM-1和VCAM-1可與相應配體相結合，介導炎性細胞與內皮細胞的黏合作用，這是炎性細胞募集至感染部位的重要前提。

PA-MSHA是牟希亞教授用生物工程技術培育的具有雙向免疫調節及殺傷腫瘤細胞作用的生物藥品［4]，目前已廣泛應用于臨床腫瘤輔助治療。已有實驗表明，PA-MSHA可降低感染小鼠的病死率［5]，其參與抗感染過程機制也成為近年研究的熱點。筆者通過研究預防性給予PA-MSHA對膿毒癥/嚴重膿毒癥大鼠腸道ICAM-1和VCAM-1的影響，探討PA-MSHA對膿毒癥的預防作用，為PA-MSHA在抗感染領域的應用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物選取健康清潔SPF級雄性SD大鼠共40只，體重250～300 g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供［生產許可證編號：SCXK（新）2011-0004］。

1.2儀器與試劑AF-858型自動酶標分析儀（上海安泰分析儀器有限公司）；LXJ-IIB型離心機（上海安亭科學儀器廠）；純水儀（美國Hi-tech Instruments產品）；分析天平（Denver Instrument）；制冰機（廈門國儀 GYXH-155）。PA-MSHA（北京萬特爾生物制藥有限公司）；巰基乙酸鈉、硫酸鋇（國藥集團化學試劑有限公司）；過氧化氫酶（SIGMA）；甘油（AMERSCO）；戊巴比妥鈉（MERCK）；不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）蛋白酶抑制藥（ROCHE）； 苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF） （BIOSHARP）；Rat ICAM-1 ELISA 試劑盒（上海巧伊）；Rat VCAM-1 ELISA 試劑盒（武漢貝英萊）。所有試劑均在有效期內使用。

1.3實驗方法及分組按隨機數表法將SD大鼠隨機分為5組，每組8只：（1）空白組；（2）膿毒癥組；（3）PA-膿毒癥組；（4）嚴重膿毒癥組；（5）PA-嚴重膿毒癥組。連續給藥7 d，空白組、膿毒癥組、嚴重膿毒癥組分別給予0.9 %氯化鈉注射液0.3 ml/（只·d）背部皮下注射；PA-膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組分別給予PA-MSHA 0.3 ml/（只·d ） 背部皮下注射（注：PAMSHA含菌1.6～2.0×109/ml）。

根據Gonnert人糞便懸液腹腔注射法改良［6]，制造糞便混懸液。收集并混合3個健康非素食成人的糞便，迅速按1∶1（V/V）稀釋于預先配置的巰基乙酸鹽懸液（14.5 g巰基乙酸鹽，50 g硫酸鋇，500 ml雙蒸水） 中以優化細菌生長，加入過氧化氫酶（0.019 mg/100 ml）以滅活活性氧。繼續加入10%甘油，厭氧條件下勻漿。分裝于10 ml EP管中，-60 ℃冰箱保存［7]。第8天膿毒癥模型制造，空白組取3 ml 0.9%氯化鈉注射液經大鼠右下腹腹腔注射；膿毒癥組、PA-膿毒癥組取1.6 ml/kg糞便懸液，0.9%氯化鈉注射液稀釋至3 ml，經大鼠右下腹腹腔注射；嚴重膿毒癥組、PA-嚴重膿毒癥組取4 ml/kg糞便懸液，0.9%氯化鈉注射液稀釋至3 ml，經大鼠右下腹腹腔注射。

1.4測定指標

1.4.1成模標準表現為蜷縮、嗜睡、眼角出現分泌物、發熱、寒顫、豎毛、全身乏力、運動活性降低、攝食減少［7，8]。血培養陽性為膿毒癥成模標準。嚴重膿毒癥成模標準為膿毒癥標準合并至少一個組織或器官血流灌注不足或功能障礙。

1.4.2剖腹探查及標本采集建模成功后，用3%戊巴比妥鈉注射液麻醉大鼠，固定于無菌操作臺，頸部與腹部常規消毒、鋪巾，分離右側頸總動脈，留置動脈導管監測血壓，行剖腹探查術，觀察腸道大體形態，留取距離十二指腸球部遠端10 cm處空腸組織約2 cm，生理鹽水沖洗干凈腸管內、外側血液和糞便，置于無菌凍存管中，迅速保存于-60 ℃冰箱。另留取遠端腸組織約2 cm，置于4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色后在光鏡下觀察組織病理形態變化。

1.5制備腸組織勻漿用無菌眼科剪取腸組織塊（約0.2 g），在常溫生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干。置于10 ml無菌EP管中，用眼科剪將組織剪碎。將液氮倒入EP管，將搗桿（玻璃棒）垂直插入EP管中，轉動研磨數40次（5 min左右），充分研碎，使組織勻漿。加入提前配置好的蛋白裂解液，按照0.1 g組織加入1 ml蛋白裂解液的比例加入，制備待分離液，冰水浴2 h。冰水浴結束后，4 ℃離心機高速離心（12 000 r/min，20 min），取上清200 μl每管分裝，保存于-60 ℃冰箱，待測。

1.6酶聯免疫吸附劑測定將Rat ICAM-1 ELISA、Rat VCAM-1 ELISA試劑盒室溫平衡20 min。鋁箔袋中取出所需板條，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品100 μl。樣本孔先加待測樣本50 μl，再加樣本稀釋液50 μl；空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，28 ℃室溫孵育1 h。之后棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。每孔加入底物A、B 各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μl，15 min 內，在450 nm 波長處測定各孔的OD值。繪制標準曲線，在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.7統計學處理應用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1大體觀察注射糞便混懸液6 h左右，大鼠開始出現膿毒癥癥狀，蜷縮、嗜睡、豎毛、攝食減少、對外界刺激運動活性降低。7 h經頸動脈抽血做血培養提示大腸埃希菌陽性。部分嚴重膿毒癥大鼠出現點頭樣呼吸。解剖后，空白組腸管呈粉紅色，血供良好；膿毒癥組腸管色澤較暗，腸壁廣泛充血、水腫，可見部分腸管積氣；肉眼無法分辨膿毒癥組和PA-膿毒癥組大體標本區別；嚴重膿毒癥組腸壁彌漫性充血水腫，腸管粘連，蒼白；肉眼無法分辨嚴重膿毒癥組和PA-嚴重膿毒癥組大體標本區別。

2.2石蠟切片HE染色空白組腸上皮細胞完整，上皮和固有層連接緊密無縫隙，無炎性細胞浸潤，腸腺體正常（圖1A）。膿毒癥組部分腸上皮細胞核固縮，固有層水腫，少量中性粒細胞浸潤，固有層邊緣少量毛細血管擴張、充血（圖1B）。PA-膿毒癥組可見小腸絨毛頂端上皮細胞脫落，嗜酸性粒細胞浸潤（圖1C）。嚴重膿毒癥組部分切片可見小腸絨毛壞死，大部分細胞形態不存在，偶見單個中性粒細胞，固有層毛細血管充血，腸腺體形態存在（圖1D）。PA-嚴重膿毒癥組上皮細胞大量核固縮，固有層明顯水腫，中性粒細胞及嗜酸性粒細胞浸潤，毛細血管擴張、充血明顯（圖1E）。

圖1　各組大鼠腸上皮細胞病理學改變（HE，×400）

2.3ICAM-1檢測五組之間ICAM-1表達差異有統計學意義（F=33.337，P＜0.001）；進一步兩兩比較結果顯示，膿毒癥組（P=0.044）和嚴重膿毒癥組（P＜0.001）ICAM-1表達與PA-膿毒癥組比較，差異有統計學意義（圖2）。

圖2　大鼠腸組織ICAM-1表達水平

2.4VCAM-1檢測五組之間VCAM-1表達差異有統計學意義（F=12.714，P＜0.001）；進一步兩兩比較結果顯示，膿毒癥組（P=0.044）、嚴重膿毒癥組（P=0.262）VCAM-1表達與PA-膿毒癥組比較差異無統計學意義（圖3）。

圖3　大鼠腸組織VCAM-1表達水平

3　討　論

腹腔感染是指各種病原菌引起的腹腔內感染，通常為腸桿菌科細菌、腸球菌屬和擬桿菌屬等混合感染［9]。一旦發生腹腔感染，有可能導致短時間內大量細菌與毒素入血，引起SIRS，甚至MODS而危及生命，病死率高達24%［10]。筆者根據Gonnert人糞便懸液腹腔注射法制造大鼠膿毒癥/嚴重膿毒癥模型，既避免了傳統盲腸結扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）方法造成的大鼠腸管壁直接破損對ICAM-1和VCAM-1表達的影響，又保留了大鼠腸道相對密閉性，在造模初期大鼠腸道黏膜屏障系統仍完整存在。當糞便混懸液注入大鼠腹腔后，局部發生炎性反應，釋放入血的炎性介質使得毛細血管通透性增加，致病菌入血形成菌血癥，進一步發展為SIRS。隨著疾病加重，機體有效循環血量急劇減少，在交感-腎上腺髓質系統作用下全身血液重新分布，非重要器官例如胃腸道血管嚴重收縮。由于腸黏膜血流量急劇減少，黏膜缺血、水腫、血管通透性顯著增加，腸黏膜糜爛甚至形成應激性潰瘍，胃腸黏膜屏障功能遭到破壞。在上述病理生理狀態下，外源性致病菌可進一步發生腸道定植，連同腸道內原本存在的細菌和大量內毒素突破腸黏膜屏障系統進入肝、脾、肺以及全身血液循環，引起大量炎性介質釋放，導致腸源性膿毒癥。本實驗造模7 h后采血做血培養提示大腸埃希菌陽性，說明膿毒癥模型制造成功，該模型穩定，膿毒癥成模率達100%。

炎性反應發生時，在多種細胞因子作用下，ICAM-1在細胞表面表達迅速上調，與文獻［11］相似。另有研究表明，腸道微血管內皮細胞ICAM-1及其在中性粒細胞上的配基CD11b/CD18表達上調，可介導中性粒細胞與局部血管內皮細胞粘附、相互作用、激活中性粒細胞，釋放氧自由基和蛋白水解酶類，這是引起缺血和再灌注早期腸損傷的重要因素［12]。抑制ICAM-1表達，有助于降低胰腺炎腸黏膜血管內皮功能障礙的嚴重程度，降低局部IL-1表達和白細胞聚集濃度［13]。VCAM-1與ICAM-1結構相似，在哮喘患者的血清VCAM-1的水平升高，這可能與嗜酸性粒細胞的移行有關［14，15]。此外研究證實，阻斷ICAM-1、VCAM-1的表達可減輕腦缺血炎性， 改善神經功能， 預防和治療腦缺血損傷［16]。

在本實驗中，與空白組相比，其余四組腸道ICAM-1 和VCAM-1表達水平均升高，這與前文所述多項研究結果一致。膿毒癥發生時，大量炎性介質釋放入血，通過上調ICAM-1、VCAM-1表達水平，促進炎性細胞向感染部位移行，發揮抗炎作用。另一方面，ICAM-1、VCAM-1表達增加，促使炎性細胞釋放更多炎性介質，過量的炎性介質加劇缺血再灌注損傷，加重破壞腸黏膜屏障功能，導致更多致病菌和內毒素入血，形成惡性循環，加重膿毒癥。石蠟切片染色，證明了上述推論。與空白組相比，其余四組小腸黏膜均有不同程度的炎性細胞彌漫，符合急性炎性反應和過敏性炎性的特點。

進一步比較，膿毒癥組ICAM-1、VCAM-1表達水平均高于PA-膿毒癥組，說明PA-MSHA預給藥可抑制膿毒癥大鼠腸道ICAM-1和VCAM-1的表達。這一調節機制可從以下三方面說明：（1）PA-MSHA可通過降低膿毒癥大鼠血中促炎因子濃度（ TNF-α、IL-6等），從而降低促炎因子對ICAM-1和VCAM-1的直接活化作用，使ICAM-1和VCAM-1表達下調；（2）PA-MSHA能夠減少TLR4受體在免疫細胞膜上的表達，通過抑制TLR4—NF-κB—促炎性因子通路，減少促炎因子TNF-α、IL-6等釋放，從而有效抑制炎性級聯反應，減輕了大鼠腸黏膜損傷；（3）PA-MSHA可通過增加抑炎因子IL-10產生和升高外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例，發揮抗感染作用的同時調節機體免疫功能，減輕炎性反應。這與近年多項研究結果一致，說明PA-MSHA可減輕LPS誘發的膿毒癥的炎性反應［17，18]。

在嚴重膿毒癥組的比較中，這一現象并不明顯。嚴重膿毒癥組ICAM-1表達水平低于PA-嚴重膿毒癥組，而VCAM-1表達水平差異無統計學差異，說明PAMSHA對嚴重濃度癥大鼠ICAM-1和VCAM-1的調節作用并不一致。進一步分析可能的原因，從病理結果可以看到，嚴重膿毒癥大鼠腸黏膜發生了嚴重的缺血、水腫，腸黏膜上皮細胞和可能存在的炎性細胞大量壞死，壞死細胞釋放出可使ICAM-1和VCAM-1失活的酶類。因此，此時測得的ICAM-1和VCAM-1受細胞壞死程度影響，并不能準確反映出PA-MSHA的作用。PAMSHA對嚴重膿毒癥大鼠腸ICAM-1和VCAM-1的影響仍需進一步的研究。

綜上所述，本研究證實了PA-MSHA預給藥能降低輕癥或早期膿毒癥大鼠腸組織ICAM-1、VCAM-1表達水平，從而減輕腸道的炎性反應，減輕膿毒癥。但是在嚴重膿毒癥大鼠組中，這一作用并不明顯。

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（2016-02-22 收稿2016-04-18 修回）

（責任編輯宋宮儒）

Effect of PA-MSHA on expression of ICAM-1 and VCAM-1 of intestinal tract in septic/severe septic rats

FANG Zheqi1，LI Xinyu2，WEI Yuying2，AN Zongren1，DUAN Yue1， and YU Yang1. 1. Department of Clinical Medicine， Medical College of Shihezi University，Xinjiang Uygur Autonomous Region， Shihezi 832002，China； 2. Department of Intensive Care Unit，Urumchi General Hospital of Xinjiang Military Command， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China
Corresponding author：LI Xinyu，E-mail: lxy_icu@163.com

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of pre-administration of pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin （PA-MSHA） on the expression of intestinal intercellular cell adhesionmolecule-1 （ICAM-1） and vascular cell adhesion molecule 1 （VCAM-1）in septic/severe septic rats. Methods40 healthy SPF rats were randomly divided into five groups: blank group， the septic group and the severe septic group were given normal saline subcutaneous injection of 0.3 ml/day and PA-septic group and the PA-severe septic group were given PA-MSHA subcutaneous injection of 0.3 ml/d for 7 consecutive days. At the 8th day， five groups underwent intraperitoneal injection of the modified Gonnert human stool suspension to make septic/severe septic rat models. After monitoring vital signs， intestinal tissue from five groups was harvested and analyzed with HE staining and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） to detect the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the intestinal tissue of rats. Results（1） HE staining showed that the morphological changes compared with blank group； （2）The average expression of ICAM-1 （F=33.337，P＜0.001） and VCAM-1 （F=12.714，P＜0.001） in intestinal tract shown statistically significant differences of five groups； （3） The expression of ICAM-1 was increased in septic group compared with PA-sepsis group （P＜0.05）， and severe septic group was increased PA-MSHA group （P＜0.05）. （3） The expression of VCAM-1 was increased in sepsis group compared with PA-sepsis group （P＜0.05）， and there was no significant difference in the expression of VCAM-1 between the severe septic group and PA-severe sepsis group （P=0.262）. Conclusions（1） The expression of ICAM-1 and VCAM-1 in intestinal tract in septic/severe septic rats was increased. （2） PA-MSHA pretreatment can inhibit the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in intestinal tract in septic group. （3） In severe septic rats， the level of ICAM-1 and VCAM-1 can not accurately reflect the effect of PA-MSHA. The reason may be related to necrosis ofintestinal epithelial cells and inflammatory cells.

【Key words】sepsis； pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin； intercellular cell adhesionmolecule-1； vascular cell adhesion molecule-1

【中國圖書分類號】R631

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.05.003

基金項目：全軍十二五課題（CWS11J236）

作者簡介：方喆琦，碩士研究生在讀，醫師，

通訊作者：李新宇，E-mail：lxy_icu@163.com