水飛薊中木脂素的發現及其生物活性研究

張艷 彭玉勃 陳效忠 宋麗艷

[摘要]以蒸餾水為溶劑回流提取水飛薊種子，提取物依次過D101大孔樹脂、MCI樹脂、MPLC色譜、HPLC色譜等色譜分離純化得到7個化合物。經NMR解析確定化合物1～7分別為tricin 4′O[threoβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（1）， tricin 4′O[erythroβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（2）， 5′methoxyhydnocarpinD（3）， palstatin（4），（8R，7′S，8′R）5，5′dimethoxy7oxolariciresinol 9′ODxylopyranoside（5）， 9ODglucopyranoside（6），（-）haplomyrtoside（7）。化合物1，3～5具有較強的抗流感病毒（H5N1）活性， IC50分別為065， 021， 032和056 μmol·L-1，SI（SI=TC50/IC50）分別為125， 35， 106， 78。化合物1，2，6，7具有較好的抗人肝癌細胞（HepG2）活性，IC50分別為035， 025， 053， 066 μmol·L-1。化合物1～7為從該植物中首次分離得到。

[關鍵詞]水飛薊；木脂素； 抗流感病毒活性； 細胞毒活性

[Abstract]The seeds of Silybum marianum were extracted by hot water， and the extract was isolated by D101 macroporous resin， MCI resin， MPLC， HPLC， et al As a result， 7 compounds including tricin 4′O[threoβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（1）， tricin 4′O[erythroβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（2）， 5′methoxyhydnocarpinD（3），palstatin（4），（8R，7′S，8′R）5，5′dimethoxy7oxolariciresinol 9′ODxylopyranoside（5）， 9ODglucopyranoside（6）， and（-）haplomyrtoside（7） were isolated and identified for the first time Compounds 1， 3， 4， and 5 exhibited activity against influenza A（H5N1）with IC50 value of 065， 021， 032， and 056 μmol·L-1， respectively Compounds 1， 2， 6， and 7 exhibited cytotoxity against HepG2 with IC50 value of 035， 025， 053， 066 μmol·L-1， respectively

[Key words]Silybum marianum； lignan； antiinfluenza virus activity； cytotoxity

doi：10.4268/cjcmm20160915

水飛薊Silybum marianum （L）Gaertn是菊科水飛薊屬植物，性涼、味苦、歸肝、膽經。具有清熱解毒，舒肝利膽之功效。用于治療肝膽濕熱、脅痛、黃疽等證。水飛薊特有成分為黃酮型木脂素類化合物，統稱為水飛薊素（silymarin），主要包括水飛薊賓（silybin）、異水飛薊賓（isosilybin）、水飛薊寧（silydianin）、水飛薊亭（silychristin）、脫氫水飛薊賓（dehydrosisilybin）、聚水飛薊賓（silybinomer）等[1]。除以上成分外，日本學者竹本常松等還獲得2種新的黃酮型木脂素：2，3脫氫水飛薊賓（2，3dehydrosilmarin）和2，3脫氫水飛薊亭（2，3dehydrosilychristin）。本課題組前期研究中分離得到了水飛薊中5個黃酮類化合物[2]，然而沒有得到黃酮型木脂素類化合物。為了繼續尋找具有生物活性的黃酮型木脂素類化合物，課題組繼續對水飛薊進行成分與活性的研究。

1材料

核磁共振譜：INOVA500核磁共振儀， 溶劑峰為內標； 分析型HPLC：Agilent 1100 Series 型高效液相色譜儀， DADUV 檢測器， YMC C18（46 mm×150 mm，5 μm）色譜柱， 以及Diamonsil C18（46 mm×250 mm，5 μm）色譜柱； 制備型HPLC：Shimadazu LC6AD， SPD6A， SPD10A 紫外檢測器， SPD紫外檢測器， YMCPack ODSA（20 mm×250 mm，10 μm）色譜柱； 制備型MPLC：Biotage 公司FLASH，ODS（50 mm×60 mm， 10 μm）色譜柱。

水飛薊藥材于2014年10月采集于黑龍江省佳木斯地區，經黑龍江中醫藥大學佳木斯學院陳效忠副教授鑒定為水飛薊S marianum種子。

2提取與分離

干燥的水飛薊種子10 kg，粉碎后用蒸餾水回流提取3次，每次1 h。提取液減壓濃縮成浸膏（10 kg）。將浸膏混懸于水中，過D101型大孔吸附樹脂柱色譜，乙醇水（0%，30%，50%，95%）洗脫，其中水洗脫部分得浸膏200 g，30%乙醇洗脫部分得浸膏300 g，50%乙醇洗脫部分得浸膏400 g，95%乙醇洗脫部分得浸膏90g。50%乙醇洗脫部分進行MCI柱色譜分離，乙醇水（0%，30%，50%，95%）洗脫，其中水洗脫物50 g，30%乙醇洗脫部分得浸膏150 g，50%乙醇洗脫部分得浸膏150 g，95%乙醇洗脫部分得浸膏40 g 。30%乙醇洗脫部分進行MPLC柱色譜分離，甲醇水（0%～95%）梯度洗脫，薄層色譜檢識，合并相似洗脫流分，得到8個組分（A1～A8）。A3組分經HPLC制備型色譜儀分離（色譜條件為甲醇水 2∶8，流速5 mL·min-1），得到化合物1（10 mg，tR=25 min），2（8 mg，tR=30 min），3（5 mg，tR=33 min）；A5組分經HPLC制備型色譜儀分離（色譜條件為甲醇水 1∶3，流速5 mL·min-1），得到化合物4（10 mg，tR=32 min），5（8 mg tR=33 min），6（5 mg，tR=35 min）；A7組分經HPLC制備型色譜儀分離（色譜條件為甲醇水3∶7，流速5 mL·min-1），得到化合物7（10 mg，tR=37 min）。

3結構鑒定

化合物1白色粉末，鹽酸鎂粉呈陽性反應。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：660（1H，s，H3），615（1H，s，H6），640（1H，s，H8），708（1H，s，H2′），708（1H，s，H6′），385（2H，s，H3′，5′），692（1H，br s，H2″），677（1H，br s，H5″），681（1H，m，H6″），447（1H，d，J=60，H7″），445（1H，m，H8″），392（1H，dd，J=120，44 Hz，H9″a），375（1H，dd，J=120，33 Hz，H9″b），385（3H，s，3″OCH3），386（3H，s，7″OCH3）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1660（C2），1055（C3），1835（C4），1535（C5），1005（C6），1671（C7），953（C8），1595（C9），1057（C10），1278（C1′），1048（C2′），1547（C3′），1405（C4′），1545（C5′），1048（C6′），555（C3″和H5″OCH3 ），1313（C1″），1123（C2″），1489（C3″），1481（C4″），1157（C5″），1223（C6″），839（C7″），869（C8″），618（C9″），559（3″OCH3），558（7″OCH3）。以上波譜數據與文獻[3]報道的化合物一致，故鑒定該化合物為tricin 4′O[threoβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether。

化合物2白色粉末，鹽酸鎂粉呈陽性反應。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：661（1H，s，H3），616（1H，s，H6），642（1H，s，H8），709（1H，s，H2′），709（1H，s，H6′），385（2H，s，H3′，5′），695（1H，br s，H2″），678（1H，br s，H5″），682（1H，m，H6″），490（1H，d， J=45 Hz，H7″），446（1H，m，H8″），395（1H，dd， J=120，44 Hz，H9″a），376（1H，dd， J=120，33 Hz，H9″b），387（3H，s，3″OCH3），388（3H，s，7″OCH3）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1663（C2），1056（C3），1837（C4），1539（C5），1006（C6），1671（C7），955（C8），1597（C9），1059（C10），1272（C1′），1049（C2′），1549（C3′），1407（C4′），1546（C5′），1049（C6′），556（C3″和H5″OCH3 ），1315（C1″），1125（C2″），1491（C3″），1482（C4″），1158（C5″），1206（C6″），748（C7″），869（C8″），619（C9″），556（3″OCH3），557（7″OCH3）。以上以上波譜數據與文獻[3]報道的化合物一致，故鑒定該化合物為tricin 4′O[erythroβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether。

化合物3白色粉末，鹽酸鎂粉呈陽性反應。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：705（1H，d，J=20 Hz，H2″），685（1H，d，J=81 Hz，H5″），689（1H，dd，J=91，20 Hz，H6″），379（3H，s，C3″OMe），395（3H，s，C5″OMe），678（1H，s，H3），620（1H，d，J=21 Hz，H6），655（1H，d，J=23 Hz，H8），363（1H，m，H11a），339（1H，m，H11b），426（1H，m，H12），499（1H，d，J=91 Hz，H13），729（1H，d，J=21 Hz，H2′），735（1H，d，J=21 Hz，H6′）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1643（C2），1039（C3），1818（C4），1234（C5），1258（C6），1629（C7），942（C8），1573（C9），1036（C10），618（C11），786（C12），759（C13），568（COMe），1227（C1′），1082（C2′），442（C3′），1366（C4′），1482（C5′），1029（C6′），1278（C1″），1175（C2″），479（C3″），1476（C4″），1154（C5″），1206（C6″）。以上以上波譜數據與文獻 [4]報道的化合物一致，故鑒定該化合物為5′methoxyhydnocarpin D。

化合物4白色粉末，鹽酸鎂粉呈陽性反應。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：698（1H，s，H3），617（1H，d，J=25 Hz，H6），650（1H，d，J=25 Hz，H8），336（1H，dd，J=110 ，40 Hz，H11a），360（1H，J=d，110 Hz，H11b），425（1H，ddd，J=110，80，10 Hz，H12），493（1H，d，J=80 Hz，H13），730（1H，d，J=35 Hz，H2′），390（3H，s，5′OCH3），675（2H，s，H2″，6″），375（2H，s，H3″，5″）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1630（C2），1045（C3），1819（C4），1616（C5），995（C6），1648（C7），945（C8），1578（C9），1039（C10），600（C11），785（C12），766（C13），1222（C1′），1083（C2′），1445（C3′），1368（C4′），1490（C5′），1029（C6′），556（5′OCH3 ），1263（C1″），1053（C2″，6″），1478（C3″，5″），1361（C4″），560（C3″，5″）。以上以上波譜數據與文獻 [4] 報道的化合物一致，故鑒定該化合物為palstatin。

化合物5白色粉末。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：773（1H，br s，H2），775（1H，br s，H6），485（1H，m，H8），468（1H，dd，J=110，80 Hz，H9a），440（1H，t，J=80 Hz，H9b），385（3H，s，OCH3），728（1H，br s，H2′），728（1H，br s，H6′），539（1H，d，J=85 Hz，H7′），316（1H，m，H8′），448（1H，dd，J=115，30 Hz，H9′a），395（1H，dd，J=115 ，45 Hz，H9′b），382（3H，s，OCH3），478（1H，d，J=82 Hz，H1″），406（1H，t，J=85 Hz，H2″），413（1H，t，J=85 Hz，H3″），406（1H，m，H4″），430（1H，dd，J=110 ，50 Hz，H5″a），368（1H，t，J=110 Hz，H5″b）； 13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：1279（C1），1079（C2），1486（C3），1437（C4），1489（C5），1084（C6），1985（C7），492（C8），706（C9），565（OCH3），1312（C1′），1052（C2′），1495（C3′），1378（C4′），1495（C5′），1053（C6′），845（C7′），535（C8′），765（C9′），566（OCH3），1057（C1″），747（C2″），788（C3″），711（C4″），673（C5″）。以上波譜數據與文獻[5] 報道的化合物一致，故鑒定該化合物為（8R，7′S，8′R）5，5′dimethoxy7oxolariciresinol 9′ODxylopyranoside。

化合物6白色粉末。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：695（1H，d，J=20 Hz，H2），670（1H，d，J=80 Hz，H5），780（1H，dd，J=80 ，20 Hz，H6），555（1H，d，J=65 Hz，H7），356（1H，m，H8），401（1H，m，H9a），382（1H，m，H9b），377（3H，s，OCH3），675（1H，br s，H2′），668（1H，br s，H6′），257（1H，br t，J=80 Hz，H7′），177（1H，m，H8′），352（2H，t，J=65 Hz，H9′），380（3H，s，OCH3），430（1H，d，J=76 Hz，H1″），328（1H，m，H2″），327（1H，m，H3″），323（1H，m，H4″），332（1H，m，H5″），368（1H，t，J=110 Hz，H6″a），358（1H，m，H6″b）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1346（C1），1109（C2），1495（C3），1477（C4），1169（C5），1195（C6），892（C7），533（C8），727（C9），567（OCH3），1368（C1′），1182（C2′），1457（C3′），1478（C4′），1295（C5′），1143（C6′），330（C7′），358（C8′），623（C9′），566（OCH3），1046（C1″），756（C2″），786（C3″），717（C4″），689（C5″），629（C5″）。以上波譜數據與文獻[5] 報道的化合物一致，故鑒定該化合物為9ODglucopyranoside。

化合物7白色粉末。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：552（1H，d，J=35 Hz，Hl″），455（1H，d，J=35 Hz，H2″），395（1H，d，J=100 Hz，H4″α），445（1H，d，J=100 Hz，H4″β），372（1H，d，J=115 Hz，H5″α），375（1H，d，J=115 Hz，H5″β），405（3H，s，OCH3），770（1H，s，H5），705（1H，s，H8），556（1H，d，J=140 Hz，H10），677（1H，d，J=18 Hz，H2′），603（2H，s，3′，4′OCH2O），694（1H，d，J=78 Hz，H5′），674（1H，dd，J=78，18 Hz，H6′）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1365（C1），1300（C2），1195（C3），1464（C4），1276（C4a），1016（C5），1527（C6），1497（C7），1105（C8），1323（C8a），1726（C9），687（C10），1025（OCH2O），1302（C1′），1115（C2′），1488（C3′，C4′），1089（C5′），1246（C6′），563（OCH3），1126（Cl″），788（C2″），803（C3″），759（C4″），643（C5″）。以上以上波譜數據與文獻[6] 報道的化合物基本一致，故鑒定該化合物為（-）haplomyrtoside。

4活性測試

抗流感病毒（A/Hanfang/1/47，H5N1）試驗方法：在5% CO2，37 ℃條件下，將MDCK 細胞接種于96 孔培養板內。24 h后使MDCK細胞感染流感病毒1×10-5，吸附2 h后棄掉病毒液，再加入含有不同稀釋度樣品及陽性對照藥（奧司米韋）的維持液。在5% CO2，37 ℃條件下繼續培養，待病毒對照組病變（CPE）達4+時觀察各組細胞病變（CPE）（約35 h），計算各樣品抗流感病毒半數抑制濃度（IC50）。結果表明化合物1，3，4，5具有較強的抗流感病毒（H5N1）活性，IC50分別為065，021，032，056 μmol·L-1，SI分別為125，35，106，78； 陽性對照藥（奧司米韋）IC50為28 μmol·L-1 ，SI為1 1501。

細胞毒活性試驗方法：用含10%小牛血清的RPMI1640培養基配制成1萬個/mL細胞懸液，將腫瘤細胞置于培養液中。96孔培養板內接種細胞，在37 ℃，5% CO2溫箱內培養24 h。受試樣品設3個濃度（01，1，10 μmol·L-1），每個濃度設置3個平行孔，在37 ℃，5% CO2溫箱內培養4 d。棄去培養液后，每孔加入MTT 溶液（04 g·L-1，RPMI1640 配制）100 μL，37 ℃ 孵育4 h。棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用550型酶標儀在檢測波長540 nm，參考波長405 nm下測定A。結果表明化合物1，2，6，7具有較好的抗人肝癌細胞（HepG2）活性，IC50分別為035，025，053，066 μmol·L-1，陽性對照藥紫杉醇IC50為0012 μmol·L-1。

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[責任編輯丁廣治]