樟樹4捕磷酸胞苷2睠布諄睤渤噢捍技っ富因的克隆及表達分析

荊禮 鄭漢 姚娜 陳美蘭 申業(yè) 黃璐琦

[摘要]4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase，CMK）是植物萜類化合物生物合成途徑甲基赤蘚醇4磷酸途徑（methylerythritol4phosphate pathway，DXP/MEP）上的第4個關鍵酶。該研究根據(jù)樟樹轉錄組數(shù)據(jù)，利用RTPCR（reverse transcriptionPCR）方法從藥用植物樟樹Cinnamomum camphora中克隆得到4二磷酸胞苷2C甲基 D赤蘚醇激酶基因，命名為CcCMK1（GeneBank登錄號 Ku376098），對其序列進行生物信息學分析，結果表明該基因開放閱讀框（ORF）為1 212 bp，編碼403個氨基酸，推測其相對分子質量為4446 kDa，等電點（theoretical pI）為499?？缒そY構分析表明CMK蛋白不存在跨膜結構。信號肽分析表明其為非分泌蛋白，不存在信號肽。亞細胞定位表明其定位于葉綠體中。利用熒光實時PCR檢測了龍腦樟、油樟、芳樟、腦樟和異樟5種化學型樟樹中CcCMK1基因的表達量，結果表明CcCMK1基因在油樟中的表達量最高，龍腦樟中表達量最低，為樟樹萜類化合物生物合成途徑關鍵酶基因元件挖掘提供研究基礎。

[關鍵詞]樟樹；4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶（CMK）；基因克??；生物信息學分析；表達分析

[Abstract]The 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase was the fourth key enzymes in plant terpenoid biosynthesis pathway of methyl erythritol phosphate pathway（MEP） According to the study of Cinnamomum camphora transcriptome data，we abtained the 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase gene using RTPCR，and named CcCMK1，then deposited it in GeneBank（Accession number： Ku376098）Bioinformatics analysis showed the open reading frame （ORF） of the CcCMK1 was 1 212 bpThe putative protein encoded 403 amino acids，and its molecular weight was 4446 kDa and theoretically isoelectric point was 499Transmembrane structure analysis showed that there was no transmembrane structure Signal peptide analysis showed that it was a non secretory protein， and there was no signal peptide The subcellular localization showed that the chloroplast was located in the chloroplastAnalysis of the expression of CcCMK1 gene in five chemotypes of C camphora using Realtime PCR showed its expression level was highest in C longepaniculatum， and the lowest in Borneol camphorThis research provided a basis for characterizing the key enzyme genes of terpenoid biosynthetic pathway in C camphora

[Key words]Cinnamomum camphora； 4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol kinase（CMK）； gene cloning； bioinformation analysis； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20160902

樟樹Cinnamomum camphora （L） Presl不僅是一種常見的藥用植物，還是一種含天然精油的經(jīng)濟植物。樟樹的根、樹皮、葉子和果實均可入藥，可診療感冒頭痛，風濕骨痛，胃腹冷痛等疾病。樟樹的枝、葉可提取樟腦和樟油，在醫(yī)藥及香料工業(yè)具有極高的經(jīng)濟價值。

樟樹中有效藥用成分為揮發(fā)油類物質，如龍腦、樟腦、芳樟醇、水芥烯、欖香烯等，樟樹揮發(fā)油類化學成分以及樟樹化學類型之間化學成分種類和含量的研究已有大量報道[13]。近年，隨著新一代測序技術的廣泛應用，人們從基因組、轉錄組角度對樟樹進行研究。江香梅等以樟樹5種化學型的葉片為材料，進行了轉錄組分析[4]，共注釋55 955條unigene，其中424條unigene參與單貼、二萜、倍半萜和萜類骨架合成。Shi等做了蔗糖誘導的樟樹體細胞胚的比較轉錄組工作，注釋了114 229條unigene，發(fā)現(xiàn)了897個基因可能參與了體細胞胚的發(fā)生[5]。目前，從樟樹中克隆的基因并不多。李永鵬等利用同源克隆方法，從香樟克隆得到actin基因[6]。張力維等同樣利用同源克隆方法，克隆到香樟延伸因子EF1a基因片段[7]。Yang等從細毛樟C. tenuipilum中克隆得到一個香葉醇合成酶基因CtGers，并對其功能進行驗證[8]。

揮發(fā)油類的主要成分大多為萜類化合物，萜類化合物在植物體內通過2條途徑獨立合成，即位于細胞質的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）[9]和位于質體中的脫氧木酮糖5磷酸途徑（1deoxyDxylulose5phosphate pathway，DXP）或甲基赤蘚醇4磷酸途徑（methylerythritol4phosphate pathway，MEP）[10]。CMK，即4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritolkinase），是MEP途徑中的第4個酶促反應所需的酶，是萜類合成的MEP途徑中唯一的一個激酶，它可以4二磷酸胞苷2C甲基赤蘚醇（4diphosphocytidyl2Cmethylerythritol，CDPME）為底物生成4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇2磷酸（4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol2phosphate，CDP_ME2P），經(jīng)一系列反應后生成2條獨立途徑的共同中間體異戊烯基二磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）[11]，IPP在異戊烯基二磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）的作用下部分轉化為雙鍵異構體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），這2種物質均是所有萜類化合物的前體物質。目前，已經(jīng)從藥用植物丹參[12]、杜仲[13]、雷公藤[14]中成功克隆得到CMK基因，但尚未從樟樹中克隆得到萜類化合物生物合成MEP途徑的酶基因。

本研究基于樟樹轉錄組數(shù)據(jù)庫中CMK基因序列，通過 RTPCR 技術成功地從樟葉片中擴增到CcCMK1基因的cDNA，并進行生物信息學分析，同時利用實時熒光定量方法分析芳樟、異樟、油樟、腦樟、龍腦樟5種化學型樟樹中CcCMK1基因的表達量，以期為樟樹主要藥效成分揮發(fā)油類生物合成途徑的解析提供一定參考 。

1材料

11植物

樟樹（龍腦樟、腦樟、芳樟、油樟、異樟）均采集自江西省龍腦樟繁殖基地（歐陽少林教授惠贈），置于中國中醫(yī)科學院中藥研究所溫室中生長。

12儀器

9700實時熒光定量 PCR儀（ABI公司），TF 7500型Real Time PCR System（ABI公司），5810R 型低溫冷凍離心機（Eppendorf 公司），MM400冷凍混合研磨儀（Retsch公司），NanoDrop2000分光光度計（Thermo Scientific），紫外凝膠成像分析儀（Gene 有限公司）。

13試劑

RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；Oligo（dT）18，10 mmol·L-1 dNTP，5×Reaction Buffer，RiboLock RNase Inhibitor，RevertAid Reverse Transcriptase購自賽默飛世爾科技（中國）；DL 2 000 DNA Marker，Ex Taq，SYBR Premix Ex TaqTM購自Takara有限公司；T4 DNA連接酶，pGEMT Easy 載體購自普洛麥格生物技術有限公司。

2方法

21總RNA的提取和cDNA的制備

采用華越洋核酸提取試劑盒，按照說明書提取樟葉片的總RNA，使用NanoDrop2000分光光度計進行RNA濃度和質量檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。采用RTPCR方法，按以下體積進行反轉錄合成CcCMK1的cDNA： RNA 1 μg，Oligo（dT）18 1 μL，加ddH2O至12 μL，65 ℃加熱5 min，產物置于冰上冷卻；待產物冷卻后，加入5×Reaction Buffer 4 μL，10 mmol·L-1 dNTP 2 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL，混勻，42 ℃加熱1 h，70 ℃加熱5 min，產物置于冰上冷卻，即為單鏈cDNA，于-20 ℃保存，用于基因克隆和表達分析。

22CMK1基因cDNA的全長克隆

根據(jù)CcCMK1基因最大開放閱讀框（ORF）設計引物，CMKL：5′CAACATGGCTGCCACCCAATTCC3′；CMKR：5′GACATTACTTAAATGGACAAGCGGTC3′。按以下體積進行PCR：LA Taq 05 μL，10×LA taq BufferⅡ5 μL，25 mmol·L-1 dNTP 4 μL，cDNA 1 μL，Primer L 08 μL，Primer R 08 μL，加ddH2O至50 μL，反應條件為：94 ℃預變性5 min，然后進行30個循環(huán)：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；循環(huán)結束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫，對PCR產物進行1%瓊脂糖電泳檢測；選取在1 200 bp左右產生條帶的PCR產物，按以下體積同pGEMT easy vector連接：T4 DNA連接酶的 2×快速連接緩沖液 5 μL，pGEMT Easy vector 1 μL，PCR產物2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，加ddH2O至10 μL，反應條件為：22 ℃保溫10 min。將連接產物熱激發(fā)轉化至大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選，用M13引物進行菌落PCR后選擇陽性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司北京分公司進行測序。

23CcCMK1的生物信息學分析

利用NCBI 的 ORF Finder 分析該CcCMK1基因的最大開放閱讀框（ORF）；利用InterProScan（http：//wwwebiacuk/interpro/）分析蛋白的理化性質[15]；利用TMHMM Server v20（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）預測跨膜結構[16]；利用SignalP 41 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）進行信號肽分析[15]；利用TargetP11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）進行亞細胞定位；利用SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/）進行結構域的三維建模[15]；利用DNAMAN進行多重序列比對及二級結構分析；利用MEGA 6進行系統(tǒng)進化樹的構建，bootstrap重復1 000次。

24不同化學型樟樹中CMK1基因表達量的分析

采用華越洋核酸提取試劑盒，按照說明書提取不同化學型樟樹葉片的RNA，采用RTPCR方法獲得不同化學型樟的cDNA。采用DNAMAN設計RealTime PCR引物，CMK1realtimeL：5′GAAGTCTTACCGTCTCTGAAACG3′；CMK1realtimeR：5′CACTGGTTCTCTTCCCGAGTGAG3′； actinrealtimeL：5′CCAGCCTTCACTCATTGGAATGG3′； actinrealtimeR：5′CTGTACTTCCTTTCTGGTGGTGC3′。進行RealTime PCR檢測不同化學型樟中CMK1基因的表達量，所用儀器為ABI公司TF 7500型Real Time PCR System，反應體系為：cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL，PrimerL 02 μL，PrimerR 02 μL，ROX（Ⅱ）02 μL ，ddH2O 34 μL ，PCR 反應條件為： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s。每個樣品進行3次生物學重復，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT公式進行分析。

3結果

31 CcCMK1基因cDNA的全長克隆

基于轉錄組數(shù)據(jù)庫中CMK1基因序列，在最大開放閱讀框上下游設計引物，對cDNA進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1，顯示在1 212 bp左右產生明亮、單一的條帶，與轉錄組基因庫中CMK1基因大小一致；將PCR產物同pGEMT Easy載體相連，熱激法轉化至大腸桿菌DH5α中，氨芐抗性篩選陽性克隆，見圖2。在1 400 bp左右產生明亮單一的條帶，選擇陽性菌落，利用pGEMT Easy載體通用引物SP6和T7測序，測序結果在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，顯示該序列為CMK基因家族成員，表明CcCMK1克隆成功。

32CcCMK1的生物信息學分析

321CcCMK1蛋白基因的理化性質利用InterProScan（http：//wwwebiacuk/interpro/）對CcCMK1蛋白的理化性質進行分析，推測其結構式為C4886H8193N1581O2064S324，相對分子質量為4446 kDa，等電點 （theoretical pI）為499，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù) （instability index） 為4283，說明其較為穩(wěn)定，脂肪系數(shù) （aliphatic index） 為2758，親水性系數(shù) （grand average of hydropathicity， GRAVY）為0710。利用TMHMM Server v20（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構，結果表明其位于膜外，不存在跨膜結構。利用SignalP 41 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）進行信號肽分析，結果表明其為非分泌蛋白，不存在信號肽。利用TargetP11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）進行亞細胞定位，結果表明其定位于葉綠體中，與其他MEP途徑上的蛋白定位相一致[1718]。

322CcCMK1蛋白多重序列比對及系統(tǒng)進化樹的構建選取與CcCMK1蛋白親緣關系較近的4條蛋白序列，利用DNAMAN進行多重序列比對，結果見圖3。CcCMK1蛋白與其他物種的CMK蛋白同源性為7775%，并含有GHMP激酶家族的高度保守氨基酸序列：PXXXGL（G/S）SS（A/G）XX1225（K/R）（圖3中黑線所示），此家族還包括半乳糖激酶、高絲氨酸激酶、甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶[19]。

323CcCMK1蛋白的二級結構及三級結構預測CcCMK1基因最大開放閱讀框含有1 212 bp，預測編碼403個氨基酸。利用DNAMAN分析該蛋白的二級結構，該蛋白的二級結構中α螺旋占67%、β折疊占33%、無規(guī)則卷曲占 159%。蛋白的功能與其結構密切相關，利用SWISSMODEL進行結構域的三維建模，以大腸桿菌4二磷酸胞苷 2C甲基 D赤蘚醇激酶三斜晶型（2ww41）為模板，其序列相似性為033，覆蓋率為066，覆蓋范圍為93～388位氨基酸，結果見圖3。InterProScan搜索蛋白質結構域，結果顯示其具有IspE（CMK）功能結構域，并屬于GHMP激酶家族，與之前多重序列比對結果相一致。IspE來源于結核分枝桿菌，是MEP途徑上的一種酶，是這種致病細菌生存所必需的酶。它可以在ATP存在的情況下，催化4diphosphocytidyl2Cmethylderythritol （CDPME）生成4diphosphocytidyl2CmethylDerythritol 2phosphate （CDPME2P） [20]。

33不同化學型樟樹中CcCMK1基因表達模式分析

在同一時間，采集在相同條件下生長的不同化學型樟樹的葉片，稱取100 mg，采用華越洋核酸提取試劑盒，按照說明書步驟提取芳樟、異樟、油樟、腦樟及龍腦樟葉片的RNA，使用NanoDrop2000分光光度計檢測RNA含量，采用RTPCR方法使用1 μg RNA獲得不同化學型樟的cDNA，將cDNA稀釋20倍，-20 ℃保存待用。利用DNAMAN設計樟樹CcCMK1和actin基因的實時熒光定量引物，進行實時熒光定量檢測，結果見圖6。CcCMK1基因在油樟中表達量最高，在龍腦樟中表達量最低。

4討論

樟樹C. camphora是樟科Lauraceae樟屬Cinnamomum植物，是我國傳統(tǒng)的藥用植物，具有悠久的藥用歷史，其主要藥用成分為萜類物質揮發(fā)油，有祛風散寒、理氣活氣、止痛止癢、強心鎮(zhèn)痙和殺蟲等功效。樟屬植物具有明顯的種內化學變異的現(xiàn)象，即由于化學成分的差異分化出不同化學型，樟樹劃分為芳樟（主成分芳樟醇）、腦樟（主成分樟腦）、油樟（主成分桉油素）、龍腦樟（主成分龍腦）和異樟（主成分異橙花叔醇）等化學型[21]。劉星星等對不同化學型樟樹葉揮發(fā)性成分組成進行多變量分析，靜態(tài)頂空氣相色譜質譜聯(lián)用法（SHSGCMS）的測定結果表明， 從25個樣品中共鑒定出171種化合物[1]，其中，β芳樟醇、莰烯、β愈創(chuàng)木烯、γ松油烯、α側柏烯、2乙基呋喃、α石竹烯和大牛兒烯8種化合物在所有樣品中均可檢測到。5種化學型樟樹葉揮發(fā)性成分種類及其含量存在較大差異。對12種成分進行主成分分析表明，β愈創(chuàng)木烯、2乙基呋喃、α石竹烯、大牛兒烯、δ蓽澄茄烯、己醛和可巴烯7種揮發(fā)性成分是5種化學型樟樹分類的重要判定變量。

隨著功能基因組技術的發(fā)展和完善，人們迫切從基因組學角度揭示導致樟屬種內的化學型差異的分子生物學機制等問題，利用Illumina測序技術對樟樹5種化學類型葉片轉錄組進行測序、組裝共獲得156 278個unigene，序列平均長度584 bp，共有3580%的unigene獲得了基因注釋， 其中1019%的基因注釋到次生代謝生物合成途徑，參與單萜、二萜、倍半萜和萜類骨架的合成 [5]。目前為止，已經(jīng)從樟樹中克隆得到6個基因的全長，其中只有1個基因屬于單萜合酶家族成員，即Yang Tao等從細毛樟中克隆得到1個香葉醇合酶基因CtGerS[8]。4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶CMK是萜類物質共同合成途徑之一質體MEP途徑中的第四步催化反應的酶，也是MEP途徑中唯一的激酶，有關CMK基因相關報道較少。在大腸桿菌中克隆了1個CMK家族成員IspE，編碼1個約31 kDa大小、含有233個氨基酸的多肽，其屬于保守的GHMP激酶家族[22]。重組IspE在大腸桿菌中具有4二磷酸胞苷2C甲基赤蘚醇激酶活性，在ATP存在的情況下，催化4二磷酸胞苷2C甲基赤蘚醇生成4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇2磷酸[22]。

本文首次克隆得到樟樹中4二磷酸胞苷2C甲基D赤蘚醇激酶CMK基因（CcCMK1）的cDNA，并進行了全面的生物信息學分析，CcCMK1是CMK家族基因并具有IspE功能結構域，與其他物種的CMK基因有高度同源性。對不同化學型樟樹中CMK1基因的表達量進行了分析，結果顯示油樟中CcCMK1基因的表達量最高，江香梅等對單萜合成的代謝通路中9條可能編碼芳樟醇合成酶unigene的表達分析結果顯示，芳樟醇合成酶基因在芳樟化學類型中表達水平高， 而在油樟化學類型中表達水平較低[7]。由此可見，樟樹不同化學型中萜類物質生物合成途徑不同階段的酶含量可能不同，需要更深入的研究才能揭示其本質差別。本研究中CcCMK1基因的克隆和表達分析僅為藥用植物樟樹萜類物質合成途徑解析提供了基本基因元件。

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