冠心病氣虛血瘀證大鼠模型的建立

黃爍 任建勛 王少辰 楊斌 董小霞 許晴 王瓊 劉建勛

[摘要]應用疲勞跑步運動復合左冠狀動脈前降支高位結扎的方法建立冠心病氣虛血瘀證病證結合大鼠模型。該實驗選用Wistar雄性大鼠，隨機分為假手術組（JSS）、單純結扎冠脈組（DZ）、疲勞跑步運動復合結扎冠脈組（PZ）。DZ組進行單純冠脈結扎；PZ組利用小動物跑臺進行為期2周的跑步運動造成疲勞模型，在此基礎上進行冠脈結扎，術后以1次/2 d的頻率維持28 d的力竭跑步；于術后28～31 d觀察大鼠宏觀體征，分別采集大鼠超聲心動檢測指標、呼吸幅度對大鼠冠心病氣虛血瘀證的主癥進行評價；采集空場實驗相關指標、力竭運動時間、足底圖像色彩飽和度對兼癥進行評價；采集舌面色彩飽和度對舌象進行評價；采集脈搏搏動幅度對脈象進行評價。同時對血液流變學、凝血功能等指標進行檢測。結果顯示，術后第28天開始，PZ組大鼠主癥、兼癥、舌象、脈象均符合冠心病氣虛血瘀證證候表現，結合相關病理性檢測結果證明以疲勞跑步運動復合左冠狀動脈前降支高位結扎的方法在大鼠體內可以成功建立冠心病氣虛血瘀證病證結合模型。

[關鍵詞]冠心病；病證結合；氣虛血瘀證；大鼠；動物模型

[Abstract]To establish Qideficiency and bloodstasis syndrome type coronary heart disease models by fatigue running exercise and high ligation of left anterior descending coronary artery （LAD）， male Wistar rats were selected and randomly divided into sham operation group （JSS）， coronary ligation group （DZ）， fatigue running exercise+coronary ligation group （PZ） Coronary ligation alone was done in DZ group； while the rats in PZ group had running exercise in on the animal treadmill system for 2 weeks to establish fatigue models， and then coronary ligation was done based on the models The exhausted running was maintained for 28 days at the frequency of 1 time/2 days after operation Twentyeight to thirtyone days after the operation， all the rats were observed for macroscopic physical signs， and ultrasonic echocardiography indexes and breathing extent of the rats were collected to evaluate the main symptoms of rats with Qideficiency and bloodstasis syndrome type coronary heart disease； related indexes of open field test， exhaustive running time， and colorimetric analysis data on images of plantar were collected to evaluate the accompanied symptoms； colorimetric analysis data on lingual surface was collected to evaluate the tongue characteristics； pulse distension data was collected to evaluate the pulse condition， and meanwhile， blood rheology and coagulation function were also detected From the 28th day postoperatively， the main symptoms， accompanied symptoms， tongue characteristics and pulse conditions of rats in PZ group conformed to the symptoms of coronary heart disease and Qideficiency and bloodstasis syndrome Combined with related pathological results， the study revealed that Qideficiency and bloodstasis syndrome type coronary heart disease models could be successfully established by fatigue running exercise and high ligation of left anterior descending coronary artery for the rats

[Key words]coronary heart disease； diseasesyndrome combination； Qideficiency and bloodstasis； rat； animal model

doi：10.4268/cjcmm20160921

血管疾病是目前導致人類死亡與殘疾的三大主要疾病之首，嚴重危害人類健康。世界衛生組織（WHO）最近的報告中指出，2000—2020年心肌梗死的死亡率將由第5位上升到第1位，因心血管病引發的死亡占全球死亡人數的30%，該病嚴重影響著廣大患者的健康。Pillai H S等[1]調查顯示，冠心病、高血壓和慢性腎衰是南亞心力衰竭的主要三大病因，據統計大約65%的心力衰竭由冠狀動脈疾病引發。葛永彬等[2]對7 512例冠心病中醫證型分布規律的分析中得出冠心病中醫證型中本虛標實屬常見證型，其中氣虛血瘀比例最高。建立規范化的疾病動物模型是研究疾病發生、發展進程，研究病因和尋求有效治療方案的有效途徑。病證結合動物模型融合了現代醫學病理學動物模型和中醫證候動物模型兩者共同的特點和因素， 使模型動物同時具有西醫疾病和中醫證候的特征，是闡明中醫基礎理論、辨證論治關系、全面客觀反映中藥藥效作用較為理想的載體[3]。

本文依據中醫對冠心病氣虛血瘀證的病機認識，在既往實驗研究的基礎之上，嘗試選擇疲勞運動結合高位結扎左冠狀動脈前降支雙因素復合刺激的方法建立大鼠冠心病氣虛血瘀證病證結合動物模型，使其更加符合中醫氣虛血瘀證候的病機特點。

1材料

健康雄性Wistar大鼠40只，SPF級，體重（200±10）g，購置于北京維通利華動物中心有限公司，許可編號SCXK（京）20130012。

動物專用心電圖機（日本Softron）；高分辨率小動物超聲影像系統Vevo 2100（加拿大VisualSonics公司），探頭型號MS250；MouseOx小動物無創脈搏血氧儀（美國Starr Life Sciences Inc公司）；Nikon D90單反相機；臺灣TES1330A數位式照度計；空場計算機圖像實時監測分析系統（中國航天員訓練中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研制開發）；ZHPT動物實驗跑臺（安徽正華生物儀器設備有限公司）；LBYN6C血液流變測定儀（北京普利生）；COALAB1000血凝儀（德國藍波）；美國MatrxVIP3000小動物麻醉機凝血酶時間（TT），活化部分凝血活酶時間（APTT），凝血酶原時間（PT），纖維蛋白原（FIB）測定試劑盒（上海太陽生物技術有限公司）；異氟烷（100 mL/瓶，魯南貝特制藥有限公司，批號H20020267）；注射用青霉素鈉（400萬 U/支，華北制藥股份有限公司，批號H13020656）；鹽酸利多卡因注射液（5 mL，01 g/支，中國大冢制藥有限公司，批號H20065378）。

2方法

21分組

實驗大鼠飼養于中國中醫科學院西苑醫院SPF級動物房，飼養條件：溫度（25±2） ℃，濕度（40±5）%，大鼠隨意飲食飲水。大鼠適應性喂養2 d后，進行3 d的適應性跑臺訓練，每天1次，每次15～30 min。當大鼠能夠以20 m·min-1的速度持續跑30 min，開始進行模型的建立。淘汰不能完成上述運動的大鼠[4]。將大鼠隨機分為3組：假手術組（JSS組，10只）、單純高位結扎左冠狀動脈前降支組（DZ組，15只）、疲勞運動復合高位結扎左冠狀動脈前降支組（PZ組，15只）。

22冠心病氣虛血瘀證造模方法

假手術組（JSS）方法：手術方法同DZ組，但穿線不結扎。

單純高位結扎左冠狀動脈前降支組（DZ）方法：具體方法在參照文獻[5]的基礎上進行改進，大鼠用小動物麻醉機維持麻醉狀態（氧氣壓強01 MPa，氧氣流量300 mL·min-1，麻醉藥物濃度2%）。用止血鉗撐開大鼠左側第3，4肋間隙，輕微按壓胸廓擠出心臟，用0號手術線結扎左冠脈前降支根部，結扎后心臟表面立刻給予利多卡因注射液2～3滴，立即將心臟放回胸腔，排出進入胸腔空氣，縫合皮膚。關胸后立刻注射青霉素01～02 mL。

疲勞跑步運動復合高位結扎左冠狀動脈前降支組（PZ）方法：大鼠在跑臺水平狀態中進行每天1次為期2周中等強度的跑步運動[67]，造模實驗方案見表1。在造成疲勞模型后對大鼠進行左冠狀動脈前降支高位結扎。術后恢復4 d，開始讓大鼠進行力竭運動（速度20 m·min-1，頻率：1次/2 d）。

黃爍等：冠心病氣虛血瘀證大鼠模型的建立表1大鼠疲勞運動訓練方案

Table 1Training program for exerciseinduced fatigue in the rat modelsm·min-1×min

周次第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第1周15×1515×1518×2018×2018×2518×2520×25第2周25×2525×2525×3025×3030×3030×3030×30

23指標采集方法

231心電圖采集術后第3天上午8：00，大鼠用2%異氟烷維持麻醉狀態，背位固定，用日本Softron動物專用心電圖機采集心電圖。檢測異常Q波是否出現，對大鼠成模情況進行評價。

232大鼠舌面、足底（統一右側后肢足底）圖像采集參照文獻方法[8]，術后第28天上午8：00—10：00，在動物房利用色溫5500K柔光箱進行布光，根據國際照明委員會CIE推薦的標準照明和觀測條件，采用45/0（照明/觀察）的照明幾何條件安排光路。光源照度測量采用臺灣泰仕TES1330A 照度計，舌面處照度范圍控制在1 500～2 000 lx。圖片采集應用尼康D90數碼單鏡反光相機，聯合尼康AFS 微距尼克爾60 mm f/28G ED鏡頭，相機用三腳架固定，鏡頭與舌面、足底距離15 cm。應用灰卡手動設定白平衡，圖像采集時選用相機手動（M）檔，自動對焦，以光圈F8，快門1/80 s，ISO 400 的條件采集舌面圖像。拍照時保證比色卡與舌面、足底在同一平面，舌面足底照片以JPG格式輸出。圖像采集后利用Adobe Photoshop CS5軟件選取舌面、足底區域3點，讀取像素區域R（紅色）、G（綠色）及B（藍色）分量值。

233超聲心動檢測方法術后第29天，利用異氟烷維持大鼠麻醉狀態后[維持大鼠心率在（350±20） bpm]，對大鼠胸部左側鎖骨至肋骨下緣進行備皮處理。在左室長軸及胸骨旁短軸各切面進行二維掃查，選用左室短軸切面M超測量計算左室收縮末內徑（LVIDs），左室舒張末內徑（LVIDd），左室收縮末容積（LVs Vol），左室舒張末容積（LVd Vol），射血分數（EF），短軸縮短率（FS），各項指標均連續測量3個周期，取平均值。

234大鼠呼吸幅度、脈搏幅度檢測術后第29天，利用2%異氟烷維持大鼠麻醉狀態后，利用Mouse Ox小動物無創脈搏血氧儀對大鼠呼吸幅度、脈搏幅度進行檢測。記錄每只動物連續10個有效數據，取平均值。

235大鼠空場實驗相關指標檢測術后第30天進行，空場實驗室保持安靜，室內暗光，實驗人員位置以操作角度無法觀測到箱中實驗動物為準。空場測試箱直徑80 cm，高50 cm，內壁與底部涂黑。實驗前，將動物在測定房間中適應10 min。實驗開始時捏住大鼠尾巴距根部1/2處放入測試箱底部中心，顯示器中觀察動物10 min內活動情況，每次測定結束后將動物排泄物清理干凈，并用75%乙醇擦拭箱底驅散氣味。實驗結束后利用軟件進行錄像分析。描繪動物運動軌跡，測量動物運動距離、平均速度、運動時間。

236大鼠力竭運動時間測定術后第30天將大鼠放進小動物實驗跑臺（跑臺速度25 m·min-1，電擊強度15 mA）進行力竭跑步測試。以大鼠3 s內被連續電擊5次仍無法跑步為標準判斷是否力竭。記錄時間。

237大鼠血液流變學、凝血功能檢測各組大鼠在術后第31天，禁食24 h后腹腔注射35%水合氯醛（10 mL·kg-1）麻醉，腹主動脈取血3 mL，加入肝素化抗凝試管中，立刻進行血液流變學測定。腹主動脈取血3 mL，38%檸檬酸鈉抗凝，常溫1 800×g離心10 min，進行凝血酶時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、纖維蛋白原（FIB）含量檢測，操作步驟按照說明書進行。

238大鼠心肌MASSON染色心臟切片脫蠟至水，經過天青石藍、Mayer氏蘇木素、麗春紅苦味酸、1%淡綠等染色后，再脫水，樹膠封固。顯微鏡下觀察，膠原纖維染為藍色，胞核染為藍黑色，肌纖維染為紅色。

239大鼠心肌HE染色大鼠心肌組織放于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片（5 μm），蘇木精伊紅染色，光學顯微鏡下觀察心肌結構。

24統計學方法

統計軟件采用SPSS 200進行統計。實驗獲得的各數據以±s表示。若數據符合正態分布方差齊用LSD檢驗反之用Tamhane′s T2檢驗。P<005表示差異有統計學意義。

3結果

31大鼠術后3 d心電圖檢測及術后28 d一般狀態

術后第3天單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠心電圖中出現異常Q波，假手術組大鼠心電圖正常；術后28 d單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠精神萎靡，被毛枯黃失去光澤，活動度降低，喜歡聚攏在一起，嗜睡，對外界刺激反應遲鈍，稀便；假手術組大鼠狀態正常。疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，體重下降，存在統計學差異（P<005）；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，體重有所下降，但不存在統計學差異；單純高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，體重有所下降，但不存在統計學差異，見表2。

32大鼠足底、舌面圖片分析

術后28 d觀察單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠鼻尖、口唇、掌心、舌面與假手術組大鼠比較，均發生不同程度的變紫變暗，見表3。本研究著重記錄大鼠右側后肢足底及舌面的R，G，B值，單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，足底R，G，B值均顯著降低（P<001）；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，足底R，G值有所降低，但不存在統計學差異。單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，舌面R，G，B值均顯著降低（P<001）；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，足底G，B值有所降低，但不存在統計學差異。

33大鼠超聲心動圖檢測

術后第29天，單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，EF，FS顯著下降（P<001），LVIDd，LVIDs，LVd，LVs顯著上升（P<001）；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，EF，FS顯著下降（P<001），LVIDs和LVs顯著上升（P<005），LV d上升但不存在統計學差異，見表4。

34大鼠呼吸幅度、脈搏幅度檢測

術后第29天單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，呼吸幅度、脈搏幅度顯著下降（P<001）；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，呼吸幅度、脈搏幅度顯著下降（P<001），見表5。

35大鼠空場實驗相關指標、力竭運動時間檢測結果

術后第30天，單純高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，運動距離、爬壁次數、力竭運動時間顯著下降（P<005，P<001），平均速度、運動時間下降但不存在統計學差異；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，運動距離、平均速度、運動時間、爬壁次數、力竭運動時間顯著下降（P<005，P<001）；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，運動距離、平均速度、運動時間、爬壁次數、力竭運動時間下降，但不存在統計學差異，見表6。

36大鼠血液流變學檢測

術后第31天，單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，在低切變率、高切變率下的全血黏度顯著升高（P<001），中切變率下的全血黏度升高，但不存在統計學差異；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較，低切變率、中切變率、高切變率下的全血黏度升高，但不存在統計學差異，見表7。

37大鼠凝血功能檢測

術后第31天，單純高位結扎組、疲勞運動復合高位結扎組大鼠與假手術組大鼠比較，PT，APTT，FIB降低，TT升高，但不存在統計學差異；疲勞運動復合高位結扎組大鼠與單純高位結扎組大鼠比較PT，FIB降低，APTT，TT升高，但不存在統計學差異，見表8。

38大鼠心肌Masson染色

假手術組大鼠心肌染色以紅色的心肌細胞為主，心肌組織分布均勻，結構清晰，細胞排列整齊，

4討論

本實驗室在建立各類動物模型的探索過程當中，逐步形成了“病證結合動物模型擬臨床”這一概念。原則上首先在實驗動物的選擇上應盡量選擇與人類接近或相似的動物[8]，在冠心病氣虛血瘀證動物模型的建立當中，因為心血管系統與人類頗為相似所以小型豬是最為適合的實驗動物，但由于實驗動物價格較為昂貴，并且在實際應用過程中推廣起來有一定難度，所以本研究選用大鼠作為實驗動物。其次選用無創或微創的手段獲取有價值的實驗數據[8]。本研究在造模的手術方法中，選取了創傷最小（皮膚切口15 cm），手術過程時間最短（約30 s）的方法，盡量減小對原有胸腔穩定環境的破壞。最后動物模型的建立方法應最大可能符合疾病實際的發展過程[8]，由于大鼠具有抵抗動脈粥樣硬化形成的能力，在大鼠身上模擬冠脈粥樣硬化又有一定難度，所以目前大鼠冠心病心衰模型的建立方法主要有注射異丙腎上腺素[9]、腦垂體后葉素[9]、麥角新堿[10]、冠脈結扎[11]等方法。針對大鼠氣虛血瘀證候模型的建立方法主要有游泳+饑餓+高脂飲食[12]、老年+阿霉素+外傷[13]、饑餓+心得安+高分子右旋糖酐[14]、甲硝基亞硝基胍+雷尼替丁+饑飽失常的綜合法[15]、饑餓+疲勞+寒涼[16]、力竭游泳+皮下注射腎上腺素[17]、饑餓+高脂飲食+寒濕或+驚恐[18] 。目前冠心病氣虛血瘀病證結合動物模型的建立過程中最為突出表現的問題是建立模型的干預因素無法有機結合與臨床實際發病原因相脫節。本研究遵循中醫病因病機“血瘀多由日久氣虛所致，血瘀進一步阻滯氣機致虛”，先通過呈階梯遞增強度的跑步運動使大鼠處于疲勞狀態，模擬人體生理上呈現出的疲勞狀態，正氣消耗開始出現氣虛證的表現；在此基礎上結扎大鼠冠狀動脈前降支，模擬人體心肌梗死的發生，日久氣虛導致心脈瘀阻；術后維持一定強度的跑步運動，繼續模擬人類正氣的消耗，由心肌梗死導致心力衰竭過程的發生，伴隨氣虛血瘀證候的出現。

本研究在模型評價體系的建立當中，參照臨床冠心病致心力衰竭氣虛血瘀證侯診斷標準：胸痛胸悶，心悸氣短，身倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，脈弱而澀。同時考慮到實驗動物本身特點，制定大鼠冠心病氣虛血瘀中醫證候診斷標準如下。主癥（胸痛胸悶、心悸氣短）：用反映心臟功能的超聲心動圖指標診斷是否胸痛胸悶；用呼吸幅度診斷是否心悸氣短。兼癥（身倦乏力、面色紫暗）：用反映大鼠運動能力的空場實驗指標、力竭運動時間診斷是否身倦乏力；由于大鼠面部圖像采集以及分析存在一定困難，而大鼠足底圖像方便采集且色澤變化較為明顯所以用足底圖像色彩飽和度來診斷是否面色紫暗。舌象（舌淡紫）：用舌面色彩飽和度變化來診斷是否舌色淡紫。脈象（脈弱而澀）：用反映大鼠脈搏搏動強度的指標來診斷是否脈弱而澀。同時結合相關病理指標，能夠對冠心病氣虛血瘀證大鼠模型進行一個較為完整的疾病以及證候診斷。

利用西醫病因病理造模方法單純高位結扎左冠狀動脈前降支建立的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型雖然在證候上表現出了心氣虛證與血瘀證的相關特點，比如心功能下降，運動能力變差，掌心色彩飽和度下降等，但這種模型的建立方法均與特異的病理變化有所關聯，只能夠反映臨床病理表現的一個方面，缺少臨床病因學基礎，與中醫相關理論體系缺乏聯系，很難完整體現出中醫證候的特征，出現的病理狀態并不能夠與特定的中醫證候對等。相比較之下，本研究利用疲勞跑步運動結合高位結扎左冠狀動脈前降支雙因素復合刺激的方法建立的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型則更具有優勢，模型在冠心病氣虛血瘀中醫證候的表現上更加顯著。

在動物模型的評價體系中，雖然有些指標的變化并沒有出現統計學差異，比如代表凝血功能的PT，APTT，TT，FIB等，但并不代表這些指標的變化不存在任何生理學意義，PT，APTT的縮短說明血液處于高凝狀態，FIB的減低常見與彌散性血管內凝血消耗性低凝溶解期，TT的增高常見于彌散性血管內凝血纖溶亢進期。臨床診斷中不能輕易忽視這些指標的變化[19]，那么在動物模型的評價當中更加應該留意一些“不存在統計學差異”的指標變化所包含的生理學意義。

但是本研究利用疲勞運動結合高位結扎左冠狀動脈前降支雙因素復合刺激的方法建立的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型與人類臨床上冠心病致心力衰竭氣虛血瘀證實際的發展演變過程仍然存在一定的差距，研究者在日后研究過程當中，應當借助多學科交叉合作，建立更加穩定更加可靠規范化的病證結合動物模型，同時對模型的評價體系進行不斷地完善。

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[責任編輯馬超一]