基于網絡藥理學方法探討通塞脈片治療動脈粥樣硬化的作用機制

李娜 張新莊 王儼如 曹亮 丁崗 王振中 蕭偉 徐筱杰

[摘要]該研究利用網絡藥理學方法探索通塞脈片治療動脈粥樣硬化的藥效物質和分子作用機制。經分子對接、分子靶蛋白網絡分析發現，通塞脈片中有97個分子可與動脈粥樣硬化相關靶蛋白產生較好的相互作用（對接得分大于等于7），其中37個分子可作用于2個以上靶點，且具有較高的介數，推測這37個分子可能是通塞脈片治療動脈粥樣硬化的主要活性成分群。同時，所預測活性成分中含有較多的黃酮類和皂苷類化合物，提示該2類成分應在藥效物質基礎和質量標準研究中重點關注。靶點網絡特征分析顯示，通塞脈片主要活性成分可通過與Toll 樣受體（TLR1，TLR2）、基質金屬蛋白酶（MMP1，MMP2，MMP3，MMP9）、血管緊張素轉化酶（ACE）、白三烯A4 水解酶（LTA4H）、5脂氧酶（5LOX）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα，PPARγ）等22個主要靶蛋白作用，起到調節炎癥、增加斑塊穩定性、保護內皮細胞、參與血脂調節及抗凝等作用，從而參與對動脈粥樣硬化病理過程不同環節的調控，最終實現對動脈粥樣硬化的治療。該研究揭示了通塞脈片治療動脈粥樣硬化的主要藥效物質及其可能的分子作用機制，印證了通塞脈片多成分、多靶點、整體調節的作用特點，為后續系統進行通塞脈片藥效物質基礎和作用機制實驗研究提供了理論依據。

[關鍵詞]中藥；通塞脈片；網絡藥理學；分子對接；動脈粥樣硬化

[Abstract]Network pharmacology method was adopted in this study to explore the active compounds and mechanism of Tongsaimai tablets for atherosclerosis In molecular docking and moleculartarget protein network analysis， 97 molecules in Tongsaimai tablets showed good interaction with the atherosclerosisrelated target protein （docking score≥7）， and 37 molecules of them could act on more than 2 targets （≥2） with higher betweenness， suggesting that these 37 molecules might be the main active compounds group in Tongsaimai tablets for atherosclerosis treatment Furthermore， the predicted active compounds contained more flavonoids and saponins， reminding more attention should be paid on flavonoids and saponins in study of effective compounds and quality standards of Tongsaimai tablets Targets network analysis showed that， the active compounds of Tongsaimai tablets could regulate inflammation， stabilize plaque， protect vascular endothelial cell， regulate blood lipid and inhibit blood coagulation through acting on the main 22 target proteins， such as Tolllike receptors （TLR1， TLR2）， matrix metalloproteinase （MMP1， MMP2， MMP3， MMP9）， angiotensin converting enzyme （ACE）， leukotriene A4 hydrolase （LTA4H）， 5lipoxidase （5LOX）， peroxisome proliferatorsactivated receptors （PPARα， PPARγ） These active compounds can participate in regulating different pathologic stages of atherosclerosis and thus treat atherosclerosis finally This study revealed the main active compounds and possible mechanism of Tongsaimai tablets for treatment of atherosclerosis and meanwhile， verified the characteristics of multicomponents， multitargets and integral regulation for Tongsaimai tablets， providing theoretical references for the following systematic laboratory experiments on effective compounds and action mechanism of Tongsaimai Tablet

[Key words]traditional Chinese medicine； Tongsaimai tablet； network pharmacology； molecular docking； atherosclerosis

doi：10.4268/cjcmm20160922

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種可由高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、吸煙等多種危險因素誘發的慢性疾病[12]， 其特征性病理過程包括脂質代謝紊亂、血管內皮細胞受損及炎性細胞浸潤、斑塊破裂和血栓形成等，是導致多種心腦血管疾病發生的重要病理基礎[3]。動脈粥樣硬化性心血管疾病的發病率呈逐年上升趨勢，盡管在預防和治療方面取得了較好的進展，但其仍是世界范圍內導致死亡的主要原因[45]。因而，對動脈粥樣硬化的治療一直是醫藥學界研究的重點。通塞脈片是在古方四妙勇安湯（《驗方新編》）基礎上研制而成的中成藥，由黃芪、黨參、當歸、金銀花、玄參、石斛、牛膝、甘草8味中藥組成，具有活血祛瘀、益氣養陰、通調脈絡之功效，臨床上對動脈粥樣硬化、腦梗死等顯示了較好的治療作用[69]。藥理學研究亦表明，通塞脈片可通過抗炎、清除自由基、保護內皮細胞等對大鼠實驗性動脈粥樣硬化起到改善或治療作用[1013]。化學成分研究顯示，通塞脈片各組方藥材的研究較為深入，但全方尚未見有系統研究的報道。質量標準研究表明阿魏酸（ferulic acid）、甘草酸（glycyrrhizic acid）、綠原酸（chlorogenic acid）、齊墩果酸（oleanolic acid）、黃芪甲苷（astragoloside IV）、哈巴苷（harpagide）及哈巴俄苷（harpagoside）等可作為通塞脈片的質控成分[1416]。通塞脈片抗動脈粥樣硬化的作用機制目前也有一些探索[11，1719]，但缺乏系統性。中藥復方研究的復雜性使得系統研究并揭示通塞脈片藥效物質基礎和分子作用機制存在一定困難。

網絡藥理學提供了一種從系統水平研究中藥復方潛在活性成分和作用靶點的新策略，特別適宜于反映及闡釋中藥多成分多靶點的作用關系，與中藥能從整體水平調控機體，發揮治療作用的觀點相吻合，網絡藥理學研究理念已被引入中藥領域，并得到認可和應用[2023]。為此，本研究嘗試采用網絡藥理學方法分析通塞脈片治療動脈粥樣硬化的藥效物質基礎和可能的分子作用機制，以期為深入開展通塞脈片基礎實驗研究及臨床合理應用提供理論依據。

1材料與方法

11分子對接文獻分析顯示，動脈粥樣硬化是一種慢性血管疾病，血管內皮細胞損傷、脂質沉積為其始動因素。炎癥、巨噬細胞浸潤、胞外基質水解、氧化應激、細胞凋亡等相互交織參與其形成過程，并逐漸演變為不穩定斑塊。最終以不穩定斑塊為基礎形成血栓，導致嚴重的心腦血管臨床事件，如心絞痛、心肌梗塞、猝死及中風等[1，2426]。基于此，筆者經文獻調研初步獲得了195個靶蛋白[1，2741]，并經RCSB數據庫進一步篩選，最終選取了30個含有原配體的靶蛋白晶體復合物（表1）。同時，依據通塞脈片的處方組成，從江蘇康緣藥業股份有限公司創建的中醫藥網絡藥理學智能信息平臺（traditional Chinese medicine network pharmacology intelligent information platform，TCMN）數據庫[42]中檢索得到755個小分子化合物結構。在確定以上靶點和成分信息的基礎上，根據靶點的uniprot和化合物的TCMC編號獲得成分與靶點的分子對接得分。分子對接的具體參數如下：在以AutoDock 40為內核的DOVIS 20平臺上進行分子對接，以原配體為活性中心，盒子大小為40 ×40 ×40 ，格點間隔為0375 ，分子構象搜索采用拉馬克遺傳算法（LGA），初始種群數為150，平移步長為02 nm，旋轉步長為50°，突變率為002，交叉率為08，局部搜索頻率為006，其余為默認值。

12網絡構建根據分子對接結果，在得分高于原配體的基礎上，選取對接得分大于等于7的分子靶蛋白數據對導入Cytoscape 321構建分子靶蛋白網絡，并通過network analyzer插件分析網絡特征，預測通塞脈片的可能活性成分和潛在靶蛋白。

2結果

21分子對接在分子計算中，分子與靶蛋白的相互作用情況可用對接得分來評估，得分越高則兩者相互作用的可能性越大。通塞脈片的分子對接結果顯示，有97個分子與靶蛋白的對接得分大于等于7，其中部分化合物抗動脈粥樣硬化的作用已有文獻報道。例如，格桑曲珍等研究顯示甘草酸（glycyrrhizinic acid，TCMC0156B）能有效抑制載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的發展，對脂質代謝及動脈粥樣硬化斑塊具有調節和降低作用[43]；張明發等從抗高血脂、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等方面綜述表明了甘草酸、甘草次酸（glycyrrhetinic acid，TCMC053CB[44]以及熊果酸（ursonic acid，TCMC01013）、齊墩果酸（oleanolic acid，TCMC00BED）等的抗動脈粥樣硬化作用[45]。據此推測，這97個分子可能是通塞脈片治療動脈粥樣硬化的活性成分。

22網絡分析分子對接結果表明，97個分子并非均單純靶向單一蛋白，而是部分分子可同時作用多個蛋白或多個分子可作用一個蛋白，進而在活性分子與靶蛋白之間構成一個復雜的關系網絡。網絡節點度（degree）和介數（betweenness， BW）是網絡分析中的2個重要參數，常用于刻畫網絡節點的重要程度[46]。因此，為了進一步分析這個復雜關系網絡中活性分子以及靶蛋白的差異性，本研究針對由97個分子與30個靶蛋白的相互關系所構建的“分子靶蛋白網絡”（圖1）進行了網絡特征分析，發現有37個分子可作用于2個以上的靶點（網絡節點度≥2），且具有較高的介數（表2），提示這些分子的變化會對通塞脈片抗動脈粥樣硬化的分子靶蛋白網絡穩定性和完整性產生較大影響，從而改變其抗動脈粥樣硬化的療效，推測這37個分子可能是通塞脈片的主要活性成分群。另一方面，對蛋白節點網絡特征分析，發現有22個靶蛋白分別可與2個以上（網絡節點度≥2）的分子發生作用（表3），推測這22個靶蛋白可能與通塞脈片治療AS的作用機制密切相關。

3討論

本文利用網絡藥理學方法探討通塞脈片抗動脈粥樣硬化的藥效物質基礎和分子作用機制，經分子對接、分子靶蛋白網絡分析發現，loniflavone等97個分子可能是通塞脈片治療動脈粥樣硬化的活性成分，其中37個分子可作用于2個以上的靶點，且具有較高的介數，推測可能是通塞脈片治療動脈粥樣硬化的主要活性成分群（表2）。

進一步分析發現，通塞脈片的預測活性成分中含有較多的黃酮類和皂苷類化合物。文獻研究顯示，在通塞脈片的組成藥材中，黃芪總黃酮、懷牛膝總皂苷、甘草總黃酮等均對動物實驗性動脈粥樣硬化有較好的防治作用[4749]。另外，皂苷類化合物如甘草酸、甘草次酸、熊果酸、齊墩果酸等亦顯示有抗動脈粥樣硬化作用[4345]，與預測一致，提示黃酮類和皂苷類成分可能是通塞脈片治療動脈粥樣硬化的重要成分群，在后續藥效物質基礎和質量標準研究中可重點加以關注和控制。

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，Toll 樣受體（TLRs）與炎癥密切相關，研究發現TLR1，TLR2在人和鼠動脈粥樣硬化病變的內皮細胞和巨噬細胞中均有表達[50]；TLR1，TLR2的阻斷或缺失可降低動脈粥樣硬化的發生率[39]。靶點網絡特征分析顯示（表3），loniflavone 等21個化合物與TLR2有較好的作用；oleanolic acid等18個化合物與TLR1有較好的作用，提示調節炎癥反應可能是通塞脈片防治動脈粥樣硬化的主要途徑之一。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一族可消化細胞外基質的重要蛋白酶類，MMPs含量和活性的升高，可致細胞外基質迅速降解、纖維帽變薄，繼而致使斑塊易于破裂而引發臨床事件，其中MMP1，MMP2，MMP3，MMP9等已證實與纖維帽形成、斑塊穩定性等密切相關[5153]。通塞脈片中有29個化合物可與MMP1，MMP2，MMP3，MMP9產生較好的作用，且每個MMP亞型均有4個以上化合物與之作用，提示穩定斑塊可能是通塞脈片治療動脈粥樣硬化，預防進一步心腦血管事件發生的又一重要途徑。血管緊張素轉化酶（ACE）可將血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）轉換為血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），后者具有促動脈粥樣硬化斑塊形成作用；血管緊張素轉化酶2（ACE2）為ACE同系物，可水解AngⅡ生成Ang（17）；Ang（17）具有舒張血管、保護內皮細胞等作用，可抑制動脈粥樣硬化病變[28]。通塞脈片中有9個化合物可對ACE產生較好的作用，有4個化合物可對ACE2產生較好的作用，表明通塞脈片即可通過抑制ACE，降低其對動脈粥樣硬化的促進作用，又可增強ACE2活性，加強其對動脈粥樣硬化病變的改善作用。此外，通塞脈片中還有39個化合物可與其他如FLAP，CETP，5LOX，PPARα，PPARγ，PGES等13個與脂質代謝、炎癥等密切相關的靶點發生較好的作用。已有藥理研究結果顯示，通塞脈片可通過降低AngⅡ水平，降低NO含量及NOS活力，抑制MMP2，MMP9的表達，改善動脈粥樣硬化病變[10，1719]，與部分預測結果相吻合。

通塞脈片呈現出多成分、多靶點、整體調節的作用特點，其主要活性成分群可通過調節炎癥（如TLR1，TLR2，5LOX，FLAP，LTA4H，TNFα，PPARα，PPARγ），增加斑塊穩定性（如MMP1，MMP2，MMP3，MMP9，MMP13），保護內皮細胞（如ACE2，eNOS），參與血脂調節、脂代謝（如CETP，PPARα，PPARγ）及抗凝（如FX）等作用參與對動脈粥樣硬化病理過程不同環節的調控，進而影響動脈粥樣硬化的形成與發展。這從分子水平上揭示了通塞脈片治療動脈粥樣硬化的藥效作用機制，本研究為后續系統開展通塞脈片治療動脈粥樣硬化的藥效物質基礎和分子作用機制的實驗研究提供了理論依據。

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[責任編輯馬超一]