基于Walker 256惡性胸水模型的中藥甘遂量毒效關(guān)系研究

沈娟 唐于平 徐遠(yuǎn)超 開鈞 宿樹蘭 錢大瑋 張麗 段金廒

[摘要]該文考察中藥甘遂的量毒效關(guān)系，探討甘遂的毒效變化特點(diǎn)，為臨床安全合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。以惡性胸水模型為研究對(duì)象，在較大劑量范圍內(nèi)（甘遂0045～1620 g·kg-1·d-1）考察甘遂對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生化指標(biāo)、胸水量等的影響，并通過因子分析方法綜合評(píng)價(jià)甘遂的量毒效關(guān)系。結(jié)果顯示，模型組大鼠具有較多的胸水量，且與空白組比較，ALT，AST，LDH，HBDH，IFNγ，IL2，TNFα顯著升高（P<005），TP，ALB降低（P<005）。給藥后，與模型組比較，各組可不同程度的減少胸水量，降低IFNγ，IL2，TNFα，升高TP，ALB，體現(xiàn)出一定的治療作用，同時(shí)引起ALT，AST，LDH，HBDH升高，體現(xiàn)出一定的肝、心臟毒性。通過因子分析從9個(gè)指標(biāo)中抽提出2個(gè)公因子，共解釋了891%的信息。結(jié)果表明，甘遂在《中國(guó)藥典》劑量范圍內(nèi)單獨(dú)給藥沒有見到明顯毒性，在藥典高限3倍劑量下可產(chǎn)生肝臟、心臟毒性，隨著劑量增加，毒性增強(qiáng)；同時(shí)甘遂具有“峻下逐水”功效，可減少惡性胸水模型大鼠的胸水量及改善相關(guān)生理指標(biāo)，且具有劑量依賴性。綜合分析其毒效特點(diǎn)，甘遂藥典高限劑量為其相對(duì)最佳治療劑量。

[關(guān)鍵詞]甘遂；量毒效關(guān)系；因子分析；惡性胸水

[Abstract]To investigate the dosagetoxicityefficacy relationship of Kansui Radix， explore its regularity of the toxicity and efficacy change， and provide scientific basis for its clinical rational application， the malignant pleural effusion models were used to observe the effect of Kansui Radix with larger dose range （00451620 g·kg·d-1 for Kansui Radix） on biochemical indexes and hydrothorax volume in experimental animals Factor analysis method was also used to comprehensively assess the dosagetoxicityefficacy relationship of Kansui Radix The results showed that the rats in model group had larger hydrothorax volume， and ALT， AST， LDH， HBDH， IFNγ， IL2 and TNFα levels were significantly increased （P<005）， while TP and ALB levels were decreased （P<005） as compared with the blank group After drug administration， various treatment groups decreased hydrothorax volume， IFNγ， IL2， TNFα and increased TP and ALB levels as compared with model group， indicating certain therapeutic effect； and increased ALT， AST， LDH and HBDH levels， indicating certain liver and cardiac toxicity In the factor analysis， two common factors were extracted from nine indexes， explaining 891% of the information The analysis results suggested that there was no obvious toxicity in case of independent use of Kansui Radix within the dosage range set in pharmacopeia， while it would produce liver toxicity and cardiac toxicity upon 3 times of the dosage set in pharmacopeia， and the toxicity was increased with the increase of dose At the same time， Kansui Radix can decrease the hydrothorax volume in malignant pleural effusion models and improve relevant physical indexes in a dosedependent manner Comprehensive analysis results of its toxic effect characteristics indicated that the upperlimit dose of Kansui Radix in pharmacopeia shall be regarded as the relatively optimal therapeutic dose

[Key words]Kansui Radix； dosagetoxicityefficacy relationship； factor analysis； malignant pleural effusion

doi：10.4268/cjcmm20160923

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，經(jīng)過幾千年的臨床實(shí)踐檢驗(yàn)，為中華民族的繁榮昌盛做出了巨大貢獻(xiàn)[12]。療效是中醫(yī)藥得以存續(xù)以及發(fā)展的根本，提高其療效則是目前振興中醫(yī)藥事業(yè)的首要之策。中醫(yī)自古認(rèn)為“中醫(yī)不傳之秘在于量”，這說(shuō)明劑量是保證中藥臨床安全有效的重要因素，也說(shuō)明了中藥量毒效關(guān)系的復(fù)雜性[34]。

甘遂為大戟科植物甘遂Euphorbia kansui TN Liou ex TP Wang的干燥塊根，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，歷代本草皆有收載，具有泄水逐飲、消腫散結(jié)的功效[5]。甘遂功效顯著、作用迅猛，被稱為“泄水圣藥”；同時(shí)又具有毒效并存的特點(diǎn)，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為下品。李慧玉等[6]研究發(fā)現(xiàn)甘遂對(duì)水負(fù)荷小鼠具有較好的利尿作用，但對(duì)腎臟產(chǎn)生一定的毒性。甘遂經(jīng)醋炙后，可降低其腎臟毒性，同時(shí)利尿作用增強(qiáng)[7]。姜瑋等[8]研究表明，甘遂對(duì)斑馬魚具有明顯毒性作用，并具有一定的量毒關(guān)系。筆者在前期研究中[9]亦發(fā)現(xiàn)甘遂對(duì)小鼠具有一定的肝、腎毒性。甘遂雖藥效顯著，但因其存在毒性，故在臨床上的應(yīng)用受到很大限制。基于此，科學(xué)闡釋甘遂的量毒效關(guān)系，對(duì)于其臨床的安全合理應(yīng)用顯得尤為重要。

中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論對(duì)藥物的藥效和毒性具有獨(dú)到的認(rèn)識(shí)，“是藥三分毒”，對(duì)于藥物的藥效與毒性應(yīng)辯證對(duì)待。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“有故無(wú)殞”之說(shuō)，及現(xiàn)代認(rèn)為的“有病則病當(dāng)之，無(wú)病則體受之”思想，皆是強(qiáng)調(diào)了中藥的毒性與療效并存，并且隨著機(jī)體疾病狀態(tài)的不同而發(fā)生改變[1011]。因此，本文建立Walker 256惡性胸水模型，在較大劑量范圍（甘遂0065～2340 g·kg-1·d-1）考察甘遂“峻下逐水”效應(yīng)及對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生化指標(biāo)等的影響，并通過因子分析方法綜合分析甘遂的量毒效關(guān)系，為甘遂的安全合理應(yīng)用提供參考。

1材料

11藥物甘遂產(chǎn)自陜西寶雞紅河谷地區(qū)（批號(hào)111206），由南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定，為大戟科植物甘遂E kansui的干燥塊根。甘遂打粉過100目篩，用前加超純水配成所需藥液濃度。呋塞米購(gòu)自上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào)1206F04。

12動(dòng)物Wistar大鼠，72只，雄性，SPF級(jí)，體重220～250 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）20120001。自由進(jìn)食及飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度（22±2）℃，濕度60%～80%，人工光照約12 h明暗周期，并定期消毒。

13瘤株與試劑Walker 256細(xì)胞株購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），總蛋白（TP），白蛋白（ALB），肌酐（CREA），堿性磷酸酶（ALP），尿氮素（BUN），總膽紅素（TBIL），血糖（GLU），甘油三酯（TG），肌酸磷酸激酶（CK），總膽固醇（TCHO）測(cè)定試劑盒，AU生化專用清洗液，生化多項(xiàng)校準(zhǔn)品，生化多項(xiàng)質(zhì)控品1，生化多項(xiàng)質(zhì)控品2均購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司；大鼠γ干擾素（IFNγ）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，大鼠白細(xì)胞介素2（IL2）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，大鼠腫瘤壞死因子α（TNFα）酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

14儀器AU680全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司）；EPED超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）。

2方法

21造模方法Walker 256細(xì)胞株每周傳代1次，7 d后抽取小量腹水，置于消毒的干試管內(nèi)，鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。以生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/mL。用臺(tái)酚藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活性，提示活細(xì)胞數(shù)>95%時(shí)，再抽取腹水放入無(wú)菌容器內(nèi)，置冰塊上保存，以上法稀釋調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL。大鼠麻醉后，將大鼠右側(cè)背部用刮刀脫毛，局部常規(guī)消毒，用穿刺針自大鼠右側(cè)腋后線與11，12肋間交點(diǎn)處垂直刺入，當(dāng)針頭刺入胸膜腔時(shí)感覺有落空感后向胸腔內(nèi)注入03 mL上述腫瘤細(xì)胞懸液。正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。

22分組與給藥大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組（呋塞米4 mg·kg-1）、不同劑量甘遂給藥組，共9組，每組8只。根據(jù)甘遂藥典用量（甘遂05 ～ 15 g，換算成大鼠等效量為甘遂0045～0135 g·kg-1），共設(shè)置6個(gè)給藥劑量，分別為0045 g·kg-1（藥典低限劑量，以下簡(jiǎn)稱低限劑量）、0135 g·kg-1（藥典高限劑量，以下簡(jiǎn)稱高限劑量）、0405 g·kg-1（藥典高限3倍劑量，以下簡(jiǎn)稱3倍劑量）、081 g·kg-1（藥典高限6倍劑量，以下簡(jiǎn)稱6倍劑量）、1215 g·kg-1（藥典高限9倍劑量，以下簡(jiǎn)稱9倍劑量）和1620 g·kg-1（藥典高限12倍劑量，以下簡(jiǎn)稱12倍劑量）組。以上各組自造模后第2天灌胃給藥1次/d，給藥劑量按體重計(jì)001 mL·g-1，給藥7 d。

23生化指標(biāo)測(cè)定在給藥第7天末，每組大鼠眼眶靜脈叢取血，離心后取血清，按說(shuō)明書要求測(cè)定ALT，AST，TP，ALB，CREA，ALP，BUN，TBIL，GLU，TG，CK，TCHO，IFNγ，IL2，TNFα水平。

24胸水量測(cè)定在給藥第7天末，每組大鼠頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，稱重，小心剖開胸腔，用注射器抽取胸水并用吸水紙吸干胸水后再次稱重，2次稱重差即為胸水量。

25統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析以及因子分析，均采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件處理，顯著性概率水平α=005。

3結(jié)果

31一般情況觀察正常組大鼠精神狀態(tài)良好，行動(dòng)靈活，毛發(fā)光澤，二便正常。模型組及給藥組大鼠精神萎靡，被毛臟亂、紅染，嘴唇青紫，肛周污穢。各組大鼠每2 d稱重1次，結(jié)果見表1。模型組及給藥組大鼠體重在造模后前3 d體重有增長(zhǎng)趨勢(shì)，且比空白組增長(zhǎng)快，可能因胸水生成，導(dǎo)致體重增加。造模后期，體重開始減少，主要由于后期大鼠進(jìn)食減少而造成。與空白組比較，給藥7 d，模型組、陽(yáng)性組及低限劑量組體重顯著降低（P<005），隨著甘遂給藥劑量的增加，體重有恢復(fù)趨勢(shì)，與空白組逐漸接近，并具有一定的劑量依賴性。

沈娟等：基于Walker 256惡性胸水模型的中藥甘遂量毒效關(guān)系研究表1不同劑量甘遂對(duì)體重的影響（±s，n=8）

。

32對(duì)大鼠胸水量的影響不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的胸水量見表2。與模型組比較，各給藥組均可不同程度的減少胸水量（P<005），且具有一定的劑量依賴性。其中，藥典高限劑量可明顯降低大鼠胸水量，隨著劑量增加，胸水量減少。各組胸水量由多到少依次為：模型組>低限劑量組>陽(yáng)性組>高限劑量組>3倍劑量組>6倍劑量組>9倍劑量組>12倍劑量組。

33對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的生化指標(biāo)結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組ALT，AST，LDH，HBDH，IFNγ，IL2，TNFα顯著升高（P<005），TP，ALB降低（P<005）。給藥后，與模型組比較，各組可不同程度的引起ALT，AST，LDH，HBDH升高，體現(xiàn)出一定的肝、心臟毒性，引起IFNγ，IL2，TNFα降低，TP，ALB升高，體現(xiàn)出一定的治療作用。其中，甘遂劑量大于或等于藥典高限劑量時(shí)，與模型組比較，可顯著升高IFNγ，TNFα值（P<005）；甘遂劑量大于或等于藥典高限表2不同劑量甘遂對(duì)胸水量及生化指標(biāo)影響

34基于因子分析的甘遂量毒效關(guān)系研究采用因子分析法提取給藥后變化明顯的9個(gè)指標(biāo)的公因子，見表3。首先進(jìn)行預(yù)計(jì)算及適用性檢驗(yàn)，KMO統(tǒng)計(jì)量=0745>07，可以接受，Bartlett′s Test χ2=135896，單側(cè)P=0000<001，表明適宜做因子分析。根據(jù)因子分析原則，以特征值大于1為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，有2個(gè)公因子特征值>1，提取這2個(gè)公因子，對(duì)總方差的累積貢獻(xiàn)率為891%，即構(gòu)成的模型可解釋原始數(shù)據(jù)的891%的信息，故采用這2個(gè)公因子代替原始變量對(duì)甘遂量毒效關(guān)系進(jìn)行分析。根據(jù)預(yù)計(jì)算結(jié)果，在因子分析中，自定義提取2個(gè)公因子，采用方差最大正交旋轉(zhuǎn)，得到各因子得分系數(shù)及載荷系數(shù)，見表3。變量載荷絕對(duì)值越大對(duì)公因子的影響越大，從表3可以看出，公因子1（F1）主要由TP，ALB，IFNγ，IL2，TNFα主導(dǎo)，這些指標(biāo)主要反映甘遂“峻下逐水”功效及對(duì)惡性胸水的治療效應(yīng)；公因子2（F2）主要由ALT，AST，LDH，HBDH主導(dǎo)，這些指標(biāo)主要反映肝臟、心臟毒性。因此F1可以解釋為效應(yīng)公因子；F2可以解釋為毒性公因子。其中，F(xiàn)1的貢獻(xiàn)率為47750%，F(xiàn)2的貢獻(xiàn)率為41352%，兩者貢獻(xiàn)率接近，即甘遂在治療惡性胸水時(shí)既具有一定的治療作用也存在毒性，臨床用藥需謹(jǐn)慎權(quán)衡毒效作用。根據(jù)因子載荷圖可以很直觀地看出甘遂的量毒效關(guān)系的演變趨勢(shì)，見圖1，圖中標(biāo)記點(diǎn)為各組數(shù)據(jù)的均值。模型組在橫軸方向和縱軸方向都遠(yuǎn)離正常組。給予不同劑量甘遂后，隨著給藥劑量增加，在縱軸方向與模型組偏離越來(lái)越遠(yuǎn)，并向著空白組靠近，表明甘遂具有一定的治療作用；同時(shí)，在橫軸方向，隨著給藥劑量增加，各組向著遠(yuǎn)離空白組和模型組方向偏離越遠(yuǎn)，表明毒性也增加；兩者均具有一定的劑量依賴性。綜合考慮甘遂的毒性和治療效應(yīng)，選擇藥典高限劑量給藥最佳，此時(shí)不僅具有較好的治療作用，且沒有表現(xiàn)出明顯的毒性作用。

4討論

甘遂作為我國(guó)傳統(tǒng)的有毒中藥，具有峻下逐水作用，逐水能力很強(qiáng)，被后世醫(yī)家譽(yù)為“泄水之圣藥”；又具有毒效并存，難以控制的特點(diǎn)。《本草衍義》謂其：“此藥專于行水功決為用，入藥需斟酌”[12]。甘遂因其在用藥劑量上難以把握，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，充分理解并闡釋甘遂的毒效變化特點(diǎn)對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥意義重大。本文建立了Walker 256惡性胸水模型，在較大劑量范圍考察了甘遂劑量與毒性和效應(yīng)的關(guān)系，從給藥后對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)、大鼠胸水量等的影響并結(jié)合因子分析方法研究了不同劑量甘遂的毒效變化特點(diǎn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，甘遂在藥典規(guī)定的劑量范圍內(nèi)單用沒有明顯毒性；超過藥典規(guī)定劑量，甘遂單用對(duì)肝、心臟有不同程度的損害，可引起相關(guān)生化指標(biāo)異常；同時(shí)，甘遂對(duì)惡性胸水具有一定的治療作用，可明顯減少胸水量，改善相關(guān)血清生化指標(biāo)，同時(shí)引起TP，ALB值升高，表明其“峻下逐水”作用引起血液濃縮。由因子分析中，各組與空白組、模型組偏離程度，可發(fā)現(xiàn)隨著甘遂劑量的增加，其“峻下逐水”效應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)肝臟、心臟毒性也增加。綜合考慮毒性與效應(yīng)，甘遂藥典高限劑量為最佳治療劑量，既具有較好的治療作用，又沒有明顯的毒性。

隨著社會(huì)的發(fā)展，科技的進(jìn)步，中藥正在逐步走向國(guó)際化。然而，近年來(lái)中醫(yī)藥屢遭質(zhì)疑與詬病，關(guān)鍵是中醫(yī)藥的療效與安全性問題。而把握恰當(dāng)?shù)挠盟巹┝浚粌H能保證臨床用藥安全有效，而且也體現(xiàn)出了中醫(yī)治病的精髓。現(xiàn)行《中國(guó)藥典》中記載的中藥用量主要是基于傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)，缺乏現(xiàn)代科學(xué)的闡釋與支撐。因此，明確中藥用藥劑量，研究其量毒效關(guān)系，對(duì)于保證中藥尤其是有毒中藥臨床用藥的安全有效具有重要意義。

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[責(zé)任編輯馬超一]