抗腫瘤化合物E7在不同種屬肝微粒體酶中的體外代謝研究

湯明海 王海蓉 王春艷 葉昊宇

[摘要]采用商品化的人、Beagle犬、食蟹猴、SD大鼠的肝微粒體酶，考察E7在4個種屬肝微粒體中的代謝穩定性，比較代謝的種屬差異。采用選擇性化學抑制劑，測定不同抑制劑對E7代謝速率的影響，分析預測大鼠肝微粒中參與E7代謝的主要亞酶。實驗結果顯示E7在人、犬、食蟹猴和大鼠4個種屬的肝微粒體中體外代謝半衰期T1/2分別為5775，6930，1690，3013 min；體外固有清除率分別為0004 8，0004 0，0016 4，0009 2 mL·min-1·mg-1。推測E7在人和犬肝微粒體中代謝速率相近，均比較慢；在猴和大鼠肝微粒體中代謝速率相近，均比較快；代謝速率存在明顯的種屬差異。CYP2E1，CYP2A6， CYP1A2和CYP2D6均可能參與代謝E7，而多態性的CYP3A4對其的代謝貢獻較小。

[關鍵詞]E7；肝微粒體；代謝穩定性；酶表型

[Abstract]To investigate the metabolic stability of E7 in liver microsomes of human， Beagle dog， Cynomolgus monkey and SD rats， and compare the metabolic differences between different species Selective chemical inhibitors were used to determine the effects of different inhibitors on E7 metabolic rate， and predict the main enzymes involved in E7 metabolism in rat liver microsomes The experimental results showed that the in vitro halflives （T1/2） of E7 in liver microsomes of human， dog， monkey and rats were 5775， 6930， 1690，3013 min respectively Their intrinsic clearance rate was 0004 8， 0004 0， 0016 4 and 0009 2 mL·min-1·mg-1 respectively Hence， it could be speculated that the metabolic rate of E7 was similarly slow in human and dog liver microsomes； while it was similarly fast in monkey and rat liver microsomes There was significant difference in metabolic rate of E7 between different species The results showed that CYP2E1， CYP2A6， CYP1A2 and CYP2D6 might participate in metabolism of E7， while the contribution of polymorphic CYP3A4 was small

[Key words]E7； liver microsomes； metabolic stability； metabolic phenotype

doi：10.4268/cjcmm20160927

E7是本實驗室基于抗腫瘤化合物MPC6827開發的香豆素類化合物，結構見圖1，企圖在一定程度上保留其抗腫瘤活性的同時，又降低其細胞毒性作用[12]。香豆素類化合物是一類具有苯并α吡喃酮母核的天然產物的總稱，是自然界中重要的一類芳香族化合物，廣泛分布于動植物中[34]，具有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質疏松、鎮痛、平喘及抗菌等多種生物活性，且呈濃度效應關系[1，5]，其中抗腫瘤作用是一個研究熱點[1]；植物中提取的天然產物大多毒副作用較低，香豆素類化合物具有相對分子質量小、合成相對簡單、溶解度好、生物利用度高等[2]優點。在此基礎上，以構效關系為指導，合成目標化合物E7。

實驗室前期藥理學體外細胞篩選結果表明，該化合物對不同腫瘤細胞B16，A549等均呈現良好的抗腫瘤效果，有進一步開發的可能性。體外代謝方法具有試驗簡便、周期短等特點，被廣泛應用于早期階段的藥物研發。類似于體內實驗存在的種屬差異，體外代謝實驗中不同CYP同工酶能介導不同的代謝反應，因而CYP酶介導的代謝反應和生成的代謝產物種類或量也存在著種屬差異[67]。為了全面了解E7在不同種屬肝微粒體中的代謝特性，給后續藥物開發的體內實驗動物選用提供支持，選擇了容易獲得的嚙齒類動物和跟人更接近的大動物[8]的肝微粒體來進行E7體外代謝研究，內容包括①探究E7在不同種屬肝微粒中的代謝穩定性；②采用選擇性化學抑制劑方法預測E7的代謝表型。

1材料

超高效液相色譜（UPLC）系統：包括溶劑系統（Waters Quaternary Solvent Manager）、進樣系統（Waters Sample Manager FTN）、 色譜柱（Waters Acquity UPLCTM BEH C18色譜柱，21 mm×100 mm，17 μm）；數據處理軟件（Waters MassLynx V41 Software），購自美國Waters公司；三重四極桿質譜（MS）：Waters xevo TQD，美國Waters公司；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機（Thermo Scientific 公司）；230VUK渦旋混合器（Labnet International公司）；BT125D電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Milli Q超純水系統（美國 Merck Millipore公司）。

E7是四川大學生物治療國家重點實驗室以香豆素為基礎合成的抗腫瘤藥物小分子，經UV，1H和13CNMR，HRMS分析鑒定其結構，通過RPHPLC測定，其純度大于98%；內標1201A由四川大學生物治療國家重點實驗室合成，經UV，1H，13CNMR，HRMS分析鑒定其結構，純度大于98%；α萘黃酮（ANF，東京化成工業株式會社）；鹽酸噻氯匹定（TCP，中國食品藥品檢定研究院）；奎尼丁（QND，TCI上海化成工業發展有限公司）；二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC）、磺胺苯吡唑（SUL）購于美國Sigma；酮康唑（KCZ，Dr Ehrenstorfer公司）；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。人肝微粒體（HLM）、SD大鼠肝微粒體（RLM）、Beagle犬肝微粒體（DLM）、猴肝微粒體（MoLM）：20 g·L-1，購自武漢普萊特生物醫藥技術有限公司，于-80 ℃冷凍保存；NADPH發生系統（A液、B液）購自武漢普萊特生物醫藥技術有限公司，于-80 ℃冷凍保存。

2方法

21儲備液和工作液的配制

E7儲備液的配制：精密稱定E7 1000 mg，使用甲醇作為溶劑定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質量濃度為1 g·L-1的E7貯備液，密封，4 ℃冰箱保存備用。工作時，使用甲醇稀釋貯備液制成不同梯度濃度的工作液。

內標溶液的配制：精密稱定1201A 1000 mg，使用甲醇作為溶劑定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質量濃度為1 g·L-1的1201A貯備液，密封，4 ℃冰箱保存。工作時，精密量取貯備液，用甲醇稀釋為30 μg·L-1的溶液，密封，4 ℃冰箱保存待用。

22UPLCMS/MS條件

液相條件：Waters Acquity UPLCTM BEH C18色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm）；柱溫 30 ℃；流動相為01%甲酸水（A）甲醇（B），梯度洗脫，0～25 min，60%～90%B；進樣體積5 μL。

質譜條件：電噴霧離子化（ESI）方式，檢測離子為正離子；毛細管電壓3 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，脫溶劑氣流量700 L·h-1，錐孔氣流量45 L·h-1。以上條件下，采用多級反應監測（MRM）測定E7和內標，其對應的監測離子對和碰撞能量分別是E7（29810→26812， 30 eV），內標（28716→13814，25 eV）。

23E7在肝微粒體體外代謝孵育模型中的代謝穩定性

231代謝穩定性孵育模型參照文獻[9]每個孵育體系總體積為2095 μL，體系包括01 mol的PBS緩沖液（pH 74）188 μL，NADPH發生系統12 μL。其中NADPH發生系統由10 μL的Solution A和2 μL的Solution B臨用時冰浴上混合制得。冰浴上將2 μL 100 μmol的E7加入孵育體系中，在37 ℃水浴中預熱5 min；然后冰浴上分別加入75 μL不同種屬的肝微粒體酶，輕輕混勻，置于37 ℃水浴中孵育， 孵育時間為0，5，10，20，30 min。待反應完畢后加入400 μL內標質量濃度為30 μg·L-1的甲醇溶液（4 ℃）終止反應， 平行實驗3次，考察E7化合物在不同酶源中的代謝穩定性。

232體外半衰期將孵育0 min E7的濃度作為100%，其他孵育時間點的濃度轉換為百分剩余量，將各時間點的百分剩余量的自然對數對孵育時間作線性回歸，求算得斜率k，根據公式，T1/2 =-0693/k可以計算得到體外半衰期。肝微粒體中的清除率（CL， mL·min-1·mg-1）=0693×孵育液（mL）/[T1/2（min）×肝微粒體（mg）][6]。

24E7在CYP450酶中的代謝表型研究

代謝表型指特定代謝酶對目標化合物代謝相對貢獻的測算，以確定參與藥物代謝的主要酶，為預測個體差異和藥物間相互作用提供依據。

241代謝表型研究體系根據文獻[10]，本實驗選用的選擇性化學抑制劑如下：1 μmol α萘黃酮（αnaphthoflavone，CYP1A2）；50 μmol鹽酸噻氯匹定（ticlopidine，CYP2C19）；10 μmol奎尼丁（quinidine，CYP2D6）；100 μmol二乙基二硫代氨基甲酸鈉（clomethiazole，CYP2E1）；1 μmol酮康唑（ketoconazole，CYP3A4）；20 μmol磺胺苯吡唑（sulphaphenazole，CYP2C9）。首先根據231項下溫孵系統選擇代謝表型反應時間、酶蛋白濃度及底物濃度。

設定E7的孵育濃度為1 μmol，孵育時間為30 min，大鼠肝微粒酶的質量濃度為075 g·L-1。以231項下孵育體系，冰浴上加1 μL濃度為200 μmol的E7溶液，1 μL各選擇性化學抑制劑，在37 ℃水浴中預熱5 min，然后冰浴上加入75 μL的肝微粒體酶，輕輕混勻。37 ℃水浴中孵育30 min，反應完畢后加入400 μL內標質量濃度為30 μg·L-1的甲醇溶液（4 ℃）終止反應，每個樣品平行3次。

另設定未發生反應樣品為陰性對照組（不加NADPH發生系統和抑制劑，只加入等量甲醇）；設定完全發生反應為陽性對照組（加入NADPH發生系統，但不加抑制劑，只加入等量甲醇）。采用UPLCMS/MS檢測E7原形剩余含量，考察不同選擇性抑制劑對E7代謝的影響。

242數據處理用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率；抑制率=1-加入抑制劑樣品代謝速率/陽性對照樣品代謝速率×100%=1-（陰性對照組濃度-實驗組濃度）/（陰性對照組濃度-陽性對照組濃度）×100%。

用計算機程序Excel for Windows （微軟公司）和SPSS statistics 170軟件數據處理系統進行數據處理和制圖。

湯明海等：抗腫瘤化合物E7在不同種屬肝微粒體酶中的體外代謝研究25方法學考察[11]

251專屬性取PBS緩沖液188 μL，加入75 μL高溫滅活的肝微粒體，10 μL的A液和2 μL的B液，記作“孵育體系I”。取“孵育體系I”，加入400 μL甲醇溶液后，按23項下后續的樣品處理方法處理進樣，即得空白對照樣品A。另取“孵育體系I”，然后加入400 μL含內標的甲醇溶液（質量濃度為30 μg·L-1），加入2 μL質量濃度為10 mg·L-1的E7溶液，按23項下后續的樣品處理方法處理進樣，得對照樣品B（E7終濃度為100 μg·L-1）。

252線性關系E7對照品工作液配制：精密量取E7對照品貯備液，用甲醇一次稀釋得質量濃度分別為25，5，10，20，40，80，125 mg·L-1的系列對照品工作液。于“孵育體系I”中分別加入2 μL上述系列濃度的對照品工作液渦旋混勻，按23項下方法處理，制得E7理論質量濃度分別為25，50，100，200，400，800，1 250 μg·L-1的系列對照品溶液，按22項下條件進樣分析。分別以待測物E7的濃度為橫坐標，以樣品與內標物的峰面積比值為縱坐標，采用加權最小二乘法進行回歸計算，求得直線回歸方程，即為樣品的工作曲線。

253準確度按照252項下方法，制得質量濃度為50，200，1 000 μg·L-1的低、中、高質控樣品進行準確度實驗，同法處理后進樣分析，計算各濃度質控樣品的回收率；每組樣品均平行操作5份。

254精密度精密度與準確度采用同樣的低、中、高濃度質控樣品，用質控樣品的日內和日間RSD表示。日內每隔2 h處理一組低、中、高濃度樣品，共處理5組，計算日內精密度。日間精密度連續3 d測定3個分析批次，每個濃度測定5個樣品來計算日間精密度。

255基質效應按照252項下方法，制得質量濃度為50，200，1 000 μg·L-1的低、中、高質控樣品，每組樣品平行5份；將測定所得的峰面積A與相同濃度的質控對照品溶液直接進樣測定所得到的峰面積B進行比較，即可考查基質效應。基質效應可表示為A/B×100%，基質抑制率=（1-A/B）×100%，此值應小于15%。

3結果

31方法學驗證

E7和內標的保留時間分別為190，098 min，達到基線分離，且沒有受到空白基質的干擾，說明其專屬性良好。分別以待測物E7的濃度為橫坐標，以樣品與內標物的峰面積比值為縱坐標，采用加權最小二乘法進行回歸計算，求得直線回歸方程，y=0002 3x+0047 7， R2=0994 4，且各濃度的測定值與真實值偏差均小于15%，表明在25～1 250，E7濃度與響應值呈良好的線性關系，符合要求。低、中、高質控樣品的回收率分別（9240 ± 603）%，（10180 ± 414）%，（9914 ± 531）%。實驗結果表明該濃度范圍內回收率較高，準確度符合要求，測定結果準確、可信。日內、日間精密度的RSD都小于9%，符合要求。基質抑制率小于13%，基本不會對測定產生影響。方法學驗證的結果表明，該方法特異性、準確度、精密度和基質效應等均符合本實驗的要求，見表1。

32E7在不同種屬肝微粒體中的代謝穩定性

分別考察了E7在人、犬、猴、大鼠肝微粒體中的代謝穩定性，E7在4個種屬的肝微粒體中均有較明顯代謝，孵育時間與底物剩余百分比的孵育曲線見圖2。E7在人、犬、猴、大鼠肝微粒體酶中均發生代謝，20 min內代謝較快；孵育20～30 min，剩余底物的量變化較小，趨于穩定。

33體外半衰期與固有清除率

在人、犬、猴、大鼠肝微粒體中，以底物剩余百分比的自然對數與孵育時間作線性回歸，大鼠肝微粒體中的線性回歸方程為y=-0023x+4410，R2=0877；犬肝微粒體中的線性回歸方程為y=-0010x+4566，R2=0885；猴肝微粒體中的線性回歸方程為y=-0041x+4410，R2=0880；人肝微粒體中的線性回歸方程為y=-0012x+4475，R2=0732。由各線性曲線的斜率計算體外代謝半衰期與固有清除率，結果見表2。

34E7在大鼠肝微粒體中的代謝表型

E7的CYP代謝是由多酶介導的，抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉（CYP2E1特異性抑制劑），毛果蕓香堿（CYP2A6特異性抑制劑），α萘黃酮（CYP1A2特異性抑制劑）和奎尼丁（CYP2D6特異性抑制劑）是參與其代謝的主要同工酶，代謝抑制率分別是7824%，7265%，6828%，6003%，與不加化學抑制劑的空白對照組相比代謝酶活性有均顯著性差異（P<001），表明CYP2E1，CYP2A6，CYP1A2，CYP2D6可能參與代謝E7，見表3。表3各抑制劑對大鼠肝微粒中E7代謝的影響

4討論

本文首次建立了香豆素類抗腫瘤化合物E7的UPLCMS/MS測定方法，該方法專屬性強、靈敏度高、準確度高、重復性好。E7在人、犬、食蟹猴和大鼠等4個不同種屬的肝微粒體中體外代謝半衰期T1/2分別為5775，6930，1690，3013 min；體外固有清除率分別為0004 8，0004 0，0016 4，0009 2 L·min·g-1，推測E7在人和犬肝微粒體中代謝速率相近，均比較慢；在猴和大鼠肝微粒體中代謝速率相近，均比較快；表明其代謝速率存在明顯的種屬差異。本實驗的結果有助于藥物開發人員在后續研究中選擇最相關的動物（犬）進行E7的體內藥物代謝研究，進而預測E7在人體的代謝情況[8]。而猴和大鼠，因為E7在其中的代謝性質跟人差異比較大，并不能準確預測E7在人體的代謝情況，在后續的實驗中將不作考慮。 CYP2E1，CYP2A6， CYP1A2和CYP2D6均可能參與代謝E7，而多態性的CYP3A4對其的代謝貢獻較小。相對于藥物間相互作用，E7由多種代謝酶代謝，這將大大降低因體內某一種酶被誘導或抑制而導致嚴重不良反應的風險；同時，多態性的代謝酶對其代謝貢獻小，也就降低因CYP基因多態性而引起個體差異的幾率，故針對藥物間相互作用，E7表現出理想的代謝表型特性。

[參考文獻]

[1]Sirisoma N， Pervin A， Zhang H， et al. Discovery of N（4methoxyphenyl） N，2dimethylquinazolin4amine， a potent apoptosis inducer and efficacious anticancer agent with high blood brain barrier penetration[J]. J Med Chem， 2009， 52：2341.

[2]Kasibhatla S， Baichwal V， Cai S X， et al. MPC6827：a smallmolecule inhibitor of microtubule formation that is not a substrate for multidrug resistance pumps[J]. Cancer Res， 2007， 67（12）：5865.

[3]郝光，王振國，付文艷，等. 香豆素類化合物抗腫瘤作用研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2008， 33（18）：2016.

[4]孔令雷，胡金鳳，陳乃宏. 香豆素類化合物藥理和毒理作用的研究進展[J]. 中國藥理學通報，2012， 28（2）：165.

[5]楊秀偉，徐波，冉福香，等. 11種香豆素類化合物對人膀胱癌細胞系EJ細胞株生長抑制活性的篩選[J]. 中西醫結合學報，2007， 5（1）：56.

[6]焦士勇，艾常虹，李愛芳，等. 補骨脂酚的體外肝微粒體代謝及代謝減毒作用的種屬比較[J]. 中國藥理學通報，2011， 27（2）：216.

[7]莊笑梅，林慶輝，李春正，等. 羅通定在人、比格犬和大鼠肝微粒體代謝轉化的體外比較研究[J]. 中國藥理學通報，2009， 25（9）：1147.

[8]Martignoni M， Groothuis M M， Kanter R. Species differences between mouse， rat， dog， monkey andhuman CYPmediated drug metabolism， inhibition and induction[J]. Drug Metab Toxicol， 2006， 2（6）：875.

[9]Cohen L H， Remley M J， Raunig D， et al. In vitro drug interactions of cytochrome p450：an evaluation of fluorogenic to conventional substrates[J]. Drug Metab Dispos， 2003， 31：1005.

[10]劉治軍，傅得興，湯光. FDA藥物相互作用研究指南（草案）2006版解讀[J]. 國際藥學研究雜志， 2008， 35（1）：50.

[11]張劍萍，郭澄. 生物樣品分析中的方法學驗證[J]. 中國藥房， 2008， 19（31）：2469.

[責任編輯曹陽陽]