胃鉍鎂對胃癌細胞凋亡的誘導作用及機制研究

喬巍，邸軍，汪小莞，孫佳昕，張琦，李江，李曉萌Δ

(1.東北師范大學 生命科學學院 分子表觀遺傳學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024； 2.吉林省人民醫院 病理科，吉林 長春 130000；3.吉林大學口腔醫院 口腔修復科，吉林 長春 130041)

胃鉍鎂對胃癌細胞凋亡的誘導作用及機制研究

喬巍1?，邸軍2?，汪小莞1，孫佳昕1，張琦1，李江3Δ，李曉萌1Δ

(1.東北師范大學 生命科學學院 分子表觀遺傳學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024； 2.吉林省人民醫院 病理科，吉林 長春 130000；3.吉林大學口腔醫院 口腔修復科，吉林 長春 130041)

目的 研究胃鉍鎂對胃癌細胞株SGC-7901增殖和凋亡的作用及可能機制。方法 以三聯藥(三種市售胃炎胃潰瘍類藥物聯合用藥)、胃鉍鎂、胃鉍鎂中藥總組分、胃鉍鎂化藥總組分為實驗組，分別作用于胃癌細胞SGC-7901，MTT法檢測細胞的增殖狀態；Hoechst33342染色法檢測細胞的凋亡；流式細胞儀檢測細胞周期；Western blot法檢測STAT3信號通路相關蛋白的表達。結果 4種藥物分別處理細胞后，相比于對照組和三聯藥組，胃鉍鎂組和胃鉍鎂中藥總組分組能夠顯著抑制細胞增殖且具有劑量依賴性；凋亡百分數顯著增高(P<0.05)；能將細胞周期阻滯于G1期(P<0.05)；Western blot結果顯示SGC-7901細胞中STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達量顯著降低。結論 胃鉍鎂及其中藥總組分可以顯著抑制胃癌細胞SGC-7901增殖，促進細胞凋亡，阻滯細胞周期，其作用機制可能與抑制STAT3信號通路相關蛋白p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2表達有關。

胃鉍鎂；胃癌；STAT3信號通路

胃癌(gastric cancer)是胃上皮來源的惡性腫瘤，據統計，2015年我國胃癌的新發病例為67.91萬，死亡病例為49.8萬，占我國消化道惡性腫瘤的首位，成為我國第二大致死癌癥[1]。近年研究表明，萎縮性胃炎及其伴有的腸化生、細胞異型增生與胃癌的發生關聯緊密；提示對萎縮性胃炎具有顯著療效的藥物，特別是多靶點的組方藥物可能具有預防和治療胃癌的潛在功能[2]。胃鉍鎂顆粒是我國具有自主知識產權的國藥準字號藥物，對臨床上各種胃炎、胃潰瘍和胃黏膜損傷有很好的療效。胃鉍鎂為復方制劑，由中藥總組分(甘草浸膏粉、弗朗鼠李皮、茴香粉、石菖蒲和蘆薈)和化藥總組分(鋁酸鉍、重質碳酸鎂和碳酸氫鈉)組成。該藥物不僅具有胃黏膜保護作用，其中多種中藥活性組分還具有細胞信號的調節功能和機體免疫的調節功能，具有很好的抗腫瘤功能的開發前景[3]。本研究旨在從細胞學角度探討胃鉍鎂對胃癌SGC-7901細胞株增殖能力的影響，研究胃鉍鎂調節SGC-7901細胞內STAT3信號的作用機制，為胃鉍鎂藥物在胃癌防治方面的應用和可能組分開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：胃癌SGC-7901 細胞系由本實驗室保存。

1.1.2 藥品與試劑：DMEM培養基和胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司。MTT Hoechst33342染色液購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；胃鉍鎂藥物及其各組分藥物由弘美制藥中國有限公司提供；三聯藥：克拉霉素片購自上海雅培制藥有限公司；阿莫西林膠囊購自聯邦制藥股份有限公司；埃索美拉唑鎂腸溶片購自阿斯利康制藥有限公司。

1.1.3 儀器：酶標儀(ELx808，美國Bio-Tek公司)；流式細胞儀(EPICS-ELITE-ESP)；熒光顯微鏡(Olympus，Japan)；電泳儀(JM-250，大連捷邁科貿有限公司)；電轉槽(Biorad)。

1.2 方法

1.2.1 藥物濃度設定：藥物濃度根據說明書定量，將如下濃度作為藥物處理的標準濃度，分別是三聯藥：克拉霉素片1.8 μg/mL、阿莫西林膠囊5.6 μg/mL、埃索美拉唑鎂腸溶片0.1 μg/mL；胃鉍鎂100 μg/mL；胃鉍鎂中藥總組分71.4 μg/mL；胃鉍鎂化藥總組分28.6 μg/mL。同時設置此濃度條件下的1/3濃度作為低濃度，3倍濃度作為高濃度，每種藥物采用3個濃度作為實驗濃度作用于胃癌SGC-7901 細胞。

1.2.2 細胞培養和分組：利用含10%的標準胎牛血清培養SGC-7901細胞，置于5%的CO2、37 ℃恒溫孵箱中，平均3～4 d傳代一次。取對數生長期的SGC-7901細胞進行實驗。按照1.2.1下濃度設定分為對照組、三聯藥組、胃鉍鎂組、胃鉍鎂中藥總組分組和胃鉍鎂化藥總組分組。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901細胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液，以每孔2×103cells接種于96孔板中，每孔培養液100 μL，第2天細胞更換成1%FBS的DMEM培養，按1.2.2下分組加入各種藥物，培養24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇450 nm波長和620 nm波長，用A450 nm-A620 nm表示吸光度，在酶標儀上測定各孔光吸收值。以時間為橫軸，吸收值為縱軸繪制細胞增殖曲線。實驗重復3次。

1.2.4 Hoechst33342染色觀察凋亡細胞核：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901細胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液，以每孔1×105cells接種于6孔板中，每孔培養液2 ml，第2天細胞更換成1% FBS的DMEM培養，按1.2.2下分組加入各種藥物，作用24 h后，直接加入配置好的Hoechst33342染色液，37 ℃染色30 min。 PBS洗2次后，加入新的PBS液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901細胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液，以每孔1×106cells接種于6孔板中，每孔培養液2 mL，第2天細胞更換成1% FBS的DMEM培養，按1.2.2下分組加入各種藥物，作用24 h，胰酶消化離心收集并懸于PBS中，70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙錠的染色液染色30 min，流式細胞儀測定DNA含量變化，用MULTICYCLE軟件處理結果。流式細胞術測定細胞周期。

1.2.6 Western blot法檢測STAT-3信號通路相關蛋白的表達：按1.2.2下分組處理細胞，RIPA消化提取蛋白，并配置成相同濃度的蛋白質溶液。配置12%分離膠和5%濃縮膠，調整電壓80～120 V電泳2 h，300 mA恒定電流轉膜4 h，室溫牛奶封閉1 h，加一抗(STAT3、p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2稀釋倍數均為1:200)4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。加入二抗室溫反應1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。進行化學發光反應、曝光并進行灰度值分析。

2 結果

2.1 胃鉍鎂對胃癌SGC-7901細胞株增殖的影響 MTT結果顯示：與對照組和三聯藥組相比，胃鉍鎂組和胃鉍鎂中藥總組分組能顯著抑制細胞增殖，差異均有統計學意義(P<0.05)；且隨著藥物濃度的增加，胃鉍鎂和胃鉍鎂中藥總組分組對細胞的增殖抑制率逐漸上升并且呈現量效關系。表明胃鉍鎂和胃鉍鎂中藥總組分能夠顯著抑制SGC-7901細胞增殖且具有劑量依賴性。見表1。

表1 胃鉍鎂對SGC-7901細胞增殖的影響

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.2 胃鉍鎂對胃癌SGC-7901細胞株凋亡的影響 熒光顯微鏡下顯示：對照組、三聯藥組及胃鉍鎂化藥總組分組細胞核均呈卵圓形，染色質均勻著色并分布于整個細胞核，熒光強度較強。胃鉍鎂組和胃鉍鎂中藥總組分組的細胞染色質凝聚、斷裂、呈點狀，著色不均勻呈亮點狀，見圖1。對凋亡細胞進行統計，結果顯示胃鉍鎂組和胃鉍鎂中藥總組分組較對照組能顯著抑制細胞凋亡(P<0.05)；而三聯藥組的凋亡誘導效應不顯著，見表2。

圖1 胃鉍鎂對胃癌SGC-7901細胞株凋亡的影響Fig.1 Apoptosis effect of Weibimei on SGC-7901 cell

組別細胞凋亡率(%)對照組5 594±3 816三聯藥組7 605±2 586胃鉍鎂組30 764±7 770??胃鉍鎂中藥總組分組17 070±4 824?胃鉍鎂化藥總組分組10 232±1 869

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.3 胃鉍鎂對胃癌SGC-7901細胞周期的影響 流式結果顯示：與對照組比較，胃鉍鎂組和胃鉍鎂中藥總組分組G1期細胞數量顯著增多，S期細胞明顯減少(P<0.05)，說明胃鉍鎂及其中藥總組分能阻滯SGC-7901細胞周期在G1期，見表3。

表3 胃鉍鎂對SGC-7901細胞周期的影響

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.4 胃鉍鎂對胃癌細胞SGC-7901細胞中STAT3信號通路相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示：與對照組相比，胃鉍鎂組及胃鉍鎂中藥總組分組SGC-7901細胞中的STAT3、p-STAT3蛋白表達量均減少，且STAT-3信號靶基因CyclinD1、Bcl-2的蛋白表達也明顯降低。其中，胃鉍鎂中藥單組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲處理后STAT-3信號通路蛋白的下降最為顯著。這些結果說明胃鉍鎂可通過抑制STAT3信號通路來影響胃癌細胞的增殖活性，且主要是通過其中藥組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲。見圖2。

圖2 胃鉍鎂對胃癌細胞SGC-7901細胞中STAT3信號通路相關蛋白表達的影響Fig.2 The protein expression related to STAT3 signaling pathway in SGC-7901cell treatment by Weibimei

3 討論

胃癌嚴重威脅人類的健康，是全世界最常見的消化道腫瘤之一[4]。SGC-7901細胞株是人胃腺癌細胞株，具有相對較高的轉移特性，是具有代表性的胃癌細胞株。本研究以該細胞株為模型，應用MTT，Hoechst 33342染色方法來檢測胃鉍鎂和胃鉍鎂各組分對胃癌SGC-7901細胞株增殖/凋亡能力的影響。結果表明，胃鉍鎂可以顯著抑制胃癌細胞SGC-7901增殖，促進細胞凋亡，并且這種作用效果主要來自胃鉍鎂中藥總組分。

胃癌發生發展過程中存在著細胞周期調控機制的紊亂，細胞周期失控是腫瘤惡性增殖的根本原因[5]。本研究通過細胞周期實驗檢測了胃鉍鎂對胃癌細胞SGC-7901周期的影響。結果表明，胃鉍鎂作用SGC-7901細胞后，細胞G1期細胞增加，S期細胞減少，細胞發生了G1期阻滯；提示胃鉍鎂通過影響細胞G1/S期轉換作用實現了對胃癌細胞增殖的抑制效應。

STAT3作為一種轉錄因子，促進細胞增殖信號的開啟，在胃癌發生發展過程中發揮重要作用[6]。大量研究數據表明，STAT3持續激活是腫瘤細胞異常增殖和惡性轉化的關鍵變化。異?；罨腟TAT3信號增強了腫瘤的抗凋亡抗耐藥能力，促進了腫瘤的侵襲、轉移及血管新生[7-9]。STAT3信號的異常活化與胃癌的發生發展、轉移、預后都有密切關系[10]。本實驗研究結果表明，與對照組相比，胃鉍鎂能下調STAT3和p- STAT3的表達，說明胃鉍鎂可以抑制STAT3激活，并抑制STAT3信號調節下的cyclinD1和Bcl-2等增殖基因。

研究發現早期胃癌、進展期胃癌組織中的cyclinD1表達率顯著高于正常胃黏膜組織[11]。cyclinD1是常見的細胞周期蛋白，是STAT3下游重要的靶基因，主要功能是促進細胞增殖和分裂，干擾cyclinD1的表達可以使胃癌細胞阻滯在G1期[12]。本實驗研究也發現，胃鉍鎂作用胃癌細胞SGC-7901后，細胞周期阻滯在G1期，與對照組相比，cyclinD1的表達減弱。在細胞凋亡程序中，有一個關鍵基因Bcl-2，它具有抑制細胞凋亡的功能，在胃癌細胞中，它通過延長細胞生存期、增加腫瘤侵襲能力來有效抑制細胞凋亡[13]。本實驗發現，與對照組相比，胃鉍鎂能夠顯著下調Bcl-2的表達，促進細胞凋亡。

綜上所述，胃鉍鎂能顯著抑制胃癌SGC-7901細胞增殖，促進細胞凋亡，阻滯細胞周期，這種作用效果主要來自胃鉍鎂中藥總組分。胃鉍鎂抗腫瘤的作用機制可能與中藥組分能降低STAT3信號通路相關蛋白p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2的表達有關。下一步將研究胃鉍鎂中藥各組分的作用機制。

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(編校：吳茜)

Study on functions and mechanisms of Weibimei in inducing gastric cancer cell apoptosis

QIAO Wei1?, DI Jun2?，WANG Xiao-wan1, SUN Jia-xin1, ZHANG Qi1, LI Jiang3Δ, LI Xiao-meng1Δ

(1.Key Laboratory of Molecular Epigenetics of MOE, School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024, China; 2.Department of Pathology,People’s Hospital of Jilin Province,Changchun 130000,China;3.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatologic Hospital, Jilin University, Changchun 130041)

ObjectiveTo investigate the proliferative and apoptotic effects of Weibimei on gastric cancer cell and the possible mechanisms.MethodsGastric cancer SGC-7901 cell were cultured with four drugs：Sanlianyao(three kinds of drugs for the treatment of gastric ulcer), Weibimei, Chinese medicine of Weibimei, and Chemical drugs of Weibimei as the experimental groups.The proliferation of SGC-7901 cell was determined by MTT assays.The cell apoptosis was evaluated by Hoechst33342 staining.The effect on SGC-7901 cell cycle was measured by flow cytometry.The protein expression related to STAT3 signaling pathway in SGC-7901cell was examined by Western blot.ResultsAfter SGC-7901cells were treated line with each four drug for 24h, Weibimei or its Chinese medicine portion could obviously inhibit the proliferation of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner and increase the percentage of apoptosis rate significantly (P<0.05).In addition, the cell cycle of SGC-7901 arrested at G1 phase with the general or Chinese medicine portion of Weibimei supplement.Furthermore, Weibimei and its Chinese medicine portion down-regulated the expression of STAT3, phosphorylated STAT3(p-STAT3), CyclinD1, and Bcl-2 in SGC-7901 cells.ConclusionWeibimei, and its Chinese medicine portion exerted potent anticancer activity by inhibiting cell proliferation, inducing apoptosis and arresting the cell cycle in gastric cancer SCG-7901 cells, and this function was associated with STAT3 signaling inhibition.

Weibimei; gastric cancer; STAT3 signaling pathway

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.05

科技部國際合作項目資助課題(2010DFA31430)；國家自然科學基金(30871301，30700827)；吉林省科技廳科研基金資助課題(20130521010JH， 20150101187JC，20150414007GH)；吉林省教育部科研基金資助課題(2015-526， 2015-551)；高?；究蒲袠I務費專項基金(2412015ZH005，130017507)；高校人才引進項目資助課題(B07017)；吉林省產業創新專項(2016C047-3)

喬巍，女，碩士在讀，研究方向：腫瘤信號轉導，E-mail：qiaow634@nenu.edu.cn；邸軍，共同第一作者，男，主任醫師，研究方向：腫瘤信號轉導，E-mail:Dijun1991@163.com；李曉萌，通信作者，女，教授，博士生導師，研究方向：腫瘤信號轉導，E-mail：lixm441@nenu.edu.cn； 李江，共同通信作者，男，教授，碩士生導師，研究方向：腫瘤信號轉導，E-mail：ljiang@jlu.edu.cn。

R735.2

A