高效液相色譜法與全自動(dòng)免疫比濁法測(cè)定HbA1c的臨床應(yīng)用研究

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高效液相色譜法與全自動(dòng)免疫比濁法測(cè)定HbA1c的臨床應(yīng)用研究

張超強(qiáng)①賴春苗①?gòu)埩η颌傥讖V平①吳國(guó)平①

【摘要】目的：探討高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）與全自動(dòng)免疫比濁法（immunoturbidimetry，ITM）測(cè)定糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）的臨床應(yīng)用。方法：選取2014年1月-2015年1月河源市龍川縣人民醫(yī)院內(nèi)分泌科糖尿病患者115例（研究組）與體檢中心健康體檢者115例（對(duì)照組），全部研究對(duì)象均采用HPLC、ITM測(cè)定HbA1c水平，比較兩組HbA1c水平的差異，并分析兩種檢測(cè)方法的數(shù)據(jù)有效性、相關(guān)性、偏差與精密度的差異。結(jié)果：經(jīng)Bland-Altman相對(duì)偏倚散點(diǎn)圖顯示，全部測(cè)量數(shù)據(jù)均在95%可置信區(qū)間（0.60，1.00）內(nèi)，全部測(cè)量數(shù)據(jù)有效。研究組HbA1c水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），其中隨著HbA1c水平的降低，糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率顯著降低，不同HbA1c水平的糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率比較差異有顯著性（P＜0.05）。線性回歸分析顯示，HPLC與ITM檢測(cè)方法具有明顯的相關(guān)性（R2=0.9993）。偏差分析顯示，低、中、高值（HbA1c=4.0%～6.4%，6.5%～15.9%、16.0%）預(yù)測(cè)相對(duì)偏差均屬于可接受范圍。批內(nèi)與批間精密度比較顯示，研究組變異系數(shù)（CV）明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而HPLC法的CV較低。結(jié)論：高效液相色譜法用于測(cè)定HbA1c與評(píng)估糖尿病并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中具有重要的意義，且其與ITM具有良好的相關(guān)性，準(zhǔn)確度與精密度均較高，可作為臨床參考標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法； 全自動(dòng)免疫比濁法； HbA1c

①?gòu)V東省龍川縣人民醫(yī)院 廣東 龍川 517300

First-author’s address：Longchuan County People’s Hospital，Longchuan 517300，China

糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）在糖尿病初步篩查與診斷中具有明顯的優(yōu)勢(shì)［1］。本研究通過(guò)比較高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）與全自動(dòng)免疫比濁法（immunoturbidimetry，ITM）測(cè)定HbA1c的優(yōu)劣勢(shì)，旨在提高HbA1c對(duì)糖尿病的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2015年1月本院內(nèi)分泌科住院部的115例糖尿病患者作為研究組，全部患者均符合糖尿病的確診標(biāo)準(zhǔn)［2］。同期選取本院健康體檢中心的115例健康體檢者作為對(duì)照組。研究組：男50例，女55例，年齡35～55歲，平均（43.02±6.25）歲；對(duì)照組：男52例，女53例，年齡34～58歲，平均（42.98±6.31）歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）檢測(cè)儀器與試劑：高效液相色譜儀（VARIANT Ⅱ，美國(guó)伯樂(lè)公司），試劑采用原廠配套試劑。全自動(dòng)免疫比濁檢測(cè)儀（AU2700全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)貝克曼公司），全自動(dòng)免疫比濁試劑盒（廣州科方生物技術(shù)有限公司）。（2）檢測(cè)步驟：全部研究對(duì)象均采用一次性EDTA-K2真空抗凝管采集靜脈全血，標(biāo)本采集嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書操作，冷凍保存待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書在高效液相色譜分析儀與全自動(dòng)生化分析儀上，準(zhǔn)確設(shè)定相關(guān)參數(shù)，檢測(cè)標(biāo)本HbA1c水平。（3）質(zhì)量控制：每份標(biāo)本測(cè)定時(shí)同時(shí)測(cè)定2個(gè)質(zhì)控品，分別采用高效液相色譜法與全自動(dòng)免疫比濁法測(cè)定，每天測(cè)定的23份標(biāo)本，按照正向順序1→23測(cè)定1次，再按照反向順序23→1重復(fù)測(cè)定1次，連續(xù)10 d，共230份標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 有效性分析 以同份標(biāo)本的平均HbA1c水平作為橫坐標(biāo)，同份標(biāo)本的比值（檢測(cè)樣本/參照樣本）作為縱坐標(biāo)，繪制Bland-Altman相對(duì)偏倚散點(diǎn)圖，觀察離群點(diǎn)是否在95%可置信區(qū)間內(nèi)，如全部測(cè)量數(shù)據(jù)均位于95%可置信區(qū)間內(nèi)，如無(wú)需剔除離群點(diǎn)，則提示全部測(cè)量數(shù)據(jù)有效［3］。

1.3.2 HbA1c水平 比較兩組患者HbA1c水平的差異，分析不同HbA1c水平與糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率的關(guān)系。

1.3.3 相關(guān)性分析 采用線性回歸分析高效液相色譜法與全自動(dòng)免疫比濁法兩種測(cè)定方法的相關(guān)性。以HPLC檢測(cè)方法測(cè)定值作為橫坐標(biāo)（X），ITM檢測(cè)方法測(cè)定值作為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算直線回歸方程［4］。

1.3.4 偏差分析 以HbA1c=4.0%～6.4%作為低值，HbA1c=6.5%～15.9%作為中值，HbA1c≥16.0%作為高值，以2014年廣東省臨床檢驗(yàn)中心臨床化學(xué)質(zhì)量控制允許偏倚范圍的1/2（7.5%），計(jì)算低值、中值、高值的預(yù)測(cè)相對(duì)偏差與總誤差的差值，如總誤差-預(yù)測(cè)相對(duì)偏差＞0，則屬于可接受范圍，反之，總誤差-預(yù)測(cè)相對(duì)偏差＜0，則屬于不可接受范圍［5］。

1.3.5 精密度分析 采用重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算平均HbA1c水平與變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），CV越小，其重復(fù)性越佳，CV＜5.0%則提示具有良好的重復(fù)性［6］。（1）批內(nèi)精密度：任意取研究組與對(duì)照組標(biāo)本各1份，1 d內(nèi)同時(shí)測(cè)定20次。（2）批間精密度：任意取研究組與對(duì)照組標(biāo)本各1份，冰凍保存，每天測(cè)定1次，連續(xù)20 d。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 X2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法的測(cè)量數(shù)據(jù)有效性分析 本研究230份標(biāo)本（230組數(shù)據(jù)）中，經(jīng)Bland-Altman相對(duì)偏倚散點(diǎn)圖（圖1）顯示，95%可置信區(qū)間為（0.60，1.00），全部測(cè)量數(shù)據(jù)均在95%可置信區(qū)間內(nèi)，無(wú)需剔除離群點(diǎn)，全部測(cè)量數(shù)據(jù)有效。

圖1 230份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Bland-Altman相對(duì)偏倚散點(diǎn)圖

2.2 兩組患者HbA1c水平比較 研究組HPLC、ITM檢測(cè)的HbA1c水平均明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 兩組患者HbA1c水平比較（±s） %

表1 兩組患者HbA1c水平比較（±s） %

組別　HbA1c（HPLC）　HbA1c（ITM）研究組（n=115）　11.26±0.25　11.27±0.27對(duì)照組（n=115）　5.16±0.17　5.17±0.18 t值　4.15　4.17 P值　　＜0.05　　＜0.05

2.3 不同HbA1c水平糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生情況比較 HPLC、ITM檢測(cè)結(jié)果顯示：HbA1c＜6.5%糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于HbA1c=6.5%～9.0%、HbA1c＞9.0%，HbA1c=6.5%～9.0%糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于HbA1c＞9.0%，不同HbA1c水平糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 不同HbA1c水平糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生情況比較 例（%）

2.4 兩種檢測(cè)方法相關(guān)性分析 根據(jù)HPLC與ITM檢測(cè)HbA1c水平（%）的線性回歸分析圖，直線回歸方程為Y=0.09901X+0.07，R2=0.9993，HPLC與ITM檢測(cè)方法具有明顯的相關(guān)性。

2.5 兩種檢測(cè)方法的偏差分析 兩種檢測(cè)方法的偏差分析顯示，總誤差-低值預(yù)測(cè)相對(duì)偏差＞0，總誤差-中值預(yù)測(cè)相對(duì)偏差＞0，總誤差-高值的預(yù)測(cè)相對(duì)偏差＞0，均屬于可接受范圍，詳見(jiàn)表3。

表3 兩種檢測(cè)方法的偏差分析

2.6 兩種檢測(cè)方法的精密度分析 批內(nèi)與批間精密度比較顯示，研究組HPLC、ITM檢測(cè)的平均HbA1c水平與CV明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中HPLC檢測(cè)的CV稍低于ITM，但兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表4。

表4 兩種檢測(cè)方法的精密度分析 %

3 討論

隨著生活方式與飲食習(xí)慣的改變，糖尿病發(fā)生率呈逐年增高的傾向，并成為全球常見(jiàn)的慢性內(nèi)科疾病之一，嚴(yán)重影響身體健康與生活質(zhì)量。HbA1c有助于反映糖尿病患者6～8周內(nèi)的平均血糖水平，且不受胰島素、空腹、抽血時(shí)間與血糖波動(dòng)等因素的影響。因此，HbA1c在糖尿病的診斷與治療中具有重要的意義。2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（American Diabetes Association，ADA） 將 HbA1c≥ 6.5%作為糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，5.7%～6.3%作為糖尿病的高危人群［7］。2011年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式采納HbA1c≥6.5%作為糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。目前，美國(guó)糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（AVUP）推薦采用高效液相色譜法（HPLC）作為HbA1c的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)［9］。但HPLC檢測(cè)方法的硬件條件較高，成本較高，不適用于基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用［10］。全自動(dòng)免疫比濁法（ITM）操作較為簡(jiǎn)便，成本較為低廉。但關(guān)于HPLC與ITM 在HbA1c中的測(cè)定價(jià)值研究罕見(jiàn)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Bland-Altman相對(duì)偏倚散點(diǎn)圖顯示，全部測(cè)量數(shù)據(jù)均在95%可置信區(qū)間（0.60，1.00）內(nèi)，全部測(cè)量數(shù)據(jù)有效。同時(shí)，糖尿病患者HbA1c水平均明顯高于健康體檢者，其中隨著HbA1c水平的降低，糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率顯著降低，不同HbA1c水平糖尿病患者并發(fā)癥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。揭示了HbA1c水平在糖尿病的診斷與糖尿病并發(fā)癥的預(yù)測(cè)中具有重要的價(jià)值。由于HbA1c是血糖與機(jī)體血紅蛋白相結(jié)合的產(chǎn)物，HbA1c水平與血糖濃度具有明顯的正相關(guān)，且HbA1c維持時(shí)間約為120 d，臨床上可將HbA1c作為糖尿病患者8～12周的血糖控制指標(biāo)［11］。同時(shí)，由于HbA1c生成較為緩慢，性質(zhì)較為穩(wěn)定，不容易受短期血糖波動(dòng)的影響。與空腹血糖、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）相比，HbA1c檢測(cè)較為簡(jiǎn)便，穩(wěn)定變異性較低，依從性高，因此可作為糖尿病患者有效的篩查指標(biāo)［12］。結(jié)合本研究結(jié)果，HbA1c水平越高，其糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率越高，因此測(cè)定HbA1c水平有助于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變與糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。文獻(xiàn)［13］證實(shí)，HbA1c水平≤7.0%有助于控制糖尿病周圍神經(jīng)血管病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。線性回歸分析顯示，HPLC與ITM檢測(cè)方法具有明顯的相關(guān)性（R2=0.9993）。偏差分析顯示，低、中、高值（HbA1c=4.0%～6.4%，6.5%～15.9%、16.0%）預(yù)測(cè)相對(duì)偏差均屬于可接受范圍。批內(nèi)與批間精密度比較顯示，糖尿病患者變異系數(shù)（CV）明顯高于健康體檢者，而HPLC法的CV較低。HPLC經(jīng)重復(fù)性試驗(yàn)顯示，糖尿病患者批內(nèi)CV（3.2%），批間CV（4.1%），均低于5.0%，符合臨床檢驗(yàn)要求，提示HPLC具有的檢測(cè)重復(fù)性較高［14］。糖尿病患者ITM的批內(nèi)CV（3.9%），批間CV（4.6%），與HPLC具有明顯的相關(guān)性（R2=0.9993），且預(yù)測(cè)相對(duì)偏差位于可接受范圍之內(nèi)，與文獻(xiàn)［15］的報(bào)道結(jié)果相一致。

綜上所述，高效液相色譜法用于測(cè)定HbA1c與評(píng)估糖尿病并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中具有重要的意義，且其與ITM具有良好的相關(guān)性，準(zhǔn)確度與精密度均較高，可作為臨床參考標(biāo)準(zhǔn)。

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Clinical Application Research on High Performance Liquid Chromatography and Immunoturbidimetry for HbA1c Determination

ZHANG Chao-qiang，LAI Chun-miao，ZHANG Liqiu，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（12）：035-038

【Abstract】Objective：To investigate the clinical application of on high performance liquid chromatography （HPLC） and immunoturbidimetry（ITM） for hemoglobin A1c（HbA1c） determination.Method：From January2014 to January 2015 in Longchuan County People’s Hospital，115 cases diabetes patients from Endocrinology Department were selected as the study group，115 cases healthy people from Health Examination Center were selected as the control group，HbA1c levels of all subjects were determined by HPLC，ITM，HbA1c levels of two groups were compared，the differences of data validity，correlation，deviation and precision between two determinations were analyzed. Result： All data were measured by Bland-Altman relative bias，all data in 95% confidence interval（0.60，1.00），all data were validity.HbA1c levels of the study group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05），with the decrease of HbA1c level，the incidence rate of diabetes complications were significantly lower，and the difference of the incidence rate of diabetes was significant in different HbA1c levels（P＜0.05）.Linear regression analysis showed，HPLC and ITM detection were significantly correlated（R2=0.9993）.Deviation analysis showed，relative deviation of low，medium and high values （HbA1c=4.0%-6.4%，6.5%-15.9%，16.0%） were acceptable.Compared with the intra assay and inter assay，variation coefficient（CV） of the study group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05），and CV of HPLC was lower.Conclusion：High performance liquid chromatography has important significance for HbA1c determination and diabetes complications risk assessment，and it has correlation with ITM，the accuracy and precision of HPLC are higher，it can be used as clinical reference standard.

【Key words】High performance liquid chromatography； Immunoturbidimetry； HbA1c

通信作者：張超強(qiáng)

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.010

收稿日期：（2015-11-12） （本文編輯：程旭然）