GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53聯合測定在結直腸癌中的表達及應用研究*

鐘緯經詹雪乳陳廣峰

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GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53聯合測定在結直腸癌中的表達及應用研究*

鐘緯經①詹雪乳①陳廣峰①

【摘要】目的：探討結直腸癌組織中正谷胱甘肽-S-轉移酶-π（GST-π）、DNA拓撲異構酶（TopoⅡ）、P-糖蛋白（P-gp）、Ki-67抗原（Ki-67）及P53基因（P53）的表達及臨床意義。方法：選取2014年1月-2015年6月本院收治的術前未做化療的24例結直腸癌患者作為研究對象，根據預后情況將其分為預后生存＜1年組8例和預后生存＞1年組16例，分析GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53表達與臨床病理特征的關系，比較兩組患者GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達陽性率。結果：24例結直腸癌患者，GST-π表達陽性9例（低度表達7例，中度表達2例），TopoⅡ表達陽性23例（低度表達15例，中度表達8例），P-gp表達陽性23例（低度表達8例，中度表達15例），Ki-67表達陽性24例（低度表達3例，中度表達11例，高度表達10例），P53表達陽性10例（低度表達3例，中度表達3例，高度表達4例）。預后生存＞1年組GST-π、P53的表達陽性率均為12.5%，顯著低于預后生存＜1年組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），而在TopoⅡ、P-gp、Ki-67方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：聯合檢測GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達有助于結直腸癌早期發現及評估患者預后，值得臨床推廣。

【關鍵詞】結直腸癌； 生物標志物； 表達； 聯合檢測； 預后

①廣東省肇慶市中醫院 廣東 肇慶 526020

First-author’s address：Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhaoqing City，Zhaoqing 526020，China

結直腸癌是消化道系統常見的惡性腫瘤之一，隨著腫瘤生物標記物研究的深入，大量研究證實，正谷胱甘肽-S-轉移酶-π（GST-π）、DNA拓撲異構酶（TopoⅡ）、P-糖蛋白（P-gp）、Ki-67抗原（Ki-67）、P53基因（P53）在結直腸癌患者的表達與健康體檢者存有差異，為結直腸癌的早期診斷、早期治療提供了依據［1-3］。但是，流行病學調查顯示，雖然其早期診斷準確率提高，但是結直腸癌患者術后5年生存率較低，而隨著對腫瘤標記物認識的加深，發現GST-π、TopoⅡ等可能與結腸癌的形成、發展及預后密切相關［4］。本研究選取2014年1月-2015年6月本院收治的24例結直腸癌患者作為研究對象，應用免疫組化法檢測其結直腸癌組織的GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達，分析其表達與臨床病理特征的關系，旨在為結直腸癌臨床診斷、治療及預后判斷提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2015年6月本院收治的術前未做化療的結直腸癌患者24例作為研究對象，所有患者均有完整的隨訪資料，經病理證實均為腺癌，排除結直腸癌家族史、其他組織或器官的惡性腫瘤、嚴重精神疾病或依從性較差者。其中男13例，女11例；年齡42～84歲，平均（63.41±7.69）歲；腫瘤直徑1.2～8.5 cm，平均（4.76±1.08） cm；其中結腸癌12例，直腸癌12例；病理類型：黏液腺癌1例，息肉狀管狀、乳頭狀腺癌1例，管狀、絨毛狀腺瘤伴黏膜內癌1例，管狀、絨毛狀腺瘤局部黏膜重度不典型增生（黏膜內癌變）1例，乳頭狀腺癌1例，小細胞神經內分泌癌1例，中低分化2例，中分化15例，高分化1例；淋巴結轉移15例，未轉移9例。根據預后將其分為兩組，預后生存＞1年組16例中，男9例，女7例；年齡42～80歲，平均（62.5±8.07）歲；預后生存＜1年組8例中，男4例，女4例，年齡47～84歲，平均（64.3±7.48）歲。兩組患者性別、年齡等方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與材料 鼠抗人單克隆抗體GST-π（克隆號LW29）、TopoⅡ（克隆號3F6）、P-gp（克隆號C494）、Ki-67（克隆號MIB-1）、P53（克隆號DO-7）及即用型免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒、3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑均購自于福州邁新公司。石蠟組織切片機（LICA2245型）。

1.3 方法 制作結直腸癌組織石蠟切片9張，其中1張用于常規HE染色，其余8張用于免疫組化及備用。應用免疫組化檢測GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達，各項操作嚴格按試劑盒說明書進行，批內變異＜6.0%。一般流程：（1）切片室溫脫蠟2次，以不同濃度酒精梯度脫苯、水化各3 min，以自來水沖洗3 min，PBS浸泡2次；（2）切片置入3%過氧化氫溶液，孵育15 min，PBS浸泡2次；（3）加入一抗，置入4 ℃冰箱過夜；（4）PBS浸泡2次；（5）加入二抗，室溫下孵育10～15 min；（5）PBS浸泡2次；（6）滴入DAB顯色液，顯色4～10 min后以自來水水洗；（7）經復染、鹽酸酒精分化、返藍后封片并判斷結果。結果選擇10個高倍鏡視野計算陽性比例，分級標準：陰性指無陽性細胞染色；弱陽性指陽性細胞1%～25%；陽性指陽性細胞26%～50%；強陽性指陽性細胞＞50%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用 X2檢驗，多組多分類資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達及與臨床病理特征的關系 24例患者中，GST-π表達陰性15例，陽性9例（低度表達7例，中度表達2例）；TopoⅡ表達陰性1例，陽性23例（低度表達15例，中度表達8例）；P-gp表達陰性1例，陽性23例（低度表達8例，中度表達15例）；Ki-67表達陰性0例，陽性24例（低度表達3例，中度表達11例，高度表達10例）；P53表達陰性14例，陽性10例（低度表達3例，中度表達3例，高度表達4例）。GST-π表達與分化程度有關（P＜0.05），TopoⅡ表達與發病部位有關（P＜0.05），P-gp表達與性別有關（P＜0.05），Ki-67表達與與腫瘤大小有關（P＜0.05），P53表達與發病部位有關（P＜0.05），見表1。GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53免疫組織化學染色結果見圖1。2.2 兩組不同指標表達陽性率比較 預后生存＞1年組結直腸癌患者GST-π、P53的表達陽性率均為12.5%，明顯低于預后生存＜1年組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），而兩組TopoⅡ、P-gp、Ki-67方面比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67和P53的表達及與臨床病理特征的關系 例

圖1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53免疫組織化學染色結果

表2 兩組不同指標表達陽性率比較 例（%）

3 討論

結直腸癌是惡性程度高的消化道腫瘤之一，流行病學調查顯示，其在我國人群中的發病率高達（20～30）/萬人次，嚴重威脅著患者生命安全。隨著結直腸的基礎和臨床研究的進步，提高了結直腸癌的早期診斷準確度，但是由于腫瘤細胞耐藥性導致結直腸癌的化療療效并不理想［5-7］。近年來，隨著分子生物學的發展，從癌基因、抑癌基因及腫瘤耐藥基因研究癌癥的發病原因、發病機制、治療措施選擇及影響預后的因素等成為臨床關注的熱點［8-11］。

GST-π是GST五個亞形中與腫瘤關系最密切的，其具有谷胱甘肽結合位點和一個親電子物質結合位點，能夠催化谷胱甘肽與化學藥物、親電性化合物結合降低化療藥物細胞毒性，且能夠與親電性藥物結合促進藥物外排，導致腫瘤細胞對化療藥物，如阿霉素、順鉑等產生耐藥性［12］。TopoⅡ作為拓撲異構酶抑制劑，能夠調節核酸空間結構動態變化，其高表達使腫瘤復制加快，增加腫瘤的惡性程度，同時其還是胺丫啶、蒽環類和鬼臼毒素等藥物的靶蛋白，活性降低會使抗癌藥的靶點減少或喪失，與多藥耐藥性密切相關［13］。P-gp由多藥耐藥基因1編碼產生，其作為ATP結合盒轉運蛋白超家族的一員，通過藥物轉運泵模式、疏水性真空清除泵模式將化療藥物從細胞內泵到細胞外，降低細胞內藥物濃度，其表達程度與耐藥程度成正比［14-15］。此外，P53基因被認為是與人類腫瘤相關性最高、突變最頻發的一種基因，其突變型作為致癌基因會促進細胞惡性轉化、增殖，而Ki-67蛋白被認為是檢測腫瘤細胞增殖動力學的最佳指標，其表達可診斷和預測腫瘤對治療的敏感度及其結局。

本研究24例結直腸癌患者中，GST-π表達陰性15例，陽性9例，TopoⅡ表達陰性1例，陽性23例，P-gp表達陰性1例，陽性23例，Ki-67表達陰性0例，陽性24例，P53表達陰性14例，陽性10例，與文獻［6］報道相一致。對GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達與臨床病理特征的關系進行研究，結果顯示GST-π表達與腫瘤分化程度有關，TopoⅡ表達與年齡、發病部位有關，P-gp表達與年齡、性別有關，Ki-67與腫瘤大小有關，P53與發病部位有關。因此，聯合檢測GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53可以有效評估結直腸癌自然病程、惡性程度等。預后生存＞1年組結直腸癌患者GST-π、P53的表達陽性率均為12.5%，明顯低于預后生存＜1年組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示各腫瘤標志物介導的耐藥譜或者敏感譜不同，因此聯合檢測其在結直腸癌中的表達有助于判斷耐藥情況與預后。但兩組TopoⅡ、P-gp、Ki-67比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。考慮是由于樣本量較少，患者個體差異較大，本研究僅為初步探索，需要更大樣本量的研究來得出一個更為穩定和確切的結論。

綜上所述，聯合檢測GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表達有助于結直腸癌早期發現和評估患者預后。

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Expression and Application of GST-π，TopoⅡ，P-gp，Ki-67 and P53 Joint Determination in Colorectal Cancer

ZHONG Wei-jing，ZHAN Xue-ru，CHEN Guang-feng.//Medical Innovation of China，2016，13（12）：001-004

【Abstract】Objective：To investigate the expression and its clinical significance of GST-π，TopoⅡ，P-gp，Ki-67and P53 in colorectal cancer tissue.Method：A total of 24 cases of colorectal cancer who had not been treated before surgery in our hospital from January 2014 to June 2015 were selected as the research objects，they were divided into the prognosis survival less than 1 year group with 8 cases and the prognosis survival more than 1 year group with 16 cases according to the prognosis，the relationship between GST-π，TopoⅡ，P-gp，P53，Ki-67 expression and clinical pathological features were analyzed and the positive expression rate of GST-π，TopoⅡ，P-gp，P53，Ki-67 were compared.Result：For 24 cases of colorectal cancer，GST-πexpression was positive in 9 cases （low expression in 7 cases，moderate expression in 2 cases），TopoⅡ expression was positive in 23 cases （low expression in 15 cases，moderate in 8 cases），P-gp expression was positive in 23 cases （low expression in 8 cases， moderate in 15 cases），Ki-67 expression was positive in 24 cases （low expression in 3 cases，moderate in 11 cases，highly expressed in 10 cases），P53 expression was positive in 10 cases （low expression in 3 cases，moderate in 3 cases，highly expressed in 4 cases）.The prognosis survival more than 1 year group of GST-π and P53 expression positive rate was all 12.5%，significantly lower than that of the prognosis survival less than 1 years group，the differences were statistically significant（P＜0.05），and there were no significant differences in TopoⅡ，P-gp and Ki-67（P＞0.05）.Conclusion：Combined detection of GST-π，P-gp，TopoⅡ，Ki-67 and P53 contribute to colorectal cancer early diagnosis and evaluate the prognosis of patients，it is worthy of clinical promotion.

【Key words】Colorectal cancer； Biomarker； Expression； Combined detection； Prognosis

*基金項目：肇慶市科技創新計劃項目（2014E289）

通信作者：鐘緯經

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.001

收稿日期：（2015-12-01） （本文編輯：李穎）