Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體構建及其對大鼠心肌細胞肥大的影響

鄭亞萍，劉春杰2

（漯河醫學高等?？茖W校1.生理教研室，2.藥理教研室，河南漯河 462002）

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Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體構建及其對大鼠心肌細胞肥大的影響

鄭亞萍1，劉春杰2

（漯河醫學高等專科學校1.生理教研室，2.藥理教研室，河南漯河 462002）

【摘要】目的 構建特異性抑制大鼠Raf-1基因的重組腺病毒載體，并將其體外轉導大鼠心肌細胞中進行功能鑒定。方法 合成針對大鼠Raf-1的靶序列及陰性對照序列，經退火形成的DNA雙鏈定向克隆到穿梭質粒pAdTrackCMV中獲得pAdTrack-siRaf-1質粒，PmeI線性化后在BJ5183細菌中與pAdEasy-1骨架質粒進行同源重組獲得pAd-siRaf-1質粒，后轉染HEK293細胞，包裝獲得pAd-siRaf-1腺病毒顆粒，繼而感染原代培養的心肌細胞，通過Western blot方法檢測siRNA對Raf-1、NF-κB基因的抑制效率，液體閃爍計數儀測定3H-亮氨酸（［3H］-leu）摻入率，用HJ2000圖像分析系統測定細胞表面積。結果 重組腺病毒載體經酶切、鑒定正確，制備的病毒感染效率高，攜帶Raf-1的病毒顆粒能夠在蛋白水平有效抑制Ang II誘導心肌細胞Raf-1的表達、細胞表面積及［3H］-leu的增加并下調Raf-1、NF-κB表達。結論 成功構建了pAd-siRaf-1重組腺病毒載體，并在HEK293細胞中包裝成重組腺病毒，轉染心肌細胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表達，抑制Ang II誘導的心肌細胞肥大。

【關鍵詞】Raf-1；小干擾RNA；重組腺病毒載體；心肌細胞；大鼠

Raf-1蛋白是由raf基因編碼的蛋白產物，可通過Raf-1蛋白激酶磷酸化而激活，Raf-1蛋白激酶是RAF/NF-κB等信號傳導途徑中的重要信號分子，被激活的Raf-1過表達與細胞增殖、應激甚至與凋亡密切相關［1，2］，但目前Raf-1對心肌肥厚中的作用還存在一定的爭議。研究顯示RAS/RAF/MEK/ERK信號通路對大鼠心肌有明顯的促肥厚效應，但也有報道提示抑制RAS/RAF激活并不能減輕心肌細胞肥大反應［3，4］。另一方面，目前在心肌肥大細胞模型中，暫無明確研究證明NF-κB與心肌細胞肥大的關系，且RAF/NF-κB等信號傳導途徑對心肌肥大的作用也少見報道，尚需進一步研究。本研究的目的在于擬構建大鼠Raf-1siRNA腺病毒載體，轉染后觀察其對Raf-1蛋白表達的影響，并通過在基因水平沉默技術研究Raf-1及RAF/NF-κB等信號傳導途徑對心肌細胞肥大的影響，為探討Raf-1對心肌肥厚的作用提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1實驗動物

出生2～3 d SD乳鼠，由河南省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（豫）2010-0002，使用許可證號：SYXK（豫）2011-0001。

1.2材料及試劑

穿梭質粒pAdTrackCMV質粒、腺病毒骨架質粒pAdeasy-1購自 Stratagene公司、293細胞株購自Invitrogen公司、感受態大腸埃希菌DH5a及BJ5183菌種來自本實驗室留存；PacI、PmeI、KpnⅠ和Bgl II酶購自New England Biolabs公司，Raf-1克隆抗體、NF-κB多克隆抗體購自Santa Cruz公司，［3H］-亮氨酸（［3H］-Leu）購于中國原子能研究院。

1.3心肌細胞的培養及鑒定

取出生后2 d～3 d的SD乳鼠，在無菌條件下取出心室并剪碎，在0.1%胰酶消化后收集細胞，離心棄上清液，將所得全部細胞用含10%小牛血清的DMEM培養液重懸，置于二氧化碳培養箱中孵育，采用差速貼壁獲得心肌細胞，免疫組化染色顯示α-橫紋肌肌動蛋白陽性率。

1.4Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體構建

1.4.1Raf-1 siRNA序列的設計：從GenBank中獲得SD大鼠基因核苷酸序列（NM-012639.2），通過http：//sirna.wi.mit.edu/home.php輔助設計出3條靶序 列，1.siRaf-1-1（1612-1630）：TTCCAGATGTTCCAGCTAA；2.siRaf-1-2（776-794）：ATGGATTTCGAT GTC AGAC；3.siRaf-1-3（2067 -2085）AGTCAAAGAAGAAAGGCCT，將所選取的序列進行Blast，未發現同源序列，另設siRNA陰性對照（與人類及其他哺乳動物非同源的無關序列）。人工合成針對Raf-1不同靶序列的3對及siRNA陰性對照序列1對引物，每對互補的單鏈模板DNA在正義鏈的5'端引入KpnⅠ酶切位點、在反義鏈的5'端引入BglⅡ酶切位點，環 （Loop）的序列為5'-GCAAGAG-3'（表1）。

表1　Raf-1和陰性對照siRNA模板DNA序列Tab.1 Sequences of the Raf-1 and negative control siRNA template DNA

1.4.2重組腺病毒載體pAd-Raf-1-siRNA的構建及鑒定：合成四對寡核苷酸經95℃退火后形成雙鏈寡核苷酸，與Kpn I和Bgl II雙酶切pAdTrackCMV質粒連接，轉入大腸埃希菌DH5a轉化，通過卡那霉素篩選并挑取單個菌落進行培養，抽提質粒后分別進行酶切鑒定和測序鑒定。用PmeI對pAdTracksiRaf-1和陰性對照pAdTrack-siCon穿梭載體進行線性化，CIP去磷酸化后，在大腸桿菌BJ5183中與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1進行同源重組，獲取pAdsiRaf-1及pAd-siCon用帶有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板進行篩選相對分子質量大于pAdeasy-1質粒，PacI酶切鑒定。

1.4.3腺病毒的包裝、擴增和滴度測定：重組腺病毒載體經PacI酶切、乙醇純化后，Lipofectamine 2 000轉染入293細胞中。培養5 d～7 d后可見細胞出現貼壁細胞變圓，腫脹，即病變效應（cytopathic effect，CPE），待觀察到90%以上細胞出現CPE，將細胞在-70℃和37℃反復凍融3次，3 000 r/min離心5 min，收集原代病毒上清液，經反復“感染-凍融-收集”，擴增重組腺病毒至第四代后，合并濃縮病毒液，進行病毒的滴度測定，病毒滴度（Pfu/mL）=107×平均GFP陽性的細胞數/視野（100）

1.5心肌細胞培養、鑒定

取出生2 d～3 d的SD乳鼠，在無菌條件下取出心室，剪碎、0.1%胰酶消化，收集細胞，離心棄上清液，將所得全部細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸，置于二氧化碳培養箱中孵育。根據心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間不同，采用差速貼壁1.5 h，獲得心肌細胞。免疫組化染色（S-P法）觀察α-橫紋肌肌動蛋白反應。

1.6Western blot檢測siRaf-1、NF-κB在肥大心肌細胞中的表達

胰酶消化細胞后，以每孔1.5×105/孔的心肌細胞數接種6孔板，用獲得重組腺病毒按50MOI的量分別感染心肌細胞的同時加用10-7mol/L Ang II，另設Ang II組（單用10-7mol/Lang II）及空白心肌細胞組（不加處理因素），48 h收集細胞后提取各組細胞的蛋白質，電泳、轉膜后加封閉液，室溫封閉60 min；加入稀釋1∶2 000 Anti-rat Raf-1、1∶500 NF-κB一抗孵育，4℃搖床過夜；洗滌3次用封閉液1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，37℃孵育1 h；漂洗后加顯色劑，避光顯色2 min～5 min，條帶出現，終止反應，以 β-actin為內參，進行比較。

1.7心肌細胞大小測定

每孔1.5×105/孔的心肌細胞數接種6孔板，用獲得重組腺病毒按50MOI的量分別感染心肌細胞的同時加用10-7mol/L Ang II，另設Ang II組（單用10-7mol/Lang II）及空白心肌細胞組（不加處理因素），胰酶消化脫落細胞后用相差顯微鏡拍照，每孔取10個視野，每視野取10個細胞，用HJ2000圖像分析系統測定細胞表面積，取平均值。

1.8心肌細胞［3H］-Leu摻入率測定

加藥物干預的同時加入［3H］-Leu（3.7×104 Bq/孔），培養48 h后用PBS液充分沖洗，再將細胞收集于玻璃纖維濾膜上，用預冷的10%三氯乙酸和PBS沖洗，裂解液裂解細胞30 min，收集細胞裂解液置于含閃爍液的液閃杯中，用液體閃爍儀測定放射性強度（dpm）。

1.9統計學方法

2　結果

2.1重組腺病毒載體的構建及鑒定

四對siRNA單鏈寡核苷酸成功退火，合成四個雙鏈DNA模板，得到約100 bp的兩個片段。抽提pAdTrack-siRaf-1和 pAdTrack-siCon質粒后分別進行Kpn I和Bgl II雙酶切鑒定，出現約9 000 bp和小于100 bp兩片段（圖1）；將構建成功的穿梭質粒與腺病毒骨架質粒pAdeasy-1在BJ5183細菌中進行同源重組，成功重組的腺病毒載體經PacI酶切后應出現一條大于23 kb，另一條帶約為4.3 kb（圖2），測序鑒定明3個針對不同靶序列的Raf-1及陰性對照表達載體正確無誤。

2.2重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

pAd-siRaf-1及pAd-siCon轉染包裝細胞293細胞，轉染2 d后，倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達，培養細胞10 d后可觀察到90%以上細胞表達綠色熒光蛋白（圖3）。收集、重復感染293細胞擴增病毒后，用GFP陽性細胞計數法進行滴度測定，病毒滴度分別為3.8×1010pfu/mL和3.5×1010pfu/mL。

2.3心肌細胞鑒定

心肌細胞形態不規則，有多個偽足伸出；免疫組化染色顯示，α-橫紋肌肌動蛋白呈陽性反應即為心肌細胞，取20個視野統計心肌細胞陽性率測得心肌細胞陽性率達96.2%（圖4、圖5）。

2.4pAd-siRaf-1表達重組腺病毒病毒對Ang II誘導的心肌細胞表面積、［3H］-Leu摻入率及Raf-1、NF-κB蛋白表達的影響

Ang II組心肌細胞表面積、［3H］-Leu摻入率及Raf-1、NF-κB蛋白表達顯著高于空白對照組（均P ＜0.01）；siRaf-1-1～3重組腺病毒組心肌細胞表面積、［3H］-Leu摻入率及 Raf-1蛋白表達明顯低于Ang II組（均P＜0.05）；pAd-siCon與空白對照組相比無明顯差異（圖6，表1）。

圖1　KpnⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定重組穿梭質粒1.pAd-siCon；2.pAd-siRaf-1-1；3.pAd-siRaf-1-2；4.pAdT-siRaf-1-3Fig.1 pAdTrack-siRaf-1 identified by Kpn I and Bgl II digestion

圖2　PacI酶切鑒定重組腺病毒載體Fig.2 pAd-siRaf-1 identified by PacI digestion

圖3　pAd-siRaf-1及pAd-siCon重組腺病毒包裝和轉導293細胞（標尺=200μm）Fig.3 pAd-siRaf-1 and pAd-siCon recombinant adenovirus packaged and transduced into 293 cells（Bar=200）

圖4　培養3 d的心肌細胞（標尺=100 μm）Fig.4 Cardiomyocytes cultured for 3 days（Bar=100 μm）

圖5　心肌細胞S-P染色（標尺=50 μm）Fig.5 Cardiomyocytes with S-P staining（Bar=50 μm）

表2　重組腺病毒對心肌細胞Raf-1，NF-κB蛋白表達、表面積及［3H］-leu摻入率的影響Tab.2 Effect of recombinant adenovirus on the expression of Raf-1 and NF-κB proteins，the surface area and［3H］-leu incorporation of the cardiomyocytes（±s，n=6）

表2　重組腺病毒對心肌細胞Raf-1，NF-κB蛋白表達、表面積及［3H］-leu摻入率的影響Tab.2 Effect of recombinant adenovirus on the expression of Raf-1 and NF-κB proteins，the surface area and［3H］-leu incorporation of the cardiomyocytes（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01，Compared with the control group；#P＜0.05，##P＜0.01 Compared with the Ang IIgroup.

NF-κB蛋白表達Expression of NF-κB protein組別Groups細胞表面積Surface area（μm2）［3H］-leu摻入率［3H］-leu incorporation（dpm）Raf-1蛋白表達Expression of Raf-1 protein Control　567.48±6.24　151.23±11.34　0.53±0.04　0.74±0.04 Ang II　1421.17±13.83**　387.47±21.13**　0.91±0.07**　1.51±0.11**Ang II+pAd-siCon　1572.38±9.24**　359.68±14.31**　0.86±0.03##　1.35±0.08**Ang II+pAd-siRaf-1-1　738.22±9.39*##　212.41±16.21*##　0.29±0.02**##　0.51±0.06*##Ang II+pAd-siRaf-1-2　1092.24±15.32**#　317.58±18.48**#　0.35±0.05*##　0.64±0.05##Ang II+pAd-siRaf-1-3　1191.41±16.52**#　328.24±13.22**#　0.55±0.04##　0.75±0.07##

圖6　重組腺病毒對心肌細胞中Raf-1及NF-κB蛋白表達的影響Fig.6 The expression of Raf-1 and NF-κB after the cardiomyocytes were transduced with pAd-siRaf-1 and pAd-siCon recombinant adenovirus

3　討論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種新近發展起來的能有效阻斷基因表達的技術。本研究以含有表達綠色熒光蛋白基因的pAdTrack-CMV為穿梭載體，能方便的觀察轉染效果，利用缺失了腺病毒E1區基因骨架質粒pAdeasy-1，避免腺病毒對靶細胞的損害；采用細菌內同源重組AdEasy系統，構建針對Raf-1基因的siRNA重組腺病毒載體，應用基因轉染技術，將其轉染入293細胞，在該細胞中成功地包裝成含siRaf-1的腺病毒顆粒后，經純化濃縮，滴度達到3.8×1010pfu/mL，轉導入大鼠心肌細胞，有效地沉默了Raf-1的表達，而無關序列構建的陰性對照病毒，轉染效率與干擾病毒相當，但不影響Raf-1表達。

心肌肥厚是心室重構的重要病理學特征，與心肌缺血、心力衰竭等的發生發展密切相關，心肌細胞是心肌肥厚的主要效應細胞，表現為心肌細胞肥大。Raf-1蛋白是由 raf基因編碼的蛋白產物，由648個氨基酸組成，有多個絲氨酸磷酸化位點和酪氨酸磷酸化位點［5，6］，RAS/RAF/MEK/ERK信號轉導過程與細胞生長、細胞周期停滯有關，對培養心肌細胞的肥厚反應有重要的調節作用［7］，但也有報道提示抑制RAS/RAF激活并不能減輕心肌細胞肥大反應。本實驗通過構建Raf-1基因重組腺病毒siRNA研究其對心肌肥大的影響，發現pAd-siRaf-1-1～3重組腺病毒均能顯著抑制AngⅡ誘導的心肌細胞表面積及［3H］-Leu摻入率，提示pAd-siRaf-1重組腺病毒確具有抗心肌細胞肥大的作用，從基因水平證實Raf-1對心肌細胞肥大具有促進作用。

NF-κB為轉錄因子蛋白家族成員，靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白以非活性的形式存在于胞漿中。當細胞因子、LPS等刺激時，NF-κB激酶復合物IKKs（κB kinases）被激活，使 κB經快速磷酸化、泛素化后降解，暴露出NF-κB的DNA結合域，NF-κB發生核移位并與相應靶基因上特定的κB序列結合，啟動靶基因的轉錄［8］，Raf-1/MEK/ MAPK是激活IKK的主要信號通路［9，10］。研究表明NF-κB的激活參與糖尿病患者心肌細胞的凋亡，且其對細胞凋亡的調控作用在早期有抑制細胞凋亡而隨著時間推移，NF-κB的增多也引起了大量炎性因子的產生，其誘導細胞凋亡的作用增強，故細胞凋亡增多。大鼠心肌纖維化模型及體外培養的心肌成纖維細胞研究均證實，抑制NF-κB可以抑制成纖維細胞的增殖，進而抑制心肌纖維化［11，12］，RAF/NF-κB信號轉導對心肌肥厚的作用尚不明確。本實驗結果顯示Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體的能顯著下調心肌細胞Raf-1及NF-κB蛋白表達，pAd-siRaf-1-1的作用較pAd-siRaf-1-2～3作用更為明顯，說明pAd-siRaf-1對心肌肥大的抑制作用與下調Raf-1表達，進而抑制NF-κB表達有關，且對心肌細胞沉默Raf-1作用肥大抑制效果最佳的為pAd-siRaf-1-1，證實RAF/NF-κB信號轉導在心肌肥厚的過程中不僅有成纖維細胞增殖的參與，心肌細胞肥大參與了此過程。

總之，Raf-1腺病毒siRNA能有效抑制心肌肥大，且其機制與下調Raf-1蛋白，進而抑制RAF/NF-κB信號轉導有關，通過在基因水平高選擇性地阻斷Raf-1、NF-κB的藥物也為治療心肌肥厚提供了新思路。

參考文獻：

［1］ Robbs BK，Lucena PI，Viola JP.The transcription factor NFAT1 induces apoptosis through cooperation with Ras/Raf/MEK/ERK pathway and upregulation of TNF-α expression［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1833（8）：2016-2028.

［2］ Lv C，Sun W，Sun H，et al.Asperolide A，a marine-derived tetranorditerpenoid，induces G2/M arrest in human NCI-H460 lung carcinoma cells，is mediated by p53-p21 stabilization and modulated by Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway［J］.Mar Drugs，2013，11（2）：316-331.

［3］ Yamaguchi O，Watanabe T，Nishida K，et al.Cardiac-specific disruption of the c-raf-1 gene induces cardiac dysfunction and apoptosis［J］.J Clin Invest，2004，114（7）：937-943.

［4］ Clerk A，Bogoyevitch MA，Andersson MB，et al.Differential activation of protein kinase C isoforms by endothelin-1 and phenylephrine and subsequent stimulation of p42and p44 mitogen-activated protein kinases in ventricular myocytes cultured from neonatal rat hearts［J］.J Biol Chem，1994，269：32848-32857.

［5］ Lorenz K，Schmitt J P，Vidal M，et al.Cardiac hypertrophy：targeting Raf/MEK/ERK1/2 sign-aling［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（12）：2351-2355.

［6］ Pfleiderer P，Sumandea MP，Rybin VO，et al.Raf-1：a novel cardiac troponin T kinase［J］.J Muscle Res Cell Motil.2009，30（1-2）：67-72.

［7］ 屈春生，陳莉萍，李道麟.替米沙坦對大鼠心肌肥厚組織中Raf/MEK/ERK信號通路的影響［J］.重慶醫科大學學報，2013，38（11）：1344-1347.

［8］ Lee M，Kim JY，Anderson WB，et al.Src tyrosine kinase inhibitor PP2 markedly enhances Ras-independent activation of Raf-1 protein kinase by phorbolmyristate ace-tate and H2O2［J］. J Biol Chem，2004，279（47）：48692-48701.

［9］ Hamid T，Gu Y，Ortines RV，et al.Divergent tumor necrosis factor receptor related remodeling responses in heart failure：role of nuclear factor-kappa B and inflammatory activation［J］. Circulation，2009，119：1386-1397.

［10］ 祝文靜，劉暢，孟林燕，等.核因子-κB和 caspase-3在高糖誘導的心肌細胞代謝記憶中的表達 ［J］.廣東醫學，2012，33：323-325.

［11］ Wu M，Han M，Li J，et al.17beta-estradiol inhibits angiotensin II induced cardiac myofibroblast differentiation［J］.Eur J Pharmacol，2009，616：155-159.

［12］ Young D，Popovic ZB，Jones WK，et al.Blockade of NF-kappaBusingIkappaBalphadominant-negativemice amelioratescardiachypertrophyinmyotrophin-overexpressed transgenic mice［J］.J Mol Biol，2008，381（3）：559-568.

〔修回日期〕2016-02-22

Construction and effect of recombinant adenovirus vector containing siRNA targeting Raf-1 on cardiomyocyte hypertrophy in neonatal rats

ZHENG Ya-Ping1，LIU Chun-Jie2
（1.Department of Physiology，2.Department of Pharmacology，Luohe Medical College，Luohe，Henan 462002，China）

【Abstract】Objective To construct an adenovirus vector expressing small interfering RNA（siRNA）targeting to rat Raf-1 gene and identify its function in cardiomyocytes.Methods The siRNA containing DNA sequence targeting to Raf-1 and its negative control sequence were designed，synthesized，annealed and subcloned into adenoviral shuttle vector pAdTrack-CMV.The recombinant adenovirus vector pAd-siRaf-1 was obtained by homologous recombination with pAdTrack-siRaf-1 linearized by PmeI and pAdeasy-1 in bacteria BJ5183，then transfected into HEK293 cells to package the adenovirus.Cardiomyocytes were infected with the adenovirus pAd-siRaf-1，and the expressions of Raf-1 and NF-κB protein were detected by Western blotting.［3H］-leu incorporation was evaluated by scintillation.The surface area of cardiomyocytes was measured using a HJ2000 image analysis system.Results The adenovirus vectors were verified by enzyme digestion and DNA sequencing.Compared with the Ang II group，Raf-1 and NF-κB expression，the surface area and［3H］-leu incorporation of cardiomyocytes were significantly decreased in cardiomyocytes infected with the adenovirus PAd-siRaf-1.Conclusions A recombinant adenovirus vector containing rat siRaf-1 gene is successfully constructed.It can effectively reduce Raf-1 and NF-κB expression and cardiomyocyte hypertrophy induced by Ang II.

【Key words】Raf-1；siRNA；Recombinant adenovirus vector；Cardiomyocytes；Rat

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0018-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.004

［基金項目］河南省教育廳青年骨干教師資助項目（No.2013GGJS-271）。

［通訊作者］鄭亞萍（1976-），女，碩士，副教授，研究方向：循環生理學。