線粒體DNA D-loop區(qū)多態(tài)性與肝癌預(yù)后的研究

張風賓，郭占軍，吳忱思，張瑞星

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050011）

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線粒體DNA D-loop區(qū)多態(tài)性與肝癌預(yù)后的研究

張風賓，郭占軍，吳忱思，張瑞星

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050011）

【摘要】目的 通過對線粒體DNA D-loop區(qū)的堿基測序，了解其多態(tài)性及突變情況，并探討其與肝癌發(fā)病機率及預(yù)后的關(guān)系。方法 提取49個乙型肝炎后肝癌病人的肝癌組織，癌旁組織和血液中的線粒體DNA，用測序法測定線粒體DNA D-loop區(qū)的堿基序列，了解其單核苷酸多態(tài)性和變異情況，并分析其與肝癌發(fā)病率及2年生存率的關(guān)系。結(jié)果 通過觀察發(fā)現(xiàn)，肝癌病mtDNA突變情況與肝癌預(yù)后無明確相關(guān)，而1個SNP位點（核苷酸150 C/T）與肝癌的生存期之間存在統(tǒng)計學上的顯著差異。經(jīng)COX回歸分析，發(fā)現(xiàn)150位點為肝癌預(yù)后的獨立危險因素；150C的患者生存期顯著短于150T的生存期（相對危險度，0.246；95%CI，0.070-0.861；P=0.028）。結(jié)論通過分析在線粒體DNAD-loop區(qū)的多態(tài)性，可以幫助篩別預(yù)后不良的肝癌患者。

【關(guān)鍵詞】肝細胞肝癌；線粒體DNA D-loop；突變；單核苷酸多態(tài)性

肝細胞肝癌是常見惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，是男性第五大好發(fā)腫瘤，是女性第七常見腫瘤［1］，是第二常見的死亡病因［2］，每年有將近50萬的病人死于肝癌［2］。肝癌在中國也是常見腫瘤，中國每年肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為29.9/100 000 和27.7/100 000［3］。危險因素包括B型、C型肝炎病毒和酒精濫用［4］。乙型肝炎病毒感染在我國是一非常嚴重的問題，因我國有9千3百萬的乙型肝炎病毒攜帶者，2千萬的慢性乙型肝炎患者［5］。酒精濫用在中國也逐年上升，6.6%的男性和0.1%的女性診斷為酒精濫用［6］。許多患者進展為肝病，如酒精性肝炎和肝硬化，直至肝癌。雖然隨著檢查手段的改善，肝癌已能較早發(fā)現(xiàn)；但因其復發(fā)率較高，肝癌患者的預(yù)后仍然較差。雖然現(xiàn)在已明確許多因素，如腫瘤的數(shù)目、大小，數(shù)量，細胞分化程度，門脈瘤栓和肝臟炎癥程度，都與肝癌的復發(fā)與預(yù)后相關(guān)，但對于過氧化損傷與肝癌的預(yù)后關(guān)系，則研究較少［7、8］。肝炎病毒感染和酒精濫用導致肝細胞內(nèi)氧化損傷加重，進而導致DNA的變化包括線粒體DNA的不穩(wěn)定性［9-11］。線粒體基因體是長16 kb閉環(huán)雙鏈，含有37個基因，包括2個rRNA和22 tRNA［12］。因為線粒體 DNA產(chǎn)生 ROS并且缺少DNA修復功能，所以線粒體DNA比核DNA更容易損傷［13］。在許多癌癥中，包括肝炎病毒導致的肝癌中，DNA突變頻發(fā)于線粒體DNA的非編碼區(qū)域，稱作D-loop區(qū)［12、14、15］，其包含有1122 bp（nucleotides 16，024-16，569 and 1-576；www.mitomap.org）.因其含有復制的起始鏈和轉(zhuǎn)錄的主要啟動子［16］，所以它對線粒體基因組的復制和表達有著重要的調(diào)節(jié)作用。D-loop區(qū)的序列變化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，但是因為沒有測定血液標本的序列，所以這些序列變化代表體細胞變異還是單核苷酸多態(tài)性還是未知。雖然目前有一些研究通過測定血DNA發(fā)現(xiàn)了一些SNPs（single nucleotide polymorphism，下同）位點，但現(xiàn)在幾乎沒有SNPs被篩選出來以預(yù)測癌癥的發(fā)病風險及預(yù)后［17-19］。本研究中，通過測定肝癌患者的外周血、癌旁及肝癌組織中的mtDNA D-loop 區(qū)DNA序列，發(fā)現(xiàn)了92個SNPs和25個突變位點，并通過與正常對照組比較，篩查出了與肝癌預(yù)后相關(guān)的SNPs位點［16］，并證實了這些突變和SNPs與肝癌預(yù)后的預(yù)測強度。

1　材料和方法

1.1組織標本和線粒體DNA的提取

收集河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院肝膽外科49例肝癌病人（所有患者的肝功能屬Child-Pugh分級A或B，肝總膽紅素水平＜301 mol/L）的癌組織、癌旁組織和血液，立即放-70℃存放。所有病人標本的收集經(jīng)過河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準。用MitochondrialDNAExtractionKit（Genmed Scientific Inc，Shanghai，China）提取線粒體DNA，所有線粒體DNA放-20℃存放備用。

1.2PCR擴增和DNA測序

D-loop用正義引物 5'-CCCCATGCTTACAA GCAAGT-3‘和 反 義 引 物 5'-GCTTTGAGGAG GTAAGCTAC-3'擴增［31］，PCR試劑盒采用 PCR Master Mix Kit（Promega，Madison，WI），通過 PCR System 9700 Thermocycle（Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA）擴增。PCR 產(chǎn)品經(jīng)凈化處理后用Abiprism Genetic Analyzer 3100（Applied Biosystem）進行測序分析。如果同病人癌組織和血液及癌旁組織比較有序列變化，這種變化就定義為變異。

1.3統(tǒng)計學方法

應(yīng)用Kaplan-Meier、log-rank test和 Cox回歸分析對數(shù)據(jù)進行處理。所有的統(tǒng)計處理操作均應(yīng)用SPSS 11.5軟件（SPSS Company，Chicago，IL），P值小于0.05定義為有統(tǒng)計意義。

2　結(jié)果

49例患者中臨床分期一期13人，二期36人；所有病人在肝癌切除術(shù)后均未接受放化療等輔助治療。我們對49例入組病人每3月進行一次隨訪，得到了2年生存情況。2年之內(nèi)共27例患者死亡。收集的臨床資料使用Kaplan-Meier和 log-rank處理。結(jié)果顯示：患者的性別、年齡、Child分級和腫瘤數(shù)目與2年生存率無統(tǒng)計學意義；而腫瘤分期、腫瘤大小和門脈瘤栓則差異存在顯著性（表1）。與預(yù)期相符，不同分期患者的2年生存率具有明顯差別，腫瘤分期I期的為76.9%，而II期僅有33.3%；差異具有顯著性（P＜0.05）；腫瘤直徑＞5 cm的生存期明顯短于腫瘤直徑＜5 cm患者；合并有門脈瘤栓的患者均在隨訪期內(nèi)死亡。以上數(shù)據(jù)表明，腫瘤分期、腫瘤大小和門脈瘤栓為影響肝癌預(yù)后的危險因素。

我們檢測了92個SNPs與肝癌生存期之間的關(guān)系，在每個 SNP位點，49例患者被分為2組，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，在150位點，存在2年生存率的顯著差異，150C的生存期顯著短于150T （P=0.028）（圖1），我們發(fā)現(xiàn)此位點與肝癌預(yù)后相關(guān)。為了進一步分析150位點、腫瘤分期、腫瘤大小、門脈瘤栓這4個可能因素對患者預(yù)后的影響，我們將其引入COX比例風險模型，多因素分析顯示，150位點和門脈瘤栓是影響預(yù)后的獨立因素（表2）。150C基因型的患者2年生存期顯著短于150T（相對危險度，0.246；95%CI，0.070-0.861；P= 0.028）。以上數(shù)據(jù)提示150位點的基因型對肝癌的生存期具有顯著影響。

3　討論

mtDNA D-loop區(qū)的SNPs和突變位點已經(jīng)用來預(yù)測肝癌的發(fā)病情況［16］。本研究通過對 mtDNA（堿基16190-583）的測序進一步研究了SNPs和突變位點與肝癌術(shù)后生存期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)150（C/T）位點與2年生存率有關(guān)，多因素分析顯示，150（C/ T）是影響預(yù)后的獨立因素，D-loop區(qū)不同的SNPs在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有不同的作用，150位點位于高突變1區(qū)（HV2），而以前我們發(fā)現(xiàn)的與食管鱗狀細胞癌相關(guān)的位點位于高變1區(qū)［19］。在這些突變熱點區(qū)域，腫瘤和生殖細胞的mtDNA都極易發(fā)生突變，其中的原因還不得而知。但我們的研究提示其在腫瘤預(yù)后方面具有重要作用。150C患者的生存期明顯較短且生存曲線下降迅速（圖1），但其中的原因需要進一步研究。

表1　患者基本臨床資料Tab.1 Clinical data of the HBV-HCC patients

表2　預(yù)后相關(guān)資料多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the prognostic information

圖1　150位點生存分析Fig.1 Cumulative survival of patients with 150 locus tumors

mtDNA D-loop區(qū)是線粒體基因組復制和表達的重要調(diào)控區(qū)，這一區(qū)域的SNPs可能影響mtDNA的復制，從而影響呼吸鏈的功能，使細胞能量供應(yīng)發(fā)生障礙，產(chǎn)生大量的活性氧?；钚匝蹩梢詫毎嘶蚪M產(chǎn)生損害從而導致腫瘤的發(fā)生［20］。線粒體單倍型類群H和U提供了雜合細胞體模型［21］，已經(jīng)證實這些人的遺傳變異情況是由于氧化磷酸化功能不同而引起。與以前報道相符，本研究發(fā)現(xiàn)TNM分期、門靜脈瘤栓、腫瘤大小和肝細胞肝癌的預(yù)后相關(guān)，依據(jù)2015 NCCN臨床指南，直徑＜3 cm的腫瘤是適于手術(shù)切除的，但我們也切除較大直徑的腫瘤，畢竟大多數(shù)患者就診時腫瘤直徑已超過3厘米。我們的數(shù)據(jù)顯示，對于腫瘤直徑＜5 cm的患者，行肝癌切除2年生存率可以達到80%。

參考文獻：

［1］ Bosetti C，Turati F，La Vecchia C.Hepatocellular carcinoma epidemiology［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2014，28 （5）：753-770.

［2］ Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］.Int J Cancer，2015，136（5）：E359 -E386.

［3］ 王永川，魏麗娟，劉俊田，等.發(fā)達與發(fā)展中國家癌癥發(fā)病率與死亡率的比較與分析 ［J］.中國腫瘤臨床，2012，39：679-682.

［4］ Caldwell S，Park SH.The epidemiology of hepatocellular cancer from the perspectives of public health problem to tumor biology ［J］.J Gastroenterol，2009，44（Suppl 19）：96-101.

［5］ Lu FM，Zhuang H.Management of hepatitis B in China［J］. Chin.Med，2009，122：3-4.

［6］ Lu L，Wang X.Drug addition in China［J］.Ann NY Acad Sci，2008，1141：304-317.

［7］ Maki A，Kono H，Gupta M，et al.Predictive power of biomarkers of oxidative stress and inflammation in patients with hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2007，14：1182-1190.

［8］ 裴廣軍，付莉，崔亞玲，等.中國人群飲酒與原發(fā)性肝癌關(guān)系的Meta分析［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學，2008，35：2626-2627. ［9］ 鄧敬桓，秦雪.原發(fā)性肝癌發(fā)生機制的研究進展 ［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，24：924-926.

［10］ Ribes J，Clèries R，Esteban L，et al.The influence of alcohol consumption and hepatitis B and C infections on the risk of liver cancer in Europe［J］.J Hepatol，2008，49：233-242.

［11］ Lin CW，Lin CC，Mo LR，et al.Heavy alcohol consumption increases the incidence of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus-related cirrhosis［J］.J Hepatol，2013，58：730-735.

［12］ Lee HC，Yin PH，Lin JC，et al.Mitochondrial genome instability and mt DNA depletion in human cancers［J］.Ann New York Acad Sci，2005，1042：109-122.

［13］ Taylor R，Wturnbull DM.Mitochondrial DNA mutations in human disease］J］.Nat Rev Genet，2005，6（5）：389-402.

［14］ Nashikawa M，Nishiguchi S，Shiomi S，et al.Somatic mutation of mitochondrial DNA in cancerous and noncancerous liver tissue in individuals with hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2001，61：1843-1845.

［15］ Sanchez-Cespedes M，Parrella P，Nomoto S，et al.Identification of a mononucleotide repeat as a major target for mitochondrial DNA alterations in human tumors［J］.Cancer Res，2001，61：7015-7019.

［16］ Zhang RX，Zhang FB，Wang CJ，et al.Identification of sequence polymorphism in the D-loop region of mitochondrial DNA as a risk factor for hepatocellular carcinoma with distinct etiology［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29（1）：130.

［17］ Navaglia F，Basso D，F(xiàn)ogar P，et al.Mitochondrial DNA D-loop in pancreatic cancer：somatic mutations are epiphenomena while the germline 16519 T variant worsens metabolism and outcome ［J］.Am J Clin Pathol，2006，126：593-601.

［18］ Wang L，McDonnell SK，Hebbring SJ，et al.Polymorphisms in mitochondrial genes and prostate cancer risk［J］.Cancer Epidemiol Biomark Prev，2008，17：3558-3566.

［19］ Zhang R，WangR，ZhangF，etal.Singlenucleotide polymorphisms inthemitochondrialdisplacementloopand outcome of esophageal squamous cell carcinoma［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29：155.

［20］ Shigenaga MK，Hagen TM，Ames BN.Oxidative damage and mitochondrial decay in aging［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91：10771-10778.

［21］ Gomez-Duran A，Pacheu-Grau D，Lopez-Gallardao E，et al. Unmasking thecauseofmultifactorialdisorders：OXPHOS differences between mitochondrial haplogroups［J］，Hum Mol Genet，2010，19：3343-3353.

〔修回日期〕2016-02-24

Investigation of the association between mitochondrial D-loop polymorphisms and hepatocellular carcinoma outcome

ZHANG Feng-bin，GUO Zhan-jun，WU Chen-si，ZHANG Rui-xing
（Department of Gastroenterology and Hepatology，The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China）

【Abstract】Objective To investigate the accumulation of mutations and single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the displacement loop（D-loop）of mitochondrial DNA（mtDNA）might be associated with cancer risk and disease outcome.Methods We obtained cancerous and noncancerous liver tissues from 49 HBV-related HCC patients at the Fourth Hospital of Hebei Medical University.mtDNA of the liver tissues was extracted with Mitochondrial DNA Extraction Kit.Mutation and polymorphism were confirmed by repeated analysis.We assessed the prediction power of D-loop SNPs in hepatocellular carcinoma（HCC）patients.Results No mutation in these HCC patients had prediction power for postoperational survival，whereas one SNP site（nucleotide 150 C/T）was identified by the log-rank test for statistically significant prediction of HCC survival.In an overall multivariate analysis，allele 150 was identified as an independent predictor of HCC outcome.The length of survival of patients with allele 150C was significantly shorter than that of patients with allele 150T（relative risk，0.246；95%CI，0.070-0.861；P=0.028）.Conclusions The analysis of genetic polymorphisms in the mitochondrial D-loop helps to identify patient subgroups at high risk of a poor disease outcome.

【Key words】Hepatocellular carcinoma，HCC；Mitochondrial D-loop；Mutation；Single nucleotide polymorphisms，SNP；Survival analysis

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0058-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.010

［基金項目］河北省科技廳資助項目，項目編號：132777185。

［通訊作者］張風賓（1981-）男，主治醫(yī)師，碩士研究生學歷，主要研究方向為消化道腫瘤，Email：zhangfengbin1981@163.com