快速PCR介導的NeuroD—3′UTR的定點突變研究

趙金艷+盧宏+張振武+梁洋

摘要：糖尿病是一種由遺傳和環境因素共同引起的代謝紊亂綜合征。與肝細胞核因子有關的幼年發病的成人型糖尿病（MODY） 屬于特殊類型的糖尿病，分為6型，其中Ⅵ 型MODY 為bHLH 家族轉錄因子NeuroD 突變引起的疾病。在體內NeuroD能夠與A類bHLH的轉錄因子E47結合，進而形成二聚體。這種二聚體能夠與胰島素基因的E盒高親和力結合，從而激活胰島素相關基因的轉錄表達；因此，NeuroD對胰腺β細胞的生理功能有很重要的影響。本試驗利用PGMT-NeuroD-3′UTR質粒，通過一次PCR方法使NeuroD-3′UTR上的多個位點發生定點突變，并篩選出突變的目的片段；隨后將突變的片斷連接到螢光素酶報告載體PGL3-CONTROL上，構建了PGL3-3′NeuroD突變載體。該結果可為探討NeuroD基因在胰腺β細胞發育中的生理功能，及進一步治療糖尿病的研究提供了試驗基礎。

關鍵詞：NeuroD；PCR；突變；載體構建；糖尿病

中圖分類號： Q754

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0087-03

糖尿病（diabetes mellitus）是一種代謝性疾病，其特征為由于胰島素分泌不足、胰島素功能障礙或兩者同時存在而導致的，以慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝紊亂[1]。糖尿病是一種由多種因素導致的疾病，這些因素包括遺傳因素、自身因素（自身免疫）及環境因素[2]等。

神經分化因子1 （NeuroD-1） 是一種bHL H蛋白[3] 。在生物學中，NeuroD-1又稱為β細胞E盒轉錄激活因子2 （Beta-2） 。NeuroD-1/Beta-2對靶基因的轉錄激活/抑制作用主要通過和靶基因中的特異性序列結合來實現的。同時，NeuroD-1/Beta-2也能夠與其他靶基因的轉錄因子發生作用，協同調節靶基因的活性狀態，進而影響相關基因的生理功能。隨著生物學的不斷發展，相關研究表明NeuroD-1/Beta-2基因發生突變時，對糖尿病的發生有一定的影響[4]。在利用模式生物小鼠研究NeuroD-1/Beta-2的生物學功能時發現，當NeuroD-1/Beta-2 基因缺失時，小鼠發生嚴重的糖尿病，并且這些患有嚴重糖尿病的小鼠在圍產期發生死亡。在NeuroD-1/Beta-2基因純合缺失的小鼠中表現的酮尿證實，這種嚴重的糖尿病是由于β細胞功能發生異常導致的[5]。因此，NeuroD-1/Beta-2 基因對研究胰腺發育和糖尿病機制具有重要的意義。

基因突變技術常用于研究基因調控、表達和蛋白質的結構功能等，其中，定點突變技術已經越來越被生物學家廣泛應用于基因工程、蛋白質工程研究。目前使用較廣泛的主要有重組PCR法、重疊延伸法、U模版法和大引物突變法等。其中，重疊延伸的方法和大引物突變的方法均需要多次PCR和多對引物，才能使得目標突變率高，這種方法操作復雜并且步驟繁瑣。快速PCR介導的定點突變方法僅需1次PCR 反應，目標突變效率高，操作簡單，節約成本[6]。

本試驗為了構建NeuroD-3′UTR的定點突變，進一步研究NeuroD基因與糖尿病之間的生物學機制，采用快速PCR定點突變的方法，對NeuroD-3′UTR同時進行多個位點的突變，并篩選出突變的目的片段，構建了PGL3-3′NeuroD 突變載體，為探討NeuroD基因在胰腺β細胞發育中的生理功能，及進一步治療糖尿病的研究提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PGMT-NeuroD和PGL3-CONTROL載體由筆者所在實驗室保存。

JM109感受態細胞，D2000 Plus DNA ladder購自北京索萊寶科技有限公司；1 kb DNA Ladder Marker購自于北京艾德萊生物技術有限公司；限制性內切酶XbaⅠ與FseⅠ（NEB公司），T4 DNA連接酶（TaKaRa公司）；DNA凝膠回收試劑盒、快速質粒小量提取試劑盒均購自Omega公司；瓊脂糖購自Biowest公司，其余試劑為國產分析純試劑；PCR引物、質粒測序均由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變引物設計與合成 根據NeuroD的編碼序列（GenBank序列號：gi：226493587）（粗體為突變位點）設計上游引物P1，序列為：5′-GAAAAAAAACCAACAAATTCGTCAATTTGAGCAATTCATCT-3′，下游引物P2，序列為：5′-AGATGAATTGCTCAAATTGACGAATTTGTTGGTTTTTTTTC-3′。

1.2.2 快速PCR介導的突變 以PGMT-NeuroD-3′UTR為模板，采用PCR方法使NeuroD-3′UTR發生多個位點的定點突變。PCR反應體系為20 μL，反應條件為：94 ℃初始變性5 min，16個循環（ 94 ℃ 1 min，58 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min），72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存。擴增片段大小應為 3 432 bp，純化PCR擴增的產物。

1.2.3 NerouD-3′UTR突變質粒構建及鑒定 回收產物用DPN1酶消化模版，消化時間為8 h。消化反應體系為：PGMT-NerouD-3′UTR（PCR回收）17.5 μL，10×DNP1 buffer 2 μL，DNP 1 （10 U/μL）1 μL。將消化產物轉化進JM109大腸桿菌感受態細胞，篩選得到陽性克隆，經菌液PCR驗證后提取質粒，所提質粒經PCR驗證后用XbaⅠ與FseⅠ酶進行雙酶切檢測，用瓊脂糖凝膠驗證突變片段正確后，將獲取的目的DNA 送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。

1.2.4 PGL3-3′UTR載體的構建與鑒定 用XbaⅠ與FseⅠ酶分別對Pgmt-NeuroD-3′UTR和 PGL3-CONTROL進行雙酶切處理，1% 瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收相應目的DNA和質粒酶切片段。DNA片段與酶切的PGL3-CONTROL載體采用T4 DNA 連接酶16 ℃ 過夜連接，轉化后經菌液PCR驗證所提質粒，XbaⅠ與FseⅠ雙酶切鑒定后，將重組質粒命名為PGL3/NeuroD-3′UTR載體。

2 結果與分析

2.1 PCR介導的PGMT-NeuroD-3′UTR突變

設計突變引物P1/P2，以實驗室自存PGMT-NeuroD為模板，采用一次快速PCR方法將PGMT-NeuroD-3′UTR上多個堿基突變。將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定結果顯示，擴增產物約為3 432 bp左右的DNA條帶且特異性較高，同預期片段的大小符合（圖1）。

2.2 PCR介導的PGMT-NeuroD-3′UTR突變檢測

將突變產物經DPN1消化后轉入大腸桿菌感受態細胞JM109中，挑取克隆，通過菌液PCR檢驗克隆的準確性，將菌液PCR鑒定正確的菌液用質粒提取試劑盒提取突變質粒，利用引物P1/P2對所提取的質粒進行PCR檢測，PCR產物約為417 bp，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，條帶大小符合預計（圖2）。

同時利用XbaⅠ與FseⅠ對所提質粒進行雙酶切檢測，經1%瓊脂糖凝膠電泳，短片段約417 bp，長片段3 000 bp左右，符合預計大小（圖3）。

將突變完成的質粒送到公司測序，測序結果顯示正確，目標位置成功突變，位于1854、1855、1856位置的堿基由TTGCACA變成TTCGTAC，并且沒有出現其他堿基的突變（圖4）。

2.3 PGL3-NeuroD3′UTR突變載體的構建

將表達載體PGL3-CONTROL與突變完成的質粒用XbaⅠ與FseⅠ雙酶切，并膠回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶切膠回收結果，條帶大小符合預計（圖5）。連接轉化后挑取4 個單克隆菌落培養過夜，通過菌液PCR檢驗克隆的準確性，引物為P1/P2，全長為417 bp，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，有2個克隆的條帶大小符合預計（圖6）。

將菌液PCR鑒定正確的菌液用質粒提取試劑盒提取質粒，利用提取的質粒，通過擴增引物P1/P2，做質粒PCR，條帶位于400～500 bp之間（圖7），符合預計大小。同時利用XbaⅠ與FseⅠ雙酶切檢測所提取的質粒，條帶符合預計大小（圖8），顯示PGL3-NeuroD-3′UTR突變載體構建成功。

3 討論

糖尿病（diabetes mellitus）是一組由于胰島素分泌不足、胰島素功能障礙或兩者同時存在而導致的代謝性疾病。其特征為慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝紊亂。糖尿病是一種由多種因素導致的疾病，這些因素包括遺傳因素、自身因素（自身免疫）及環境因素。NeuroD-1/Beta-2對靶基因的轉錄激活/抑制作用主要通過和靶基因中的特異性序列結合來實現的。同時，NeuroD-1/Beta-2也能夠與其他靶基因的轉錄因子發生作用，協同調節靶基因的活性狀態，進而影響相關基因的生理功能，調節靶基因的最終活性狀態[7]。前期研究表明NeuroD-1/Beta-2基因發生突變時，對糖尿病的發生有一定的影響，且Beta-2作為一種轉錄因子能夠激活磺脲類受體基因1（SUR-1） [8]。在生物體中，β細胞胰島素的分泌情況受SUR-1的調節，這種調節機理主要是NeuroD-1 能夠和SUR-1的E3元件結合，進而誘導相關的組織發生特異性表達。研究發現MEK-ERK 信號通路在葡萄糖刺激下能夠影響NeuroD-1 的活性，NeuroD-1發生入核，促進了胰島素相關基因的轉錄表達[9]。因此，NeuroD-1基因對研究和治療糖尿病具有重要的意義。

基因突變技術應用很廣泛，這種技術制備的突變體可用于研究基因的調控表達情況、蛋白質的結構與功能[10]。隨著定點突變技術的發展，蛋白質的結構與功能主要通過突變體研究來實現。寡聚核苷酸引物與靶DNA 雜合分子中間的單個堿基的錯配并不影響擴增效率，因此利用引物區域的錯配使PCR 產物定點突變的方法可以導致DNA的定點突變。近年來，產生了一種新型定點突變的PCR方法，該方法是把需要突變的基因克隆到質粒載體上，用2個突變引物同時擴增質粒DNA，用限制性內切酶對模板DNA進行消化，然后轉入大腸桿菌并篩選陽性克隆。由于該方法僅需1次PCR 反應，很大程度地降低了反應時間，所以被稱為快速PCR法，這種新的PCR方法減少了反應中因堿基錯配而造成的非特異突變，提高了目標突變率。

本試驗即根據上述原理，采用一次快速PCR定點突變方法，對NeuroD-3′UTR的多個位點進行定點突變，經PCR檢測及測序鑒定，目標位置突變成功，1854、1855、1856位置的堿基由TTGCACA變成TTCGTAC（圖4），測序結果顯示，沒有出現其他堿基的突變，降低了堿基錯配的概率，提高了突變效率。隨后將突變片段連接到螢光素酶報告載體PGL3-CONTROL上，經PCR和酶切鑒定，成功構建了PGL3-NeuroD-3′UTR突變載體（圖7、圖8），為后續NeuroD基因的研究，以及通過該基因為糖尿病的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Lee J E. Basic helix-loop-helix genes in neural development [J]. Curr Opin Neurobi，1997，7（1）：13-20.

[2]Naya F J . Tissue-specific regulation of the insulin gene by a novel basic helix-loop-helix transcription factor [J]. Genes Dev，1995，9（8）：1009-1019

[3]Suzuki A，Nakauchi H，Taniguchi H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting [J]. Diabetes，2004，53（8）：2143-2152.

[4]Zhou J，Wang X，Pineyro M A，et al . Glucagon-like peptide 1 and exendin-4 convert pancreatic AR42J cells into glucagon-and insulin-producing cells [J]. Diabetes，1999，48（12）：2358-2366.

[5]Cho J H，Tsai M J . The role of BETA2/NeuroD1 in the development of the nervous system [J]. Mol Neurobiol，2004，30（1）：35-47.

[6]高 川，韓維濤，宋云揚，等. 一種改進的快速PCR定點突變技術[J]. 生物技術通報，2006（3）：99-103.

[7]Means A L，Ray K C，Singh A B，et al . Overexpression of heparin-binding EGF-like growth factor in mouse pancreas results in fibrosis and epithelial metaplasia [J]. Gastroenterology，2003，124（4）：1020-1036.

[8]Hirabayashi J，Kasai K. The family of metazoan metal-independent β-galactoside-binding lectins：structure，function and molecular evolution[J]. Glycobiology，1993，3（4）：297-304.

[9]Vacelet J. Etude en microscopie electronique de lassociation entre bacteries et spongiaires du genre Verongia （Dictyoceratida） [J]. Microsc Biol Cell，1975，23（3）：271-288.

[10]Kumar M，Jordan N，Melton D，et al . Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate[J]. Dev Biol，2003，259（1）：109-122.劉 穎，葉生鑫，彭 強，等. 水稻穗長和有效穗數的QTL定位分析[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：86-89.