腺相關病毒介導的狨猴P53基因沉默

石 亮，張 晨，向志光，鄧儀晨，蘇靜芬，劉云波

（1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021；2.北京大學生命科學學院，北京 100871）

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腺相關病毒介導的狨猴P53基因沉默

石 亮1，張 晨2，向志光1，鄧儀晨1，蘇靜芬1，劉云波1

（1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021；2.北京大學生命科學學院，北京 100871）

【摘要】目的 在細胞和整體動物水平，利用RNA干擾技術下調絨猴p53基因表達。方法 對狨猴p53基因做生物信息學分析，針對靶序列設計shRNA干擾序列，構建在腺相關病毒載體上，轉染非洲綠猴腎細胞（cos-7），在細胞水平用熒光定量PCR檢測p53mRNA抑制效果，以Western blot方法檢測p53蛋白水平表達變化；優選shRNA干擾序列，包裝含shRNA干擾序列的8型腺相關病毒，靜脈注射感染狨猴；手術取少量肝臟組織，用Western blot和免疫組化方法檢測p53蛋白水平的變化。結果 細胞水平研究發現2個有效RNA干擾靶點，mRNA干擾效率分別為（82.7±8.1）%和（80.7±7.5）%（P＜0.05）；蛋白表達下調（77.3±11.5）%和（73.7±10.7）%（P＜0.05）；2只絨猴感染病毒后，經活體熒光成像分析可見病毒在肝臟、睪丸、頸部等位置分布，狨猴肝臟P53蛋白經Western blot、免疫組化分析未見明顯變化。結論 本研究在細胞水平實現絨猴P53基因表達下調，但整體動物水平狨猴肝臟P53蛋白表達未發現明顯變化；今后需在感染方式等方面做進一步優化。

【關鍵詞】AAV8；P53；RNA干擾；狨猴

RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，廣泛應用于基因功能研究與基因治療領域。利用RNAi的方法已經成功在嚙齒類動物的受精卵中下調基因的表達，建立相關的動物模型［1］，但是在狨猴上還沒有相應研究。腺相關病毒（adenoassociated virus，AAV）是一種重要的基因載體，主要用于基因治療、基因功能研究、動物模型建立，相對慢病毒、腺病毒等病毒載體有著它獨特的優點，安全性高、免疫原性低、長期表達等［2］?？梢岳肁AV介導RNA干擾實現動物水平基因表達的改變。P53是一種重要的腫瘤抑制基因。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現該基因的突變，他們中的大多數是錯義突變進而減少p53腫瘤抑制活性。研究表明p53除了具有腫瘤抑制功能外，還參與細胞凋亡、細胞周期阻滯、DNA損傷修復、調節機體代謝、參與免疫反應等多種生理過程［3］。相關的研究主要集中在嚙齒類動物，但由于與人親緣性較遠，應用受到許多因素的限制。狨猴是一種很小的非人靈長類動物，其生理學、行為學以及細胞因子激素水平等與人非常相似。因此研究非人靈長類動物基因調控對于基因功能與疾病治療具有重要意義。在細胞水平上的驗證，由于狨猴細胞系較少且轉染效率不高，選用cos-7細胞，設計的干擾靶點序列與非洲綠猴p53基因完全同源［4］。本實驗利用RNAi技術，以AAV為載體，希望在狨猴體內下調p53蛋白，進而研究p53基因及下游相關基因功能，以期建立一種非人靈長類動物的基因調控的策略。

1　材料和方法

1.1實驗動物

狨猴3只，體重分別為345 g、355 g、360 g，年齡分別為2歲9月、3歲1月、3歲3月，全部雄性，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所北方資源中心提供。飼養條件：溫度25℃ ～30℃，濕度45% ～80%，12 h照明/12 h黑暗（8：00～20：00亮燈），單籠飼養，自由飲水，早晚喂食，中午喂食水果。

1.2P53基因shRNA干擾載體構建

根據狨猴p53基因的序列，依照shRNA的設計原則在Life Technology在線設計若干靶點的shRNA序列。將目的片段構建載體質粒PAAV-luciferaseshRNA上，轉化，酶切鑒定，測序。測序引物為U6-F：5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3'。對照組選用不和任何基因同源性的Scramble序列。

1.3熒光定量PCR

提取總的RNA，逆轉錄后進行SYBR-Green法熒光定量 PCR。P53基因所用引物為 F：5'-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3'，R：5'-CTCCGTCA TGTGCTGTGACT-3'預計擴增出220 bp的目的片段，內參基因GAPDH所用引物F：5'-ACATCATCC CTGCCTCTACTGG-3'，R：5'-AGTGGGTGTCGCT GTTGAAGTC-3，擴增產物長度260 bp［5］。PCR反應程序：95℃預變性3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s共 40個循環。同一樣品做三次重復，采用2-△△Ct進行結果分析。

1.4Western Blot

裂解細胞或組織，測定濃度，取相同量蛋白與buffer混勻，沸水煮5 min變性，電泳，轉膜，封閉，一抗4°C孵育過夜，二抗室溫1 h，進行曝光。最后結果用Image J軟件對圖像進行灰度分析。

1.5AAV8的包裝

AAV載體質粒、包裝質粒和輔助質粒（8型）三質粒法共轉染293T細胞。收集細胞和培養上清液，離心棄除雜質，過濾除菌，濃縮，純化，QPCR測定病毒滴度，-80℃保存備用。

1.6病毒注射動物

一只作為對照組，注射含有scramble序列的對照病毒。兩只作為實驗組，注射含有shRNA1的病毒。按照其體重以2×1012vg/kg后肢靜脈注射［6］。在注射后的1 d、1周、2周、3周進行活體熒光成像檢測，監測病毒的侵嗜情況。四周后，鹽酸氯胺酮（3 mg/kg）肌內注射麻醉動物，手術取米粒般大小的肝臟組織。Western blot和免疫組化方法檢測肝臟p53蛋白水平的變化情況。

1.7免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育 10 min，PBS浸泡5 min，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液微波爐修復，5% 山羊血清封閉 30 min，滴加一抗（p53抗體，1∶100）37℃孵育2 h，PBS沖洗，先后滴加適量二抗工作液I和II，PBS沖洗。DAB顯色，自來水沖洗，復染，脫水，透明，封片。

1.8統計學方法

用SPSS 16.0統計軟件進行分析，P＜0.05表示差異顯著性。

2　結果

2.1腺相關病毒shRNA干擾載體構建

根據狨猴p53基因序列信息和shRNA干擾序列設計基本原則，設計出兩個有效靶點。靶點序列與我們在細胞水平驗證的非洲綠猴p53基因完全同源。具體序列信息和對應狨猴p53基因的位置見表1。

圖1　質粒轉染48 h后熒光表達圖（×40，標尺=50 μm）Note.A：Under an ordinary microscope.B：Under a fluorescent microscope.Fig.1 The fluorescence image of plasmid expression at 48 hours after transfection.（×40，Bar=50 μm）

2.2細胞水平p53基因沉默效率檢測

為驗證設計的靶點序列的有效性，轉染干擾序列的質粒48 h后，對照質粒中含有GFP報告基因，在熒光顯微鏡下驗證轉染效率，證明構建的含干擾序列的質粒成功進入細胞，可以進行后續實驗，見圖1。

熒光定量PCR結果采用2-△△Ct進行分析。如圖2所示，對應的2個靶點序列p53基因mRNA表達量均顯著下降（P＜0.05）。其中shRNA1 mRNA水平沉默效率（82.7±8.1）%，shRNA2 mRNA水平沉默效率為（80.7±7.5）%。兩個靶點對p53基因在mRNA水平均有明顯的沉默效率。

Western blot結果用Image J軟件對圖像進行灰度分析。如圖3所示，對應的2個靶點序列p53蛋白表達量均顯著下降（P＜0.05）。其中shRNA1蛋白水平沉默效率（77.3±11.5）%，shRNA2蛋白水平沉默效率為（73.7±10.7）%。兩個靶點對p53蛋白有明顯的降低，蛋白水平和mRNA水平檢測結果基本保持一致。

2.3活體熒光成像

活體熒光成像技術檢測病毒在狨猴體內的侵嗜情況。見圖4，上下兩只實驗組動物都注射含有PAAV-luciferase-shRNA病毒?？梢园l現注射病毒后1 d睪丸處就有少量熒光，1周后頸部位置也出現熒光，3周后可以看見后肢大腿、頸部、睪丸、腹部等都有不同程度的熒光。證明病毒進入對應位置，相應熒光位置有高效的侵嗜性，可以推測肝臟有病毒的侵嗜。

圖2　P53基因mRNA表達Note.*compared with the control group（P＜0.05）Fig.2 The mRNA expression of P53 gene

2.4肝臟組織p53基因沉默效率檢測

免疫組化方法檢測實驗組與對照組p53蛋白的變化，如圖5所示，p53蛋白在正常的肝臟組織中表達很低，只有少量肝臟細胞有核染色，實驗組和對照組沒有表現出明顯差異。采用Western blot方法分別檢測實驗組和對照組中p53蛋白水平的變化。如圖6所示，通過Image J軟件對圖像進行灰度分析，實驗組 p53蛋白水平沉默效率為（7.3± 8.9）%，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）不能證明有蛋白水平變化。

圖3　P53蛋白表達Note.A：Western blot image.B：The results of gray scale analysis.*Compared with the control group（P＜0.05）.Fig.3 The expression of p53 protein

3　討論

狨猴是最小型的實驗靈長類動物，其體型小、繁殖快、遺傳進化及生理生化方面與人類相近，是人類疾病研究的理想實驗動物之一，常用于神經科學、免疫學、藥物毒理、腫瘤等方面研究［7］。目前利用靈長類動物建立穩定的基因調控方法還面臨巨大的困難，如基因敲除方法面臨陽性打靶率低和移植成活率不高以及缺陷基因造成胚胎致死。本研究希望利用RNAi技術在狨猴體內實現p53基因表達的下調。在細胞水平的驗證，由于狨猴的細胞系較少并且體外轉染效率較低，所以選用cos-7細胞，設計的靶點序列在狨猴和非洲綠猴都完全同源，都位于p53基因的開放閱讀框中。

圖4　注射病毒后活體熒光圖像（標尺=500 μm）Note.Fluorescent colors represent the degree of invaded viruses：red＞yellow＞green，the deeper color means a higher degree virus invasion.（Bar=50 μm）Fig.4 In vivo fluorescence imaging after injection of virus

AAV由于其安全性好、宿主細胞范圍廣（分裂和非分裂細胞）、免疫源性低、在體內表達外源基因時間長等特點［8］，被視為最有前途的基因轉移載體之一。目前AAV有幾十種不同的血清型，各個血清型對組織細胞有不同侵嗜性。AAV-8對肝臟、肌肉等有很強的親和性，活體熒光成像的結果與前期研究基本相同［9］。肝臟部位只有少量熒光，可能由于熒光透射性較弱或者病毒注射量偏少。手術取少量肝臟組織，不會造成動物的死亡而進行后續研究。在肝臟中沒有檢測到p53蛋白的變化，后續需要在感染方式與序列靶點做進一步優化，以及處死動物檢測睪丸、大腿肌肉、頸部等位置p53蛋白是否變化。

圖5　狨猴肝臟組織p53蛋白免疫組化圖（×40，標尺=100 μm）Note.The arrows indicate P53 protein immunohistochemical stainingFig.5 The p53 protein in the marmoset liver. （×40，Bar=100 μm）

圖6　注射病毒后狨猴肝臟p53蛋白表達Note.A：Western blot image.B：The results of gray scale analysis. #Compared with the control group（P＞0.05）Fig.6 The expression of liver p53 protein after injection of virus

綜上所述，本研究以RNA干擾技術為基礎，利用8型腺相關病毒作為載體，在細胞水平實現了p53蛋白的降低，在狨猴動物水平的研究還需優化條件與完善策略。

致謝：感謝中國醫學科學院醫學實驗動物研究所檢測中心佟巍老師，劉先菊老師提供指導，感謝中國醫學科學院醫學實驗動物所北方資源中心尚海全、肖沖、馬喜山等老師在實驗操作的幫助。

參考文獻：

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［4］ 蘇靜芬，張晨，李雨函，等.恒河猴p53基因沉默靶點在細胞水平的驗證［J］.中國比較醫學雜志，2014，24（08）：7 -10.

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〔修回日期〕2016-02-25

Adeno-associated virus mediated p53 gene silence in marmosets

SHI Liang1，ZHANG Chen2，XIANG Zhi-guang1，DENG Yi-chen1，SU Jing-fen1，LIU Yun-bo1
（Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China；2.College of Life Science，Peking University，Beijing 100871）

【Abstract】Objective To decrease the p53 gene expression at cellular and animal levels in marmoset using RNA interference technique.Methods The shRNA interference sequences were designed and inserted into the adeno-associated virus vector plasmid after bioinformatics analysis.The plasmids were transfected into African green monkey kidney cos-7 cells.The suppression of p53 mRNA was detected by real-time PCR，and the changes of p53 protein expression were detected by Western bolt.The adeno-associated virus-8 was injected through the hind leg vein.The changes of p53 protein expression in the liver tissue was detected by Western blot and immunohistochemistry.Results We screened two RNA interference effective arget sequences.The expression of p53 mRNA was suppressed（82.7±8.1）%and（80.7± 7.5）%，respectively（P＜0.05），and the expression of p53 protein was decreased（77.3±11.5）%and（73.7± 10.7）%，respectively（P＜0.05）.The two marmosets after virus infection showed that there were virus distributions in the liver，testes，and neck detected by in vivo fluorescence imaging.The expression of p53 in the marmoset liver was detected by western blot，immunohistochemistry analysis showing no obvious changes.Conclusions In the present study，the decrease of P53 gene expression at cellular level is achieved，however，the liver P53 protein in the marmoset liver is not significantly changes.Further optimization of the way of infection is needed in the future.

【Key words】AAV8 virus；p53；RNA interference；Marmoset

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0053-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.009

［基金項目］國家科技支撐計劃（No.2014BAI03B01）。

［作者簡介］石亮（1988-），男，碩士研究生，研究方向：實驗動物學。

［通訊作者］劉云波，男，教授，研究方向：實驗動物學。E-mail：yunboliu@126.com。