CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性研究

彭靈娟， 叢 喆，薛 婧， 宋銘晶， 魏 強(qiáng)

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

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CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性研究

彭靈娟， 叢 喆，薛 婧， 宋銘晶， 魏 強(qiáng)

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

【摘要】目的 研究SIV在感染CEMx174細(xì)胞過程中，SAMHD1在基因和蛋白水平的變化與病毒水平之間的相關(guān)性。方法 SIVmac239病毒感染CEMx174細(xì)胞后，每天收集上清和細(xì)胞，應(yīng)用TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法，檢測細(xì)胞內(nèi)SAMHD1 mRNA的相對表達(dá)量的變化；用Western blot檢測SAMHD1蛋白與SIVmac239 P27蛋白表達(dá)量的變化，并分析其相關(guān)性。結(jié)果 CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239后，細(xì)胞中的SAMHD1 mRNA基于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量逐漸增加，前3 d分別增加了14%，16%，42%，隨后開始迅速增加，第4天達(dá)到了200%，第6天更是達(dá)到了890%；細(xì)胞中SAMHD1蛋白的表達(dá)量在感染后第1、2天時變化不大，隨后逐漸降低，到第5、6天時，幾乎檢測不到，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。結(jié)論 CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239后，SAMHD1基因表達(dá)上調(diào)，與上清中病毒載量水平正相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)SAMHD1蛋白水平與SIVmac239 P27蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】SAMHD1；HIV-1；SIV；實時熒光定量RT-PCR

SAMHD1是近年來新發(fā)現(xiàn)的抗艾滋病毒（HIV）的天然蛋白質(zhì)分子，早期研究表明，SAMHD1蛋白作為限制因子，在髓系樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和靜息CD4+T細(xì)胞中，發(fā)揮dNTPase功能，通過降低胞內(nèi)dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期復(fù)制［1］，但在感染的活化CD4+T細(xì)胞中，卻不能發(fā)揮抗病毒作用［2］。本研究使用SIV病毒感染CEMx174細(xì)胞，研究在活化的T細(xì)胞感染過程中，SAMHD1在基因和蛋白水平的變化與病毒水平之間的相關(guān)性，以期為SAMHD1在活化細(xì)胞中的抗病毒作用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和病毒：CEMx174細(xì)胞：由T淋巴細(xì)胞干細(xì)胞系CEMR.3和B淋巴細(xì)胞干細(xì)胞系721.174雜交而成的細(xì)胞系，病毒感染該種細(xì)胞后能表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞病變的融合現(xiàn)象。毒株：SIVmac239，由本實驗室保存。CEMx174細(xì)胞滴定病毒滴度為4× 105TCID50/mL。

1.1.2主要試劑盒：QIAamp RNA Blood Mini Kit購自Qiagen公司（Cat No.52304），TaqMan RNA-to-CT-1-Step Kit購自Applied Biosystems公司（Cat No. 4392938）。

1.2引物和探針

利用 Primer Express 3.0軟件設(shè)計 SAMHD1 mRNA（NCBI：NM-001271642）和內(nèi)參GAPDH的實時熒光定量RT-PCR引物和MGB探針，Invitrogen公司合成（表1）。反應(yīng)體系總體積20 μL，內(nèi)含：引物F和R各0.5 μL、TaqMan?RT-PCR Mix（2×）緩沖液10 μL、TaqMan?RT Enzyme Mix（40×）0.3 μL、probe 0.3 μL、DEPC-H2O 3.4 μL、5 μL的模板RNA。反應(yīng)條件為48℃ 30 min、95℃ 10 min、94℃15 s（×40）、60℃ 60 s（×40）。

1.3實驗方法

1.3.1細(xì)胞感染：在3 mL狀態(tài)良好的3×107個CEMx174細(xì)胞懸液中，加入 SIVmac239病毒原液100 μL，37℃孵育2 h，補(bǔ)足 RPMI1640生長液至30 mL。

1.3.2樣本收集和處理：在 CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239病毒后的第0、1、2、3、4、5、6天，分別取4 mL的細(xì)胞懸液，離心。提取上清液中病毒RNA，real-time RT-PCR檢測病毒載量水平變化［3］。

離心后的細(xì)胞沉淀，一半用來提取細(xì)胞RNA，在mRNA水平檢測SAMHD1的表達(dá)量的變化，即采用熒光定量 RT-PCR檢測獲得的 CT值，利用△△CT法，即2-△△CT計算各個時間點(diǎn)的樣本基于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量［4］。另一半細(xì)胞裂解，提取蛋白，利用Western blot檢測SAMHD1蛋白的表達(dá)量和病毒的p27蛋白的表達(dá)量的變化［5］。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞病變

在CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239病毒后細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變，會出現(xiàn)明顯細(xì)胞融合。在感染后第3天就可看到早期融合細(xì)胞的產(chǎn)生（圖1B），在第6天，鏡下觀察有大量的融合細(xì)胞產(chǎn)生（圖1C）。

2.2SIVmac239感染 CEMx174細(xì)胞中的SAMHD1 mRNA相對表達(dá)量與病毒載量之間的相關(guān)性分析

表1　Real-time RT-PCR測定的PCR擴(kuò)增引物和探針Tab.1 Primers and probes used for the real-time RT-PCR detection

SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞后，感染上清液中的病毒RNA水平逐漸升高，從第1天的1×104copies/mL左右，到第6天增長到1×108copies/mL（圖2A）。CEMx174細(xì)胞中的SAMHD1 mRNA基于參內(nèi)基因GAPDH的相對表達(dá)量，在前3 d分別比第0天增加了14%，16%，42%，呈現(xiàn)緩慢增加趨勢。隨后開始迅速增加，第4天達(dá)到了200%，第6天更是達(dá)到了890%（圖2B）。

SAMHD1 mRNA相對表達(dá)量與培養(yǎng)上清中病毒RNA載量呈正相關(guān)，R=0.6673，P＜0.01；（圖2C）。

2.3SIVmac239感染 CEMx174細(xì)胞中的SAMHD1和P27蛋白表達(dá)水平變化

CEMx174細(xì)胞感染 SIVmac239后，細(xì)胞中SAMHD1蛋白的表達(dá)量在第1、2天時變化不大，隨后逐漸降低，到第5、6天時，幾乎檢測不到（圖3A）。在整個感染過程中，SAMHD1蛋白的表達(dá)量總體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。而細(xì)胞中SIV病毒P27蛋白的含量卻呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢。在感染后的第2天已經(jīng)可以檢測到P27蛋白，之后4 d表達(dá)量持續(xù)增加。SIVmac239病毒的P27蛋白與SAMHD1蛋白的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，R=-0.8957，P＜0.0001。

圖1　SIVmac239病毒感染CEMx174細(xì)胞后產(chǎn)生細(xì)胞病變Note.：The site of cell fusion bulbs；A：Normal CEMx174 cells；B：The CPE of CEMx174 cells 3 days post infection with SIVmac239；C：The CPE of CEMx174 cells 6 days post infection with SIVmac239Fig.1 The cytopathic effect（CPE）of CEMx174 cells infected with SIVmac239

圖2　SIVmac239感染CEMx174細(xì)胞中SAMHD1 mRNA相對表達(dá)量和上清中病毒載量的變化及兩者之間相關(guān)性分析Note.A：The changes of viral loads；B：The change of SAMHD1 mRNA relative expression；C：The correlation between viral loads and SAMHD1 mRNA relative expressionFig.2 The relationship between the relative expression of SAMHD1 mRNA and the viral RNA level in SIVmac239-infected CEMx174 cells

3　討論

早期研究表明，SAMHD1做為天然抗艾滋病毒的蛋白質(zhì)分子，在髓系樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD4+靜息T細(xì)胞中，通過降低胞內(nèi)dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期復(fù)制［6］，低的 dNTP水平被認(rèn)為是SAMHD1蛋白抑制病毒復(fù)制的重要指標(biāo)。然而，WY Gao等人［7，8］發(fā)現(xiàn)活化的CD4+T細(xì)胞感染后，dNTP含量沒有明顯下降，且顯著高于靜息細(xì)胞中dNTP水平，因此認(rèn)為在活化的T細(xì)胞中，SAMHD1蛋白不具有抗病毒作用。然而最新研究表明，SAMHD1蛋白除了通過降解dNTP來發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用，還能發(fā)揮 RNase的功能來抗病毒［7，9，10］。因此，在活化的CD4+T細(xì)胞中，dNTP的含量比較高，并不能說明SAMHD1蛋白就沒有發(fā)揮抗病毒功能。

CEMx174細(xì)胞是由 T淋巴細(xì)胞干細(xì)胞系CEMR.3和B淋巴細(xì)胞干細(xì)胞系721.174雜交而成的細(xì)胞系，被SIV病毒感染后能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。本研究中，CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239病毒后，隨著培養(yǎng)上清液中的病毒載量快速升高，細(xì)胞中病毒 P27蛋白的表達(dá)水平也增加迅速。而SAMHD1的mRNA相對表達(dá)量在4 d后顯著增加，與病毒載量呈正相關(guān)，可見細(xì)胞在感染過程中，上調(diào)了SAMHD1基因的表達(dá)；與之相反的是細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)量從4 d后逐漸下降，第5～6天時基本檢測不到，與SIV病毒P27蛋白量呈顯著負(fù)相關(guān)。

前期研究表明，一些慢病毒如HIV-2和SIV，可以編碼Vpx蛋白來抑制細(xì)胞內(nèi)抗病毒復(fù)制的蛋白。HIV-2和一些 SIV編碼的 Vpx蛋白，通過加載SAMHD1蛋白到CRL4DCAF1E3泛素連接酶上誘導(dǎo)SAMHD1蛋白酶體降解，通過降解SAMHD1蛋白可以促進(jìn)HIV-1病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的積累，同時也明顯促進(jìn)人的單核細(xì)胞、及其來源的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的HIV-1的感染［11］。在其他SAMHD1限制感染的細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Vpx也能發(fā)揮降解SAMHD1功能，促進(jìn)這些細(xì)胞的感染［12］。本研究使用的CEMx174細(xì)胞中的SAMHD1蛋白表達(dá)量的降低，可能與SIVmac239病毒產(chǎn)生的Vpx蛋白降解SAMHD1蛋白有關(guān)。SAMHD1蛋白在活化的細(xì)胞中是否發(fā)揮抗病毒的功能有待進(jìn)一步證實，但本研究中發(fā)現(xiàn)感染SIV的CEMx174細(xì)胞SAMHD1基因上調(diào)，蛋白含量下降，說明SAMHD1在感染過程中是起作用的。廣譜表達(dá)的SAMHD1蛋白可能具有廣譜的抗病毒作用，不只是在靜息CD4+T細(xì)胞或髓系細(xì)胞中發(fā)揮作用。

圖3　SIVmac239病毒感染CEMx174細(xì)胞中的SAMHD1、P27蛋白表達(dá)量檢測及相關(guān)性分析Note.A：Western blot showing expression of SIV P27 and SAMHD1 in SIV-infected CEMx174 cells；B：The relative expression of SIV P27 and SAMHD1 in SIV-infected CEMx174 cells；C：The correlation between SAMHD1 protein and P27 proteinFig.3 The correlation between the expression of SAMHD1 protein and the P27 protein in SIVmac239-infected CEMx174 cells

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〔修回日期〕2016-02-01

Relationship between the SAMHD1 protein expression and the SIVmac239 viral level in CEMx174 cells

PENG Ling-juan，CONG Zhe，XUE Jing，SONG Ming-jing，WEI Qiang
（Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College（PUMC）&Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）；Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

【Abstract】Objective To explore the relationship between protein levels of SAMHD1 expression with viral load of SIV in the SIVmac239-infected CEMx174 cells.Methods CEMx174 cells were infected with SIVmac239，and the cells and supernatant were collected daily for analysis.The viral loads and the SAMHD1 mRNA level were detected by real-time RT-PCR and the level of P27 and SAMHD1 proteins were detected by Western blotting.Results The mRNA level of intracellular SAMHD1 gene was increased and SAMHD1 protein decreased gradually when CEMx174 cells were infected with SIVmac239.Conclusions There is a positive correlation between viral load in the supernatant and the mRNA level of SAMHD1，and a negative correlation between the increase of P27 protein and the decrease of SAMHD1 protein in the SIVmac239-infected CEMx174 cells.

【Key words】SAMHD1；HIV-1；SIV；Real-time RT-PCR

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0041-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.007

［基金項目］國家十二五科技重大專項課題（2013ZX10004608-003和2012ZX10004501-001）。

［作者簡介］彭靈娟（1991-），女，碩士研究生，專業(yè)：動物學(xué)，從事實驗動物病毒學(xué)研究工作。

［通訊作者］魏強(qiáng)（1964-），男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：實驗動物病毒學(xué)。E-mail：weiqiang0430@cnilas.org。