藏雞磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域 1(PID1)的克隆及組織表達(dá)譜研究

聶曉慶，林亞秋，徐亞歐，趙燕英，呂　明，左璐璐，張小玉，李　想

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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藏雞磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域 1(PID1)的克隆及組織表達(dá)譜研究

聶曉慶，林亞秋*，徐亞歐*，趙燕英，呂明，左璐璐，張小玉，李想

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

本研究旨在闡明藏雞PID1基因在不同組織與時(shí)序表達(dá)譜，并研究PID1基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量(IMF)的關(guān)系。利用RT-PCR技術(shù)克隆藏雞PID1基因，用相關(guān)軟件預(yù)測(cè)PID1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，采用熒光定量PCR研究PID1基因在藏雞不同組織、不同日齡的表達(dá)譜，并分析其與IMF的相關(guān)性。結(jié)果顯示，克隆得到藏雞PID1基因序列長(zhǎng)度為654 bp(GenBank 登錄號(hào)：KT000001)，共編碼217個(gè)氨基酸，是具有PTB結(jié)構(gòu)域的不穩(wěn)定親水酸性蛋白質(zhì)；有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、7種保守特異性蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)、3個(gè)二硫鍵；預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占26.73%，β折疊占20.74%，無(wú)規(guī)則卷曲占52.53%，屬于混合型蛋白且主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。熒光定量PCR結(jié)果顯示，PID1基因在藏雞的不同組織中均存在表達(dá)，且在脂肪組織中表達(dá)水平最高(P<0.01)；時(shí)序表達(dá)譜結(jié)果顯示，PID1基因在1日齡公藏雞胸肌中表達(dá)水平最高。在210 日齡的公雞腿肌的表達(dá)量極顯著高于其他日齡的表達(dá)水平(P<0.01)，在119 日齡母雞腿肌的表達(dá)量極顯著高于其他日齡表達(dá)水平(P<0.01)。在119和154 日齡公雞脂肪組織中表達(dá)水平較高，在210 日齡母雞脂肪組織中的表達(dá)量最高(P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PID1 mRNA的表達(dá)量與藏雞胸肌的IMF含量存在顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果提示，PID1基因可能是影響藏雞IMF沉積的候選基因。

藏雞；磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域 1；克隆；組織表達(dá)；時(shí)序表達(dá)；肌內(nèi)脂肪

藏雞是中國(guó)青藏高原特有的雞種，屬蛋肉兼用型，主產(chǎn)于中國(guó)青藏高原的西藏、四川的甘孜、阿壩等地[1]。其體貌與習(xí)性與家雞的祖先原雞極為相似，具有肉質(zhì)鮮美、高蛋白低脂肪、耐粗放、抗病力強(qiáng)、體型輕小等特點(diǎn)[2]，備受人們推崇。因此闡明該基因優(yōu)良的肉質(zhì)性狀具有重要的理論與實(shí)際意義。動(dòng)物脂肪沉積由內(nèi)因和外因共同決定，但主要受遺傳因素制約，由多基因控制，過(guò)量的脂肪沉積影響動(dòng)物產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)。適量的肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量可調(diào)節(jié)肉的嫩度、風(fēng)味與多汁性[3]。

磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域 1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1)是以抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)從肥胖患者腹膜后脂肪組織中篩選差異表達(dá)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的新基因[4-5]，并且研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體內(nèi)游離的脂肪酸可增加PID1基因的表達(dá)，作為信號(hào)分子通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的生成和分化[6-7]。但目前關(guān)于PID1多集中于人類肥胖病的研究[8-9]及治療[10]等方面，在畜禽上研究尚不深入，且有研究表明，PID1基因與肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)[11]，并發(fā)現(xiàn)PID1基因過(guò)表達(dá)能增加與肉質(zhì)性狀相關(guān)基因PGC-lα和UCP的表達(dá)[12]。但關(guān)于該基因在藏雞方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，其是否與藏雞IMF沉積有關(guān)尚不清楚。因此本研究旨在克隆得到藏雞PID1基因序列，并闡明該基因在不同組織和時(shí)期的mRNA表達(dá)水平，并與IMF含量進(jìn)行相關(guān)性分析，為研究PID1基因?qū)Σ仉u肉質(zhì)性狀的作用提供重要數(shù)據(jù)，并為藏雞種質(zhì)資源的保護(hù)及品種的培育提供新思路。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用1、81、119、154和210日齡來(lái)自成都益生康健農(nóng)業(yè)有限公司藏雞養(yǎng)殖基地的健康藏雞，該基地位于四川省彭州市新興鎮(zhèn)獅山村老虎崖，屬于龍門山脈的高山地區(qū)。試驗(yàn)選擇采樣時(shí)間點(diǎn)主要根據(jù)優(yōu)質(zhì)肉雞和本地雞出欄時(shí)間及本實(shí)驗(yàn)室前期摸索所設(shè)定。在屠宰之前每組禁食12 h，然后通過(guò)放血法屠宰，屠宰后迅速取其右側(cè)胸肌、腿肌和皮下脂肪組織；并同時(shí)采集154日齡公、母雞的心、肝、脾、肺、腎、腦、胸肌、腿肌及皮下脂肪等組織。所有樣品用錫箔紙包好迅速冷凍于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2生化試劑

Trizol(Invitrogen)、pMD19-T載體及iQTM SYBR?Green Supermix提取試劑購(gòu)自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)購(gòu)自Themro公司；Taq酶及DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1藏雞PID1基因克隆用Trizol法提取藏雞脂肪組織總RNA，溶解于RNAase-free水中。用BioSpec-nano檢測(cè)其濃度等符合后續(xù)試驗(yàn)要求后對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)GenBank中登錄的原雞PID1基因序列(NM_001178144)，用Premier5.0設(shè)計(jì)克隆引物[13](表1)，送上海生物工程股份有限公司合成。克隆擴(kuò)增體系共25 μL：ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，Taq聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，58℃ 退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)后純化回收。采用TA克隆的方法，將純化后的產(chǎn)物與pMD19T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用菌落PCR鑒定后，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆，送上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

表1引物信息

Table 1The primer information

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃(產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp)Annealingtemperature(Productslength)用途PurposePID1F:ATGTGGCAGCCGGCCACGGAGR:TCAGCCATCATCAGATTCAAAT58(654)PCRamplificationPID1F:GAAGAAGCATACACTTGCCAGGR:GACTGTTGCCTCGCCTTTGA66(112)qRT-PCRGAPDHF:CTGCCCAGAACATCATCCCAR:CGGCAGGTCAGGTCAACAAC62(139)qRT-PCR

F.正義鏈引物；R.反義鏈引物。GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶

F.Sense primer；R.Antisense primer.GAPDH.Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

1.3.2序列分析通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)；將獲得的cDNA序列用NCBI網(wǎng)站上BLAST軟件進(jìn)行同源比對(duì)，用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)。采用MEGA5.0和clustalx1.83構(gòu)建進(jìn)化樹。1.3.3PID1蛋白分析通過(guò)ProtParam在線分析編碼蛋白的理化性質(zhì)；采用PortScale進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)；采用NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0、NetPhosK 1.0 、SignalP 4.1 Server分析預(yù)測(cè)PID1蛋白磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、保守特異性蛋白激酶作用位點(diǎn)以及信號(hào)肽；NCBI在線分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)該蛋白的結(jié)構(gòu)域；PredictProtein、PHYRE2 Server分別預(yù)測(cè)PID1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)；DiANNA 1.1web server對(duì)PID1蛋白的二硫鍵進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.4藏雞PID1基因的組織表達(dá)采用Trizol法提取藏雞各個(gè)組織樣的總RNA(公母各5只)。根據(jù)克隆所得到的PID1基因序列，設(shè)計(jì)特異檢測(cè)引物，選取 3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物(表1)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PID1在心、肝、脾、肺、腎、腦、胸肌、腿肌和脂肪組織中的相對(duì)表達(dá)情況。反應(yīng)體系為20 μL：SYBRGreen10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，66℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s，39個(gè)循環(huán)；每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算熒光定量結(jié)果[14]。

1.3.5藏雞PID1基因的時(shí)序表達(dá)采用Trizol法提取藏雞各個(gè)時(shí)期胸肌、腿肌和脂肪組織樣的總RNA(每個(gè)階段公母各8只，共240個(gè)樣品)。以GAPDH為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物(表1)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PID1的相對(duì)表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。用2-ΔΔCt法計(jì)算熒光定量結(jié)果[14]。

1.3.6藏雞肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定與數(shù)據(jù)分析利用索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)測(cè)定公藏雞與母藏雞在81～210日齡胸肌與腿肌肌內(nèi)脂肪含量(每個(gè)階段公母各12只，共192個(gè)樣品)，數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析。

2　結(jié)　果

2.1藏雞PID1基因克隆鑒定

通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，得到克隆產(chǎn)物條帶與預(yù)期目的片段大小相符。送交上海生物工程有限公司測(cè)序獲得654 bp的序列，并提交NCBI(登錄號(hào)：KT000001)。

M.DL-2000 marker；1.PID1圖1　藏雞PID1 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　Amplification of PID1 gene in Tibetan chicken

2.2生物信息學(xué)分析

2.2.1PID1基因序列分析克隆得到的藏雞PID1基因序列長(zhǎng)為654 bp，編碼217個(gè)氨基酸(圖2)，其中Leu殘基(9.2%)所占頻率最高。且?guī)ж?fù)電荷的氨基殘基(Asp+Glu=28)多于帶正電荷的氨基酸殘(Arg+Lys=25)。在DNAMAN上進(jìn)行藏雞、原雞的核苷酸與氨基酸序列CDS區(qū)的比對(duì)，結(jié)果顯示，分別在T229C、A234G、A270G、A353G這4個(gè)位點(diǎn)存在核苷酸突變。其中229 bp處的T/C突變導(dǎo)致Cys半胱氨酸(酸性)變?yōu)锳rg精氨酸(堿性正電荷)，353 bp處的A/G突變導(dǎo)致Lys賴氨酸(堿性)變?yōu)锳rg精氨酸(堿性)，突變位于預(yù)測(cè)的PTB結(jié)構(gòu)域內(nèi)(圖2)。其余位點(diǎn)的突變不引起氨基酸的改變。

2.2.2PID1蛋白理化性質(zhì)及修飾PID1蛋白分子式為C1100H1727N303O323S15，總原子數(shù)3 474，分子質(zhì)量為24.92 ku，等電點(diǎn)為6.49。氨基酸序列N末端為M，預(yù)測(cè)的半衰期為30 h。消光系數(shù)(M-1cm-1γ=280 nm)為29 825，不穩(wěn)定指數(shù)為42.62，說(shuō)明該蛋白屬于不穩(wěn)定酸性蛋白質(zhì)。藏雞PID1蛋白存在4個(gè)主要的疏水區(qū)：第42～47位、70～75位、99～109位和129～135位，除此之外PID1的大部分氨基酸序列被親水區(qū)占據(jù)。其中最高值為第146位I(1.222)，最低值為第198位R(-2.20)從整體來(lái)看，親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中。因此，PID1蛋白表現(xiàn)出親水性的特征，親水性總平均值-0.393，脂肪族系數(shù)75.99。分析預(yù)測(cè)PID1蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)共14個(gè)，分別為Ser159、Ser171、Ser192、Ser195、Ser203、Ser204、Ser205、Ser209、Thr24、Thr56、Thr78、Thr122、Tyr97、Tyr160；O-糖基化潛在位點(diǎn)4個(gè)，分別位于第14、61、203、204位點(diǎn)；在第202位點(diǎn)有潛在的N-糖基化位點(diǎn)1個(gè)；保守特異性蛋白激酶作用位點(diǎn)最強(qiáng)在Ser192殘基處(P=0.82)且無(wú)信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)PID1蛋白有3個(gè)二硫鍵，分別位于Cys44和Cys58、Cys77和Cys169、Cys136和Cys164。PID1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

PID1蛋白的結(jié)構(gòu)中，α螺旋占26.73%，β折疊占20.74%，無(wú)規(guī)則卷曲占52.53%。由此可知，PID1屬于混合型蛋白，且主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。蛋白與蛋白共存在10個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，分別位于1～2、28～29、54、88、94～95、156、158、160～161、163、168位點(diǎn)。

2.3PID1基因同源性分析

將克隆得到的藏雞PID1核苷酸序列、氨基酸序列與原雞等物種在NCBI上進(jìn)行同源性分析(表2)，并用MEGA5.0和clustalx1.83構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖4可知，藏雞與原雞處于同一進(jìn)化枝，兩者親緣關(guān)系最近；虎皮鸚鵡、火雞與綠頭鴨處于一枝；哺乳動(dòng)物人、鼠、牛、羊等處于一枝。

表2藏雞PID1基因與其他已知物種的核苷酸、氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Table 2Comparison of amino acid sequence and nucleotide sequence ofPID1 gene in Tibetan chicken and the other species

物種Species核苷酸同源性/%Nucleotide登錄號(hào)GenBank氨基酸同源性/%Aminoacid登錄號(hào)GenBank原雞Gallusgallus99NM_001178144.199NP_001171615.1火雞Meleagrisgallopavo98XM_010716414.1100XP_010714716.1綠頭鴨Anasplatyrhynchos97XM_005010880.197XM_005010880.1虎皮鸚鵡Melopsittacusundulatus96XM_005147041.199XP_005147098.1揚(yáng)子鱷Alligatorsinensis92XM_006033833.197XP_006033894.1野豬Susscrofa85NM_001173520.194NP_001166991.1綿羊Ovisaries84XM_012156503.193XP_004005036.1野牛Bisonbisonbison84XM_010837023.193XP_010835325.1人Homosapiens83NM_001100818.194NP_001094288.1小家鼠Musmusculus82NM_001003948.292NP_001003948.2

陰影部分為預(yù)測(cè)的藏雞PTB結(jié)構(gòu)域(T56～K194)；加粗斜體部分為突變堿基及氨基酸The shaded indicate the predicted PTB domain(T56-K194) of Tibetan chicken；Bold and italic characters indicate the mutation bases or amino acids圖2　PID1基因CDS區(qū)藏雞與原雞的同源性分析Fig.2　Alignment of Tibetan chicken(upper line)and Gallus gallus(lower line)

圖3　PID1蛋白預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)合位點(diǎn)Fig.3　Predicted secondary structure and protein binding sites of PID1 protein

圖4　藏雞PID1氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4　The amino acid phylogenetic tree of PID1 of Tibetan chicken

2.4藏雞PID1基因表達(dá)分析

2.4.1不同組織的表達(dá)分析以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR檢測(cè)PID1基因在藏雞154日齡不同組織中的表達(dá)情況。以脾組織為對(duì)照，結(jié)果顯示(圖5)，PID1基因在公藏雞和母藏雞的9個(gè)組織中均存在表達(dá)，并且均在脂肪組織中表達(dá)最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)，在脾和肺中亦存在較高水平的表達(dá)，均極顯著或者顯著高于其他各個(gè)組織。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different superscript lowercase and capital letters indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01)，respectively圖5　PID1基因在藏雞不同組織相對(duì)表達(dá)量Fig.5　Relative expression of PID1 mRNA in different tissues of Tibetan chicken

2.4.2不同日齡的表達(dá)分析PID1基因在不同日齡藏雞胸肌、腿肌和脂肪組織的表達(dá)變化見(jiàn)圖6和圖7，均以1日齡的表達(dá)水平作為對(duì)照。由圖6可知，在公藏雞胸肌1 日齡的表達(dá)量極顯著高于81、119和154 日齡的表達(dá)水平(P<0.01)，并且210日齡極顯著高于81日齡的表達(dá)水平(P<0.01)；210 日齡的公藏雞腿肌的表達(dá)量極顯著高于其他日齡的表達(dá)水平(P<0.01)，119日齡的表達(dá)極顯著高于1、81、154日齡的表達(dá)水平(P<0.01)；在119 和154 日齡公藏雞脂肪組織中表達(dá)水平較高，極顯著高于1 日齡的表達(dá)水平(P<0.01)，并且210日齡的表達(dá)水平顯著高于1日齡的表達(dá)水平(P<0.05)。

由圖7可知，PID1基因在母藏雞胸肌1 日齡的表達(dá)量極顯著高于其他日齡的表達(dá)水平(P<0.01)；母藏雞腿肌119 日齡的表達(dá)量極顯著高于其他日齡表達(dá)水平(P<0.01)，并且154、210日齡的表達(dá)量均顯著高于81日齡的表達(dá)水平(P<0.05)；在210 日齡母藏雞脂肪組織中的表達(dá)量最高，極顯著高于其他日齡表達(dá)水平(P<0.01)。

圖6　PID1基因在公藏雞不同時(shí)期和組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.6　Relative expression of PID1 mRNA in different tissues and at different ages of male Tibetan chicken

圖7　PID1基因在母藏雞不同時(shí)期和組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.7　Relative expression of PID1 mRNA in different tissues and at different ages of female Tibetan chicken

綜上分析，PID1基因在不同日齡藏雞胸肌中的表達(dá)不存在公母差異，但在腿肌和脂肪組織中的表達(dá)均存在公母差異。并對(duì)同一日齡的同一組織進(jìn)行了公母表達(dá)差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1日齡腿肌組織公母差異極顯著(P<0.01)，其余各日齡公母無(wú)差異，胸肌與脂肪組織公母間無(wú)差異。

2.5PID1 mRNA與藏雞肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析

藏雞不同日齡肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定結(jié)果顯示(表3)，隨日齡的增加IMF的含量總體呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，腿肌IMF含量高于胸肌IMF含量。PID1 mRNA 表達(dá)量與IMF的相關(guān)性分析結(jié)果得出，在119～210 d階段公雞胸肌PID1 mRNA 表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)性達(dá)到顯著正相關(guān)(r=0.435*；P=0.043)；在154～210 d母雞胸肌的PID1 mRNA表達(dá)量與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.556*；P=0.039)。在其他階段PID1 mRNA表達(dá)量與IMF含量均存在相關(guān)性，但未達(dá)到顯著性水平。

表3藏雞各個(gè)日齡不同部位的肌內(nèi)脂肪含量

Table 3IMF content in different tissues and at different ages in Tibetan chicken

%

3　討　論

3.1藏雞PID1基因克隆與序列分析

研究表明,PID1基因在哺乳動(dòng)物中是含有PTB結(jié)構(gòu)域的蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(PTB結(jié)構(gòu)域最基本的特征是作為一種適配器蛋白)[15]、器官形成[16]、細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)育[17]等方面起重要作用。

本研究成功獲得了藏雞PID1基因序列，并且發(fā)現(xiàn)與原雞序列相比存在4個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，其中有2個(gè)是同義突變，有2個(gè)是非同義突變，分別是229、353 位點(diǎn)的Cys、Lys均突變?yōu)锳rg，且這2個(gè)突變位于藏雞PTB結(jié)構(gòu)域，這些突變有可能會(huì)導(dǎo)致該基因功能的變化。有研究證實(shí)，β3-腎上腺素能受體(β3-AR)基因第190位堿基突變，導(dǎo)致第64位氨基酸發(fā)生Trp64Arg變異，可引起脂質(zhì)和能量代謝異常[18]。并且同源性分析發(fā)現(xiàn)，核PID1基因在不同物種間進(jìn)化保守性較高，這與C.Man等[13]的報(bào)道相一致，可能是因?yàn)樵摰鞍缀械囊粋€(gè)特殊結(jié)構(gòu)域-PTB(PH結(jié)構(gòu)域超家族成員)決定了基因的進(jìn)化[19]及功能。

藏雞PID1蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該蛋白屬于不穩(wěn)定親水酸性蛋白質(zhì)且分子量是24.92 ku，與雞25.00 ku不同，可能是與PID1蛋白氨基酸突變有關(guān)。藏雞氨基酸組成與人[8]相比，均是Leu所占比例最高，可能因?yàn)椴煌锓N間氨基酸差異不大所致。分析預(yù)測(cè)藏雞PID1蛋白有14個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)潛在O-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，3個(gè)二硫鍵，7種保守特異性蛋白質(zhì)激酶結(jié)合位點(diǎn)且最強(qiáng)在Ser192殘基(P=0.82)，10個(gè)蛋白與蛋白作用位點(diǎn)。蛋白質(zhì)翻譯后的修飾對(duì)蛋白的正確折疊[20]等方面起重要作用。PID1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋占26.73%，β折疊占20.74%，無(wú)規(guī)則卷曲占52.53%。最大量的結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。本研究還發(fā)現(xiàn)，PID1蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)綠色熒光標(biāo)記蛋白轉(zhuǎn)染3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和293T細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象[4]，說(shuō)明該蛋白無(wú)信號(hào)肽、不存在跨膜結(jié)構(gòu)域[8]，并有沿質(zhì)膜內(nèi)側(cè)區(qū)域性聚集現(xiàn)象[13]，與本研究預(yù)測(cè)結(jié)果相似。

3.2PID1基因在藏雞各組織中的表達(dá)分析

組織表達(dá)分析顯示，藏雞PID1基因在各個(gè)組織中存在廣泛表達(dá)，在脂肪組織中表達(dá)最高，并且在整個(gè)發(fā)育階段的脂肪組織中呈不同程度的表達(dá)，推測(cè)該基因在藏雞脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用。有研究表明，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞的過(guò)程中PID1的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)[21]，說(shuō)明PID1基因在成脂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PID1基因在肺組織中也存在較高水平的表達(dá)，可能是因?yàn)椴仉u處于高海拔、氣候寒冷的環(huán)境中，肺組織需要沉積較多的脂肪。胸肌中表達(dá)不高，這與A.S.Da Costa等[22]報(bào)道的肌肉組織是肌內(nèi)脂肪沉積最重要的組織相一致。對(duì)雞的研究表明，各個(gè)組織間沒(méi)有表達(dá)的差異性，卻有一些微小RNA的靶位點(diǎn)[13]。在豬上研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)最高的是肝組織，其次是脂肪[23-24]，不同品種間豬的表達(dá)具有差異性；在羊上高表達(dá)組織為肝和腹肌，低表達(dá)組織為脾和肺[25]。說(shuō)明該基因表達(dá)具有物種的特異性、組織的廣泛性，并且該基因的表達(dá)受多種因素共同決定。因?yàn)椴仉u生活在高海拔地區(qū)，經(jīng)過(guò)藏族人民長(zhǎng)期的培育，其遺傳基因、生活環(huán)境等與陸地動(dòng)物有所不同，可能因此造成了PID1基因表達(dá)的差異。下一步可以高原環(huán)境等作為切入點(diǎn)深入了解該基因的表達(dá)。

3.3PID1基因在藏雞不同發(fā)育階段肌肉組織的時(shí)序表達(dá)及與IMF沉積的相關(guān)性

本研究發(fā)現(xiàn)，PID1基因在1～210日齡藏雞的胸肌和腿肌中均存在表達(dá)，在1日齡胸肌及119日齡腿肌中存在高表達(dá)。同時(shí)分析顯示，PID1基因在各個(gè)階段藏雞胸肌中的表達(dá)無(wú)性別差異，但在腿肌中的表達(dá)卻存在性別差異。說(shuō)明PID1基因的表達(dá)存在日齡、性別的差異。有研究表明，PID1基因在山羊6～24月齡期間背最長(zhǎng)肌的表達(dá)水平呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)[26]。在牦牛上研究發(fā)現(xiàn)，PID1基因在0.5和9歲牛背最長(zhǎng)肌的表達(dá)極顯著高于3.5～5.5歲的牛[27]。與本試驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是不同物種所致。

本研究中，PID1基因的表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)性分析結(jié)果表明，119～210日齡公藏雞胸肌PID1基因的表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，但154～210日齡母雞胸肌IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，造成公母差異的原因可能是154～210日齡母雞處于產(chǎn)蛋階段，對(duì)其IMF沉積有影響。錢源等和徐洪剛指出在豬不同品種間的肝、脂肪和肌肉組織及天府肉羊背最長(zhǎng)肌中PID1基因mRNA表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)[23，25]。同時(shí)有研究報(bào)道，利用精子介導(dǎo)法制備RNA干擾PID1轉(zhuǎn)基因兔模型發(fā)現(xiàn)，PID1基因與肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)[11]。因此推測(cè)PID1基因可能作為IMF沉積的候選基因。但本試驗(yàn)結(jié)果指出，PID1基因表達(dá)水平與IMF含量沉積存在部位差異性，原因可能是藏雞處于高海拔地區(qū)，與陸地生長(zhǎng)的其他物種在相關(guān)性、能量代謝等方面有差異。

4　結(jié)　論

本研究成功克隆了藏雞PID1基因序列654 bp，共編碼217個(gè)氨基酸，屬于不穩(wěn)定親水酸性混合蛋白質(zhì)。與原雞親緣關(guān)系最近，且存在4個(gè)位點(diǎn)的堿基突變，其中2個(gè)突變引起氨基酸的改變，并位于PTB結(jié)構(gòu)域。PID1基因在心、肝、脾、肺、腎、腦、胸肌、腿肌、皮下脂肪都有表達(dá)，且在脂肪組織中表達(dá)最高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PID1基因的表達(dá)有日齡、性別、組織的差異，且該基因表達(dá)水平與IMF含量呈不同程度相關(guān)。本研究為進(jìn)一步了解PID1基因的功能及其在肌內(nèi)脂肪沉積中的作用提供一定理論基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

Research on Cloning and Tissue Expression Profile of Phosphotyrosine Interaction Domain Containing 1(PID1)in Tibetan Chicken

NIE Xiao-qing，LIN Ya-qiu*，XU Ya-ou*，ZHAO Yan-ying，Lü Ming，ZUO Lu-lu，ZHANG Xiao-yu，LI Xiang

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

In the present study，PID1 mRNA expression profile in several tissues of Tibetan chicken during different growth phases and the correlation betweenPID1 mRNA expression and intramuscular fat (IMF) content were investigated.PID1 gene of Tibetan chicken was cloned using RT-PCR and the structure as well as function of PID1 protein was predicted using relevant softwares.Furthermore，the expression profile ofPID1 gene was investigated by qRT-PCR and the relationship betweenPID1 mRNA expression and IMF content in chicken muscles were analyzed.The results showed thatPID1 gene was 654 bp encoding a unstable，hydrophilic，acidic protein with 217 amino acids and a PTB (phosphotyrosine binding) domain.There were 14 phosphorylation sites，4 O-glycosylation sites，1 N-glycosylation site，7 protein kinase phosphorylation sites，and 3 disulfide bonds within the PID1 protein.The predicted secondary structure of PID1 protein was composed of alpha helix (26.73%)，beta fold (20.74%) and random coil (52.53%)，belonging to one of mixed proteins in cytoplasm.qRT-PCR results showed thatPID1 mRNA could be expressed in various tissues，with the highest expression level in fat (P<0.01).The temporal expression showed that the expression level ofPID1 gene was the highest in breast muscle of 1 day Tibetan chicken，and was the highest in leg muscle of the 210thday cocks (P<0.01)，while the highest in leg muscle of the 119thday hens (P<0.01).For fat tissues，the highest expression level appeared in the 119thday and the 154thday cocks，and the 210thday hens，respectively.The correlation analysis indicated that there was a significant correlation betweenPID1 mRNA expression and breast muscle IMF content in Tibetan chicken(P<0.05).These results suggested that thePID1 gene might play an important role in the IMF deposition of Tibetan chicken.

Tibetan chicken；Phosphotyrosine interaction domain containing 1(PID1)；cloning；tissue expression；temporal expression；intramuscular fat(IMF)

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.004

2015-08-17

四川應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2013JY0044)；四川省畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目 (2011NZ0099-6)；西南民族大學(xué)項(xiàng)目(2012NFW001)

聶曉慶(1989-)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：n_x_qing@163.com

林亞秋，研究員，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：linyq1999@163.com；徐亞歐，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：xuyaou@163.com

S831.2

A

0366-6964(2016)06-1102-10