副豬嗜血桿菌SC096株莢膜多糖抗豬肺泡巨噬細胞吞噬能力的研究

周　琪，賀現輝，陽巧梅，馮賽祥，樊惠英*，廖　明*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.邵陽職業技術學院，邵陽 422000)

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副豬嗜血桿菌SC096株莢膜多糖抗豬肺泡巨噬細胞吞噬能力的研究

周琪1，賀現輝1，陽巧梅2，馮賽祥1，樊惠英1*，廖明1*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.邵陽職業技術學院，邵陽 422000)

為探討莢膜多糖在副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)抗豬肺泡巨噬細胞吞噬中的作用，作者用間接免疫熒光試驗和流式細胞術對H.parasuisSC096分離株及其莢膜缺陷型菌株進行了抗巨噬細胞吞噬試驗。間接免疫熒光試驗顯示野生菌株組的H.parasuis大多數存在于巨噬細胞外，而莢膜多糖缺失突變體則主要存在于巨噬細胞內。流式細胞儀檢測結果表明，對應的野生型菌株組巨噬細胞總的吞噬率為12.51%，吞入效率為89.61%；而莢膜多糖缺陷型組巨噬細胞總的吞噬率為27.18%，吞入效率為91.06%。加入外源莢膜多糖后，野生型菌株組巨噬細胞總的吞噬率降為2.72%，吞入效率降為32.72%；莢膜多糖缺陷型組巨噬細胞總的吞噬率降為3.59%，吞入效率基本不變，為91.36%。莢膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬細胞吞噬能力降低，表明H.parasuisSC096株莢膜多糖具有抑制巨噬細胞吞噬能力的作用。

副豬嗜血桿菌；莢膜多糖；豬肺泡巨噬細胞；吞噬能力

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)是豬上呼吸道的一種共棲菌，可在特定的條件下入侵機體而引起嚴重的全身性疾病[1]。一般認為該病的暴發與豬群的運輸等應激因素和免疫狀況有著重要關系[2]。研究發現莢膜對其致病過程起著重要作用，H.parasuis分為有莢膜菌株和無莢膜菌株，T.Morozumi等通過十六烷基三甲基溴化銨沉淀和莢膜染色等方法鑒定了H.parasuis的莢膜結構，有莢膜菌株一般是球桿菌樣，而不是通常的棒狀或絲狀，從健康豬上鼻腔分離的H.parasuis菌株多數具有莢膜，而分離自患病豬的感染的實質性器官等部位的H.parasuis菌株卻只有少數具有莢膜[3]。有研究表明從健康豬鼻腔中分離的H.parasuis不能有效逃避肺巨噬細胞的吞噬作用，而在發病臟器中分離的副豬嗜血桿菌逃避肺巨噬細胞吞噬的能力更強。同時，在和肺泡巨噬細胞作用之后體外傳代丟失的莢膜結構可以恢復，這暗示了這種莢膜結構可能使副豬嗜血桿菌更有效地逃避肺巨噬細胞的吞噬，但具體的抗吞噬機制還需要進一步的研究[4]。莢膜多糖(CPS)對巨噬細胞吞噬作用的影響機制尚不明確。目前已知細胞松弛素B會影響巨噬細胞的吞噬作用，細胞松弛素B通過降解細胞的微絲來阻斷吞噬泡的形成，從而抑制細胞的吞噬[5]。

因此，本研究利用H.parasuisSC096分離株及其莢膜多糖缺陷型菌株和純化的莢膜多糖及細胞松弛素B分別進行抗巨噬細胞吞噬試驗，用間接免疫熒光試驗和流式細胞術檢測巨噬細胞的吞噬效率，研究莢膜多糖對H.parasuis抗巨噬細胞吞噬能力的影響，鑒定H.parasuis莢膜多糖功能，為進一步開展H.parasuis致病機制研究提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1菌株與細胞

副豬嗜血桿菌SC096分離株及其莢膜多糖缺陷型菌株由華南農業大學農業部獸用疫苗創制重點實驗室保存。豬肺泡巨噬細胞(PAMs)購自美國ATCC(細胞編號CRL-2845)。

1.2主要儀器與試劑

流式細胞儀(貝克曼公司，美國)，顯微鏡(奧林巴斯CX311，日本)，超聲波破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司 JY96-IIn)；TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)和LB培養基為青島海博試劑有限公司產品；細胞膜紅色熒光探針 (DiI)為碧云天生物技術研究所產品；預染蛋白質Marker PageRulerTMPrestained Protein Ladder SM0671為加拿大 Fermentas公司產品。試驗所用抗體見表1。

表1試驗所用抗體

Table 1Antibodys used in this study

名稱Name宿主Host來源SourceH.parasuisSC096capsularpolysaccharidedeficientstrainPolyclonalAntibodyRabbitOurlaboratoryBovineserumalbuminPolyclonalAntibodyMouseMillipore,USAMouseIgGPolyclonalAntibodylinkedFITCGoatMillipore,USARabbitIgGPolyclonalAntibodylinkedFITCGoatMillipore,USAMouseIgGPolyclonalAntibodylinkedPIGoatMillipore,USARabbitIgGPolyclonalAntibodylinkedPIGoatMillipore,USA

1.3細菌及細胞培養

副豬嗜血桿菌在TSA上復蘇，取單菌落接種于TSB中培養12 h作為種子液，將上述種子液按照1%比例接種于新鮮TSB中，37 ℃，180 r·min-1振蕩培養。將PAMs細胞(CRL-2845)解凍后轉移至75 cm2細胞瓶，置于5% CO2培養箱37 ℃培養。待細胞長滿時傳代，按1∶2的比例擴增細胞。

1.4間接免疫熒光檢測H.parasuis抗巨噬細胞吞噬試驗

將細胞傳至12孔培養板中，加入細胞膜紅色熒光探針 (DiI)。待細胞長至對數期(約4.0×105·孔-1)時，分別加入FITC染色的H.parasuisSC096株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株(約1.0×107CFU·孔-1)，37 ℃孵育1 h，再用無菌預冷PBS洗5遍，洗去未被吞噬的細菌。每個樣品均有重復孔，試驗重復3次。然后用pH 7.4的PBST清洗細胞3遍，4%多聚甲醛固定20 min。PBST洗滌3次，每次5 min，0.25% Triton X-100作用30 min。PBST洗滌3次，每次5 min，滴加5%脫脂奶粉封閉1 h或者4 ℃過夜。PBST洗滌3次，每次5 min，分別滴加抗相應H.parasuis菌株的一抗，37 ℃濕盒作用1 h或者4 ℃過夜。PBST洗滌3次，每次5 min，滴加稀釋的FITC標記的熒光抗兔二抗，室溫作用1 h。PBST洗滌3次，每次5 min，熒光顯微鏡觀察。

1.5流式細胞術檢測H.parasuis抗巨噬細胞吞噬試驗

1.5.1莢膜多糖(CPS)提取及純化將培養好的細菌用PBS洗兩遍，離心。將細菌團用60 ℃水飽和酚進行萃取[6]。30 min后，所得到的苯酚和水相合并，并用蒸餾水透析以除去苯酚。透析液通過離心澄清并濃縮，冷凍干燥。粗制劑在緩沖液(10 mmol·L-1pH為7.5的Tris-HCl，1 mmol·L-1的氯化鎂，1 mmol·L-1的氯化鈣，50 μg·mL-1核糖核酸酶A和50 μg·mL-1DNA酶Ⅰ)中37 ℃振蕩溫育3 h，加入蛋白酶K 50 μg·mL-160 ℃消化3 h，離心取上清。CPS 100 000 g 離心6 h后，將凝膠樣CPS團塊重懸于無熱原水，凍干。從粗品CPS中去除LPS污染物：將樣品以5 mg·mL-1濃度溶解于2%乙酸，100 ℃孵育2 h。經水解的樣品冷卻至室溫，通過離心澄清將上清液小心地取出并再次透析。將透析后液體冷凍干燥濃縮，凍干的樣品以20 mg·mL-1溶解于PBS中，并過濾滅菌。純化的CPS進行SDS-PAGE并銀染。

1.5.2細胞的處理參考A.Olvera等的報道[4]，將H.parasuisSC096株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株與熒光染料FITC孵育1 h著色，洗去多余染料。將細胞傳至12孔細胞培養板中，待細胞長至對數生長期(約4.0×105·孔-1)時，分別加入FITC 染色的H.parasuisSC096 株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株(約1.0×107CFU·孔-1)，另一組同時加入30 μg提純的莢膜多糖(另設不加莢膜多糖，而是加細胞松馳素B的對照)，放回培養箱孵育1 h后，用無菌預冷PBS洗5遍，洗去未被吞噬的細菌。每個樣品均設重復孔，試驗重復3次。

1.5.3流式細胞術冰上小心刮取細胞，輕輕將細胞懸液轉移到5 mL離心管中，800 g離心5 min收集細胞，用2 mL預冷PBS洗滌細胞一次，800 g離心5 min。用2 mL 4%多聚甲醛室溫固定細胞40 min，800 g離心5 min；2 mL PBS重懸細胞，800 g離心5 min；用1 mL含0.2% Triton-X100和5% 血清的PBS重懸細胞，冰上放置10 min，800 g離心5 min。分別加入H.parasuisSC096 株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株抗體，冰上放置40 min，800 g離心5 min，用2 mL冷的PBS 重懸細胞，800 g離心5 min，洗去未結合一抗，重復一次。加入熒光標記(PI)的二抗，冰上避光放置40 min后，800 g離心5 min，去上清，PBS洗滌兩次。加入0.5 mL 1%多聚甲醛重懸細胞；流式細胞儀檢測。

2　結　果

2.1間接免疫熒光檢測副豬嗜血桿菌SC096株抗巨噬細胞吞噬試驗

間接免疫熒光結果顯示，H.parasuisSC096野生型菌株和肺泡巨噬細胞孵育后，抗吞噬能力較強，細菌(綠色)多分布在巨噬細胞細胞膜(棕紅色環)區域之外(圖1A，白色箭頭所示處)；而莢膜多糖缺陷型菌株抗吞噬能力較弱，細菌(綠色)多分布在巨噬細胞細胞膜(棕紅色環)區域之內(圖1B，白色箭頭所示處)。

2.2流式細胞術檢測副豬嗜血桿菌SC096株抗巨噬細胞吞噬試驗2.2.1莢膜多糖的提取SDS-PAGE銀染結果顯示，提取的H.parasuisSC096株莢膜多糖在35 ku處有一個清晰的條帶，泳道背景清晰，無其他雜帶(圖2，泳道1)，脂多糖對照條帶出現在15～25 ku，條帶清晰，泳道背景清晰，無其他雜帶(圖2，泳道2)。

A.野生型菌株抗巨噬細胞吞噬，綠色為細菌，棕紅色環為巨噬細胞細胞膜，細菌多在細胞膜外，見白色箭頭所示；B.莢膜多糖缺陷型菌株抗巨噬細胞吞噬，綠色為細菌，棕紅色環為巨噬細胞細胞膜，細菌多在細胞膜內，見白色箭頭所示A.Wild-type strain inhibit phagocytosis of macrophages，bacteria are stained green，the cell membrane of macrophages are stained red in circle shape，and most bacteria located outside the membrane (white arrow)；B.Capsular polysaccharide-deficient strain anti-macrophage phagocytosis，bacteria are stained green，the cell membrane of macrophages are stained red in circle shape，and most bacteria located inside the membrane (white arrow)圖1　H.parasuis SC096株野生型及莢膜多糖缺陷型菌株抗巨噬細胞吞噬試驗(間接免疫熒光)Fig.1　Anti-macrophage experimental results of H.parasuis SC096 strains wild-type and capsular polysaccharide-deficient strain (By indirect immunofluorescence assay)

M.PageRulerTM Prestained Protein Ladder SM0671；1.H.parasuis SC096株莢膜多糖；2.H.parasuis SC096株脂多糖M.PageRulerTM Prestained Protein Ladder SM0671；1.Capsular polysaccharide of H.parasuis SC096 strain；2.Lipopolysaccharide of H.parasuis SC096 strain圖2　H.parasuis SC096株莢膜多糖提取結果Fig.2　Capsular polysaccharide of H.parasuis SC096 strain

2.2.2流式細胞術檢測結果統計結果顯示(表2)，野生型菌株組巨噬細胞總的吞噬率為12.51%，吞入效率為89.61%；莢膜多糖缺陷型組巨噬細胞總的吞噬率為27.18%，吞入效率為91.06%。加入外源莢膜多糖后，野生型菌株組巨噬細胞總的吞噬率降為2.72%，吞入效率降為32.72%；莢膜多糖缺陷型組巨噬細胞總的吞噬率降為3.59%，吞入效率基本不變，為91.36%。加入和外源莢膜多糖等量的細胞松弛素B后，野生型菌株組總的吞噬率降為5.52%，莢膜多糖缺陷型降為15.59%。

流式細胞儀雙通道檢測結果顯示為4個區間，B1對應紅色熒光，B2對應既有紅色熒光又有綠色熒光，B3對應無熒光，B4對應只有綠色熒光(圖3)。其中，綠色熒光結果表示H.parasuis帶有的熒光，紅色熒光為吞噬結束后抗H.parasuis抗體結合上的熒光。當H.parasuis被巨噬細胞吞噬吞入到細胞內時，則抗體無法把紅色熒光標記到細菌上，而當其被捕獲在巨噬細胞細胞膜上，未被完全吞噬進去時，抗體可以把紅色熒光結合到細菌上。即，只有綠色熒光的細胞為完全吞入H.parasuis的巨噬細胞，既有紅光又有綠光的為未完全吞入H.parasuis的巨噬細胞。

表2流式細胞術檢測H.parasuisSC096株野生型及莢膜多糖缺陷型菌株試驗統計結果

Table 2Statistical results of anti-macrophage by results ofH.parasuisSC096 strains wild-type and capsular polysaccharide-deficient strain (By flow cytometry)

%

A.野生型組；B.野生型+莢膜多糖組；C.野生型+細胞松弛素B組；D.莢膜多糖缺陷型組；E.莢膜多糖缺陷型+莢膜多糖組；F.莢膜多糖缺陷型+細胞松弛素B組A.Wild-type；B.Wild-type +CPS；C.Wild-type +Cytochalasin B；D.Capsular polysaccharide-deficient strain；E.Capsular polysaccharide-deficient strain +CPS；F.Capsular polysaccharide-deficient strain +Cytochalasin B圖3　H.parasuis SC096株野生型及莢膜多糖缺陷型菌株抗巨噬細胞吞噬試驗結果(流式細胞術)Fig.3　Anti-macrophage experimental results of H.parasuis SC096 strains wild-type and capsular polysaccharide-deficient strain (By flow cytometry)

3　討　論

莢膜是細胞壁外包圍的一層黏液性物質，有黏附、營養、抗干燥、抗吞噬及抗有害物質損傷等作用，在細菌的生存中起重要的作用。莢膜的主要成分是多糖和多肽，多糖有助于細菌躲避宿主的免疫攻擊，在宿主還沒有產生特異性抗體時，莢膜多糖對抵抗宿主非特異性免疫攻擊起到關鍵的作用，它能阻礙補體因子與細菌表面有效的激活因子接觸，從而阻止膜攻擊復合體(MAC)對細菌的攻擊[7-8]。有些細菌的莢膜多糖可以抑制巨噬細胞的細胞膜脂微區(lipid microdomains)形成，進一步抑制巨噬細胞的吞噬能力[9]，還有細菌的莢膜多糖可以與宿主細胞表面蛋白相互作用，抑制細胞IL-8的釋放[10]。

副豬嗜血桿菌莢膜多糖合成基因座的位置比較保守，但是不同血清型菌株的基因組成相差較大，莢膜多糖的遺傳和結構差異決定了副豬嗜血桿菌血清型具有多樣性[11]。H.parasuis莢膜通常在抵御宿主補體攻擊中具有作用，有研究發現高抗血清殺傷的H.parasuis菌株SH0165莢膜多糖基因座上的capD基因是關鍵的毒力因子，capD缺陷會使SH0165致病能力下降以及對補體敏感[12]。莢膜結構對H.parasuis抗巨噬細胞吞噬也有重要作用，A.Olvera等[4]發現分離自有全身癥狀豬的H.parasuis，在與PAMs細胞相互作用后可觀察到有明顯的莢膜，這表明在抗吞噬作用中莢膜表面結構發揮了一定的作用。研究發現Wza基因編碼莢膜多糖輸出蛋白[13]，敲除Wza基因的突變株表現出對豬肺泡巨噬細胞的吞噬作用更加敏感[14]。關于莢膜多糖抗巨噬細胞吞噬的原理，在其他細菌上也有過報道，有的細菌莢膜靠模擬宿主體內成分逃避免疫識別的方法，進而逃避巨噬細胞的吞噬，有的細菌莢膜多糖可以抑制巨噬細胞吞噬結構的形成，進一步抑制巨噬細胞的吞噬作用[15-17]。

本研究中作者先采用間接免疫熒光法檢測了PAMs細胞對H.parasuisSC096株及其莢膜多糖缺陷型菌株的吞噬情況，發現H.parasuisSC096株多存在于PAMs細胞外，而莢膜多糖缺陷型菌株則主要存在于PAMs細胞內，說明莢膜多糖缺陷型菌株更易被巨噬細胞吞噬，其抗吞噬能力較SC096親本株弱。這一結果表明莢膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬細胞吞噬能力降低，莢膜多糖在H.parasuis抗巨噬細胞吞噬過程中可能起重要作用。

作者還運用流式細胞術分別統計了PAMs細胞對SC096野生型菌株及其莢膜多糖缺陷型菌株的吞噬數。數據表明無論是總的吞噬率還是吞入效率，野生型菌株組均小于莢膜多糖缺陷型菌株組，說明莢膜多糖缺失后的菌株更易被巨噬細胞捕捉和吞噬。加入外源莢膜多糖后，野生型菌株組和莢膜多糖缺陷型菌株組的巨噬細胞吞噬率都有所降低，說明外源的莢膜多糖可以降低巨噬細胞對H.parasuis的吞噬效率，抑制巨噬細胞的吞噬能力，但野生型組的PAMs細胞吞噬率仍遠低于莢膜多糖缺陷型組，這提示菌體表面的莢膜結構可以抵御巨噬細胞的吞噬。另外，細胞松弛素B可以抑制巨噬細胞形成吞噬結構，進而抑制其吞噬能力。加入和外源莢膜多糖等量的細胞松弛素B后，野生型菌株組和莢膜多糖缺陷型菌株組總的吞噬率也有所降低，但降低程度不如外源莢膜多糖。這提示外源性莢膜多糖抑制巨噬細胞吞噬的能力強于細胞松弛素B。研究結果初步解釋了H.parasuisSC096株莢膜多糖抗巨噬細胞吞噬的機制，為進一步研究副豬嗜血桿菌的致病機制提供了理論基礎。

4　結　論

比較H.parasuisSC096株野生型和莢膜缺陷型菌株抗豬肺泡巨噬細胞吞噬的能力，發現莢膜丟失后H.parasuis抗巨噬細胞吞噬的能力下降。H.parasuisSC096株莢膜多糖可以明顯抑制巨噬細胞對該菌的吞噬能力。

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(編輯白永平)

Role of Capsular Polysaccharide inHaemophilusparasuisSC096 Strain Anti-Porcine Alveolar Macrophage Phagocytosis

ZHOU Qi1，HE Xian-hui1，YANG Qiao-mei2，FENG Sai-xiang1，FAN Hui-ying1*，LIAO Ming1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；2.ShaoyangPolytechnic，Shaoyang422000，China)

The aim of the experiment was to clarify the role of the capsular polysaccharide in anti-porcine alveolar macrophage phagocytosis ofHaemophilusparasuis.The anti-phagocytosis test was conducted by using indirect immunofluorescence method and flow cytometry withH.parasuisSC096 wild-type strain，and capsular deficient strain.The results showed that theH.parasuisSC096 wild-type strains were observed mainly outside the macrophages，while capsular polysaccharide-deficient were observed in macrophages by indirect immunofluorescence experiments.Flow cytometry results showed that the total macrophage phagocytosis rate was 12.51% and swallowed efficiency was 89.61% in the wild-type strain group；the total macrophage phagocytosis rate was 27.18% and swallowed efficiency was 91.06% in the capsular polysaccharide-deficient group.By adding exogenous capsular polysaccharide，total macrophage phagocytosis rate was reduced to 2.72%，swallowed efficiency was reduced to 32.72% in the wild-type strain group；the total macrophage phagocytosis rate dropped to 3.59%，swallowed efficiency was nearly unchanged at 91.36% in the capsular polysaccharide-deficient group.The ability of anti-macrophage phagocytosis ofH.parasuiswas reduced through removing capsular polysaccharide，which demonstrated that capsular polysaccharide may inhibit the ability of macrophage phagocytosis.

Haemophilusparasuis；capsular polysaccharide；porcine alveolar macrophage；phagocytosis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.019

2015-10-21

農業部公益性行業科研專項經費項目(201303034)；農業科研杰出人才及其創新團隊-現代農業人才支撐計劃項目[農財發(2012)160號]；教育部博士點基金項目(20114404110016)；廣東省"三高"農業專項資金(5500-F15071)

周琪(1991-)，女，江西興國人，碩士生，主要從事動物傳染病學研究，E-mail: 15909348676@163.com

廖明，男，教授，E-mail: mliao@scau.edu.cn; 樊惠英，女，教授，E-mail：hyfan@scau.edu.cn

S852.61

A

0366-6964(2016)06-1232-07