應用多重GeXP-PCR同時檢測6種雞免疫抑制病病毒的研究

曾婷婷，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃　莉，黃嬌玲

(廣西壯族自治區獸醫研究所廣西畜禽疫苗新技術重點試驗室，南寧 530001)

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應用多重GeXP-PCR同時檢測6種雞免疫抑制病病毒的研究

曾婷婷，謝芝勛*，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃莉，黃嬌玲

(廣西壯族自治區獸醫研究所廣西畜禽疫苗新技術重點試驗室，南寧 530001)

擬建立一種基于GeXP多基因表達分析系統的多重PCR方法，同時檢測6種雞免疫抑制病病毒——雞馬立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亞群)、禽網狀內皮組織增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性貧血病毒和傳染性法氏囊炎病毒。多重PCR反應使用嵌合引物和通用引物組合的反應體系，經過GeXP多基因表達分析系統進行毛細管電泳，鑒別PCR產物片段；通過調整嵌合引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度優化反應體系及調整退火溫度和時間優化反應條件。應用建立的多重GeXP-PCR，分別單獨和同時檢測6種雞免疫抑制病病毒的8個目的基因，同時以其他常見禽類病毒和雞組織器官核酸為對照，驗證其特異性；檢測8個目的基因不同濃度的克隆質粒，驗證其敏感性；應用建立的多重PCR檢測300份臨床樣品，并同時用熒光定量PCR和測序驗證其檢測結果的準確性。結果表明建立的多重GeXP-PCR方法能夠分別擴增出6種病毒，8個特異性目的片段，不能擴增其他常見禽類病毒和雞組織器官的基因；在低至100 copies·20 μL-1的水平能同時特異性地檢測出6種雞免疫抑制病病毒核酸；檢測300份臨床病死雞樣品，190份樣品顯示為陽性，PCR和測序結果與多重GeXP-PCR結果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特異、敏感、高通量地檢測6種雞免疫抑制性病毒，可用于臨床鑒別診斷和分子流行病學調查，具有很高的臨床應用價值。

GeXP多基因表達分析系統；多重PCR；高通量；雞免疫抑制病病毒

GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

雞免疫抑制病病毒主要包括雞馬立克病毒(Marek’s disease virus，MDV)[1]、禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV，以A、B和J亞群ALV為主)[2]、禽網狀內皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)[3]、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)[4]、雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anaemia virus，CIAV)[5]和傳染性法氏囊炎病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)[6-7]，這些病毒都能破壞雞的免疫功能造成免疫抑制。雞群感染免疫抑制病病毒后，對致病菌和其他病毒更加易感，發生繼發感染，接種疫苗后達不到預期免疫效果[8-9]，飼料報酬降低和生長緩慢。雞感染這些病毒后的臨床癥狀各有不同，但有些不是馬上表現出來。雞感染MDV、ALV和REV后，免疫抑制比腫瘤出現早得多[1，3]。小于3周齡的雛雞感染IBDV有時不會出現典型癥狀，但仍出現免疫抑制[9]。超過3周齡的雛雞感染CIAV后，能產生一定的免疫力，不會引起貧血，但仍然會發生免疫抑制[10]。臨床上常見幾種免疫抑制病毒混合感染，使診斷更加困難[11-12]。

故對以上所述病毒感染進行鑒別診斷和檢測尤為重要。常規的檢測方法是病毒分離，需要花費較長的周期。普通PCR、熒光PCR和LAMP等分子生物學方法檢測病毒比較快速，但一個反應體系只能檢測2～4種病毒。

GeXP多基因表達分析系統是一種新的、高通量的基因檢測平臺[13]。通過毛細管電泳鑒定經過熒光基團標記的多重PCR產物。PCR體系使用嵌合引物和通用引物組合，嵌合引物由特異性引物的5′端添加通用引物組成。上游嵌合引物由特異性引物和連接在其5′端的通用引物組成，通用引物的5′端標記熒光基團，下游嵌合引物亦由特異性引物和連接在其5′端的通用引物組成，但不標記熒光基團。設計引物時，使每對引物擴增的PCR產物之間至少相差7～10 bp，然后通過毛細管電泳辨認擴增片段大小。這項技術目前已經應用于診斷多種疾病，如同時檢測11種人乳頭瘤病毒[14]，9種血清型的手足口病[15]，癌癥基因[16]，7種腸炎病毒[17]和人的H1N1病毒[18]。這項技術第一次應用于獸醫領域是2014年本實驗室用于檢測9種雞呼吸道病原[19]。

本研究旨在建立一種同時檢測MDV、ALV-A/B/J、REV、CIAV、IBDV和ARV的多重GeXP-PCR方法。

1　材料與方法

1.1動物福利聲明

本研究經過廣西壯族自治區獸醫研究所的動物福利委員會批準，所使用的雞胚和SPF雞均符合動物福利標準，動物宰殺和樣品采集過程按照章程將動物的痛苦降至最低。

1.2病毒毒株和臨床樣品采集

本研究中所使用病毒毒株為本實驗室保存，如表1所示。MDV、ALV-A/B/J和REV使用SPF雞胚制作的雞胚成纖維細胞(CEF)增殖，IBDV和ARV使用9日齡SPF雞胚增殖，CIAV使用1日齡SPF雛雞增殖，雛雞腹膜注射含病毒的組織上清液，2周后收集雛雞骨髓。臨床樣品采自送檢病死雞，共300羽病死雞，包括雞胸腺、法氏囊、脾、肝、骨髓和血液，將這些組織混合勻漿保存。病死雞的日齡介于50～135 d，包括種雞、蛋雞和肉雞。

表1毒株來源

Table 1Sources of pathogens

病原Pathogen來源Source參考毒株Referenceviruses 馬立克病毒Marek’sdiseasevirusKC453972,KC453973,GX130112,GX140301,050118,070123,090201,100428GVRI 禽白血病病毒A亞群AvianleucosisvirussubgroupAisolateRSV-1CVCC 禽白血病病毒A亞群AvianleucosisvirussubgroupAisolateGX110521,GX110522,ALVA01,ALVA02,ALVA03GVRI 禽白血病病毒B亞群AvianleucosisvirussubgroupBisolateRSV-2CVCC 禽白血病病毒B亞群AvianleucosisvirussubgroupBisolateGX111230,GX130401,ALVB15,ALVB23,ALVB28GVRI 禽白血病病毒J亞群AvianleucosisvirussubgroupJisolateKC453974,KC453975,GX090201,GX090521,GX110110,GX120081,GX130018,GX140010GVRI 禽網狀內皮組織增生癥病毒ReticuloendotheliosisvirusAV235CVCC 禽網狀內皮組織增生癥病毒ReticuloendotheliosisvirusKC453976,KC453977,GX120825,GX131118GVRI 禽呼腸孤病毒AvianreovirusS1133,1733,526,C78,GuangxiR1,GuangxiR2,GX110058GVRI 傳染性法氏囊炎病毒InfectiousbursaldiseasevirusCA,AV162,AV144CVCC 傳染性法氏囊炎病毒InfectiousbursaldiseasevirusAV6CIVDC 傳染性法氏囊炎病毒Infectiousbursaldiseasevirus070124,080113,090053,100008,110110,130223GVRI 雞傳染性貧血病毒ChickeninfectiousanaemiavirusCAU0728,CAU0729,CAU0730,CAU0731,CAU0732CVCC 雞傳染性貧血病毒ChickeninfectiousanaemiavirusGXC060821GVRI其他病毒Otherviruses 禽流感病毒InactivatedH5N1avianinfluenzavirusRe-1HVRI 禽流感病毒AvianinfluenzavirusH9N6/Duck/HK/147/77HKU 禽流感病毒AvianinfluenzavirusH7N2/chickenPA/3979/97PU 新城疫病毒NewcastlediseasevirusF48E9GVRI 新城疫病毒NewcastlediseasevirusGX6/02GVRI 雞傳染性支氣管炎病毒InfectiousbronchitisvirusMassachusetts41GVRI 雞傳染性喉氣管炎病毒InfectiouslaryngotracheitisvirusAV1231CIVDC 雞滑液囊支原體MycoplasmasynoviaeCAU0748CVCC

HVRI.哈爾濱獸醫研究所；HKU.香港大學；GVRI.廣西獸醫研究所；CIVDC.中國獸醫藥品監察所；PU.賓夕法尼亞大學；CVCC.中國獸醫微生物保藏中心

HVRI.Harbin Veterinary Research Institute，China；HKU.University of Hong Kong，China；GVRI.Guangxi Veterinary Research Institute，China；CIVDC.China Institute of Veterinary Drugs Control，China；PU.University of Pennsylvania，USA；CVCC.China Veterinary Culture Collection Centre，China

1.3試劑與儀器

RNA/DNA共提試劑盒(E.Z.N.A.?Total DNA/RNA Isolation Kit)購自OMEGA(Norcross，GA，USA)；反轉錄試劑盒TransScript II Reverse Transcriptase[M-MLV，RNase-](High Temperature RT)購自全式金生物(北京，中國)；多重PCR試劑盒Genome Lab GeXP Starter Kit購自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)；樣品緩沖液，DNA Marker，上樣板，液體石蠟均購自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)；pGEM-T載體購自Promega(Madison，USA)，普通PCR酶，膠回收試劑盒，感受態細胞購自全式金生物(北京，中國)；限制性內切酶SpeⅠ購自寶生物(大連，中國)；DNA體外轉錄試劑盒RiboMAX Large Scale RNA Production Systems SP6/T7 Kit購自Promega(Madison，USA)；PCR儀購自Thermo (Milford，USA)；超微量分光光度計NanoDrop 2000購自Thermo Fisher Scientific(Milford，USA)；GeXP多基因表達分析系統GenomeLab GeXP Genetic Analysis System購自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)。

1.4 RNA/DNA抽提和RNA反轉錄

使用RNA/DNA共提試劑盒抽提MDV毒株細胞培養物；REV和 ALV-A/B/J毒株細胞培養物(含有REV和 ALV-A/B/J的前病毒DNA，proviral DNA)[20]，CIAV人工感染SPF雞的骨髓，IBDV和ARV的雞胚增殖的尿囊液的總RNA/DNA。用無核酸酶超純水溶解抽提好的DNA/RNA，于-80 ℃條件保存備用。按照說明書將IBDV和ARV的RNA反轉錄為cDNA備用(反轉錄過程對抽提產物中的DNA無影響)。

1.5引物設計和引物合成

將本實驗室保存毒株的序列與GenBank公布的毒株序列經過MEGA5.0軟件比對后，在它們的保守區域用Primer premier 5.0軟件設計特異性引物。通用引物為貝克曼公司專利產品，不與任何現有物種的基因互補配對，序列由貝克曼公司提供。特異性上游引物及其5′端加上通用引物序列，并在通用引物的5′端標記熒光基團Cy5組成上游嵌合引物，下游嵌合引物由下游特異性引物及其5′端加上通用引物序列組成，但不標記熒光基團。所有的嵌合引物由上海英駿生物公司合成和純化。引物序列見表2。

1.6建立多重PCR體系和反應程序

應用貝克曼Genome Lab GeXP Starter Kit建立多重PCR體系：總反應體積為20 μL，其中5× buffer 4 μL，buffer內含通用引物，工作濃度為0.25 μmol·L-1；MgCl2(25 μmol·L-1) 2 μL；嵌合引物混合物1 μL；Thermo-Start DNA polymerase 0.35 μL；cDNA/DNA模板 1 μL；無核酸酶超純水補足體積。

多重PCR反應程序包括3步：95 ℃ 5 min預變性后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環；72 ℃延伸5 min，結束反應。

1.7毛細管電泳和結果分析

取1 μL PCR產物和38.75 μL樣品緩沖液，0.25 μL DNA Marker混合均勻，加入上樣板中，滴加石蠟封閉液體表面。將上樣板置于GeXP多基因表達分析系統儀器卡槽中，進行高分辨率的毛細管電泳。不同大小片段的PCR產物在電泳過程中分離，通過PCR產物攜帶的熒光基團辨認其片段大小和信號強度。電泳完成后，使用儀器自帶軟件eXpress Profiler software分析結果，橫坐標表示片段大小，縱坐標表示信號強度，即PCR產物的含量。

1.8基于GeXP的多重PCR方法的特異性和敏感性試驗

根據電泳分析結果，調整嵌合引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度優化反應體系及調整退火溫度和時間優化反應條件。使用建立的多重GeXP-PCR方法，分別以各毒株核酸、其他常見雞病毒毒株(包括H5/H7/H9 三個血清型的禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的核酸，以及健康SPF雞的胸腺、脾和法氏囊的核酸為模板)，檢測該方法的特異性。

構建多重GeXP-PCR的各目的片段的重組質粒，以此為模板測試建立的多重GeXP-PCR方法的敏感性。用特異性引物擴增各毒株的目的片段，與pGEM-T載體連接后轉化感受態細胞增殖，并抽提質粒。構建好的質粒經過純化和測序驗證其序列的準確性。IBDV和ARV的質粒經過SpeⅠ酶切線性化之后體外轉錄為ssRNA。所有DNA質粒和ssRNA均用紫外分光光度計測定濃度。以構建好的DNA質粒和ssRNA為模板，按照建立的多重GeXP-PCR的流程，單一模板的終濃度分別調整為105copies·20 μL-1至1 copy·20 μL-1，測定多重GeXP-PCR對單一模板的敏感性；將單一模板等濃度混合為多重模板，將每種模板的終濃度均調整為105copies·20 μL-1至1 copy·20 μL-1，測定多重GeXP-PCR對多重模板的敏感性。

表2引物序列信息

Table 2Primer sequences

病毒Virus引物序列(5'-3')Primersequence擴增片段/bpAmpliconsize目的基因Targetregion引物濃度/(μmol·L-1)PrimerconcentrationMDVF:AGGTGACACTATAGAATAAGGGAGCAGACGTACTATGTAGACAAR:GTACGACTCACTATAGGGATGGTAAGCAGTCCAAGGGTCA227meq0.16ALV-AF:AGGTGACACTATAGAATACAAGGGGTTCCTTGGTATCTR:GTACGACTCACTATAGGGATGTGCCTATCCGCTGTCA155gp850.2ALV-BF:AGGTGACACTATAGAATATCAATCACGATTCTCCCACCR:GTACGACTCACTATAGGGATGTGACGCTTCGTTTACGTCTT285gp850.2ALV-JF:AGGTGACACTATAGAATACTGATGCAACAACCAGGAAAR:GTACGACTCACTATAGGGAGCAGTGACATTAGTGACATACCC204gp850.2REVF:AGGTGACACTATAGAATAGACCAGGCGAGCAAAATCR:GTACGACTCACTATAGGGAGGTGTAATAGGTAGGTATGGAGGA182gp900.2IBDVF:AGGTGACACTATAGAATAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTR:GTACGACTCACTATAGGGATCTGTCAGTTCACTCAGGCTTC294VP20.2CIAVF:AGGTGACACTATAGAATAAAAGGCGAACAACCGATGAR:GTACGACTCACTATAGGGATGCCCTGGAGGAAAAGACC269VP10.2ARVF:AGGTGACACTATAGAATAGGACCCCTACTTCTGTTCTCAR:GTACGACTCACTATAGGGAATTTCCCGTGGACGACAT215S10.16

F.上游引物；R.下游引物；帶下劃線的為通用引物，嵌合引物由通用引物和特異性引物一起合成組成

F.Forward primer；R.Reverse primer；Universal tag sequences are underlined.Chimeric primers were synthesised using universal tags and specific primers

1.9模擬混合感染和干擾試驗

為了測試建立的多重GeXP-PCR方法應用于臨床時的準確性和敏感性，將經過病毒分離和測序鑒定確診為免疫抑制病病毒感染的病雞組織器官樣品：胸腺、法氏囊、骨髓、肝和血液隨機組合并以任意比例混合，抽提總DNA/RNA，按照建立的多重GeXP-PCR方法流程進行檢測。

為了測試不同模板之間的濃度差異較大時，不同濃度的模板對建立的多重GeXP-PCR方法引物擴增效率的影響和是否仍能敏感的檢測到低濃度的模板，使用不同濃度的陽性毒株核酸(最高模板濃度至少是最低模板濃度的104倍)隨機組合為模板進行多重GeXP-PCR，并以單一模板為對照進行多重GeXP-PCR。如隨機挑選了ALV-J、MDV和CIAV作為組合。先以探針法熒光定量PCR測定模板濃度，調整模板終濃度依次為107、102和103copies·20 μL-1進行多重GeXP-PCR，同時分別以相同濃度的ALV-J和MDV為單一模板進行多重GeXP-PCR。

1.10應用建立的多重PCR方法檢測臨床樣品

采集病死雞的胸腺、法氏囊、骨髓、脾、肝和血液，混合勻漿后抽提總DNA/RNA，按照建立的多重GeXP-PCR方法進行檢測。同時以本研究設計的特異性引物進行SYBR GreenⅠ定量PCR，并將PCR產物克隆測序，驗證陽性結果。

2　結　果

2.1特異性試驗

經過體系優化，最終嵌合引物的比例和濃度見表2。應用建立的多重GeXP-PCR方法，以表1中所列毒株為模板進行單一模板特異性試驗，經過GeXP電泳，均得到特異性單峰，圖1A～H所示為單一模板電泳圖，片段大小與引物設計預期相符；進行多模板特異性試驗，經過GeXP電泳，同時得到8個特異性單峰；以表1中其他禽病原體和SPF健康雞組織核酸為模板，無擴增片段。單重模板、多重模板均無非特異擴增峰，見圖1。

多重GeXP-PCR的單一模板特異性試驗：A.ALV-A，155.38 bp；B.ALV-B，284.65 bp；C.ALV-J，204.55 bp；D.MDV，227.35 bp；E.REV，182.64 bp；F.CIAV，268.61 bp；G.ARV，215.83 bp；H.IBDV，294.27 bp；多重GeXP-PCR的多重模板特異性試驗：I.6種病毒，8個特異性片段依次為ALV-A，155.80 bp；REV，182.67 bp；ALV-J，204.50 bp；ARV，215.75 bp；MDV，227.16 bp；CIAV，268.59 bp；ALV-B，285.09 bp；IBDV，294.02 bp；J.陰性對照以其他禽病原體和SPF雞組織核酸為模板，單峰為markerThe GeXP-multiplex PCR assay was performed using a single template and mixed primers for the following：A.ALV-A，155.38 bp；B.ALV-B，284.65 bp；C.ALV-J，204.55 bp；D.MDV，227.35 bp；E.REV，182.64 bp；F.CIAV，268.61 bp；G.ARV，215.83 bp；H.IBDV，294.27 bp；I.The GeXP-multiplex PCR assay was performed using mixed templates and mixed primers for the following：8 single products：ALV-A，155.80 bp；REV，182.67 bp；ALV-J，204.50 bp；ARV，215.75 bp；MDV，227.16 bp；CIAV，268.59 bp；ALV-B，285.09 bp；IBDV，294.02 bp；J.Negative control was performed using nucleic acid of others avian viruses and SPF chicken，signal was marker圖1　多重GeXP-PCR特異性試驗經GeXP電泳結果Fig.1　Specificity of GeXP-multiplex PCR assay

2.2敏感性試驗

應用建立的多重GeXP-PCR方法進行敏感性試驗，使用構建的DNA質粒或ssRNA為單一模板時，ALV-A、ALV-J、REV、CIAV和ARV的最低檢測值為10 copies·20 μL-1；MDV、 ALV-B和IBDV為102copies·20 μL-1。6種病毒8個目的基因的質粒和ssRNA等比例混合時，每個目的基因的最低檢測值均為102copies·20 μL-1。圖2所示為多重GeXP-PCR多重模板，每種模板分別為105copies·20 μL-1(A)，104copies·20 μL-1(B)，103copies·20 μL-1(C)和102copies·20 μL-1(D)的電泳結果。

使用構建的DNA質粒和ssRNA為模板進行多重GeXP-PCR方法，每個反應每種模板分別為A.105 copies·20 μL-1；B.104 copies·20 μL-1；C.103 copies·20 μL-1；D.102 copies·20 μL-1The GeXP-multiplex PCR assay was performed using equal amounts of specific DNA-containing plasmid template and in vitro transcribed ssRNA corresponding to 6 immunosuppressive viruses，8 templates at concentrations：A.105 copies·20 μL-1，B.104 copies·20 μL-1，C.103 copies·20 μL-1，D.102 copies·20 μL-1圖2　多重PCR敏感性試驗GeXP電泳結果Fig.2　Sensitivity of GeXP-multiplex PCR assay

2.3模擬混合感染和干擾試驗

將確診為免疫抑制病病毒陽性的病料隨機混合，應用建立的多重GeXP-PCR方法進行檢測，得到與預期相符合特異性單峰，圖3所示為隨機混合ARV 和IBDV，ALV-J和ALV-B以及6種病毒病料混合的電泳結果。將構建的DNA質粒和ssRNA按照ALV-J 107copies·20 μL-1，MDV 102copies·20 μL-1和CIAV 103copies·20 μL-1為反應體系終濃度的比例混合，應用建立的多重GeXP-PCR方法進行檢測，同時分別以同一濃度的單一模板為對照，結果顯示，當不同模板的濃度懸殊時，仍能準確敏感地檢測出低濃度的模板，并且多重模板和單一模板的產物濃度相差不大，如圖4所示。

2.4臨床樣品檢測

300份臨床樣品檢測結果見表3。同時使用本研究中設計的特異性引物進行單重SYBR GreenⅠ定量PCR檢測臨床樣品，將PCR產物克隆測序，并與建立的多重GeXP-PCR對比檢測結果。結果顯示，應用建立的多重GeXP-PCR結果與定量PCR結果相符，并且測序結果顯示陽性結果均為對應的病毒。300份臨床樣品中，190份樣品檢測結果為陽性，其中單重感染119份，ALV-A 6份，ALV-B 2份，ALV-J 21份，MDV 26份，REV 15份，IBDV 17份，CIAV 9份和ARV 23份；混合感染71份：MDV+ALV-A 4份，MDV+ALV-J 25份，ALV-B+ALV-J 1份，MDV+ALV-J+REV 6份，MDV+CIAV 5份，MDV+REV 6份，ALV-J+REV 3份，IBDV+ALV-J 5份，MDV+CIAV+ALV-J 4份，REV+ARV 3份，ALV-J+ARV 6份，ALV-J+IBDV 3份。

將ARV和 IBDV，ALV-J 和ALV-B，以及6種免疫抑制病病毒的病料為模板，模擬混合感染情況：A.ARV和 IBDV；B.ALV-J 和ALV-B；C.6種免疫抑制病病毒The GeXP-multiplex PCR assay was performed using artificially mixed templates and mixed primers for ARV and IBDV，ALV-J and ALV-B，or 6 immunosuppressive viruses：A.ARV and IBDV；B.ALV-J and ALV-B；C.6 immunosuppressive viruses圖3　多重PCR模擬混合感染的GeXP電泳結果Fig.3　Artificially mixed templates for the GeXP-multiplex PCR assay

A.ALV-J 107 copies·20 μL-1，MDV 102 copies·20 μL-1 和CIAV 103 copies·20 μL-1的反應體系終濃度的比例混合為模板進行多重GeXP-PCR檢測；B.以MDV 102 copies·20 μL-1的濃度為模板進行多重GeXP-PCR檢測；C.以ALV-J 107 copies·20 μL-1的濃度為模板進行多重GeXP-PCR檢測A.The GeXP-multiplex PCR assay was performed using templates for ALV-J 107 copies·20 μL-1，MDV 102 copies·20 μL-1 and CIAV 103 copies·20 μL-1；B.MDV 102 copies·20 μL-1；C.ALV-J 107 copies·20 μL-1圖4　干擾試驗多重PCR反應經GeXP電泳結果Fig.4　GeXP-multiplex PCR interference assays

表3臨床樣品檢測結果

Table 3Detection results for clinical specimens

單重感染SingleinfectionMDVALV-AALV-BALV-JREVIBDVCIAVARVMDV+ALV-AMDV+ALV-JALV-B+ALV-J數量Number2.6622115179234251比例/%Rate8.72.00.77.05.05.73.07.71.38.30.4定量PCR結果Real-timePCRresults26622115179234251測序結果Sequencingresults26622115179234251混合感染Co-infectionMDV+ALV-J+REVMDV+CIAVMDV+REVALV-J+REVIBDV+ALV-JMDV+CIAV+ALV-JREV+ARVALV-J+ARVALV-J+IBDV數量Number656354363比例/%Rate2.01.62.01.51.61.31.02.01.0定量PCR結果Real-timePCRresults656354363測序結果Sequencingresults656354363

3　討　論

MDV、ALV (以ALV-A/B/J為主)、REV、IBDV、CIAV 和ARV是引起雞免疫抑制的主要幾種病原，并且常常發生混合感染，給診斷帶來極大的難度[11-12，21]。傳統的分子生物學檢測方法存在比較耗時和每個反應檢測項目少的限制，常規的PCR或定量PCR往往每個反應只能檢測2～4種病原。

基于GeXP多基因表達分析系統的多重PCR方法，以其優越的特異性，敏感性和高通量為同時鑒別診斷以上幾種病原提供了解決方案[22-23]。首先，利用嵌合引物和通用引物組合的3步法的PCR擴增程序為多重PCR提高了特異性和大大降低引物間互相干擾擴增效率的影響。第一步10個循環的PCR擴增是由嵌合引物中的特異性引物部分引發，特異性引物結合在目的基因上引發原始擴增，同時通用引物經過特別設計不會與常見的生物序列結合，故不會出現通用引物引發的非特異性擴增；第二步10個循環是由嵌合引物引發，嵌合引物結合在之前10個循環的PCR產物的兩端，繼續進行指數型擴增，由于這一步的退火溫度比第一步高13 ℃，特異性引物部分不會再結合到原始模板上，保證了嵌合引物整體結合在前10個循環的PCR產物上；第三步10個循環主要是通用引物介導的所有PCR產物的同步擴增，通用引物結合在含有通用引物序列的PCR產物上，最大化降低由于不同特異性引物混合對擴增效率的影響，使所有的PCR產物都得到幾乎相同的擴增效率，避免在檢測臨床樣品時，某種病毒載量較低時導致假陰性。

其次，建立的多重GeXP-PCR方法具優良的敏感性。多重PCR擴增后，PCR產物經過毛細管電泳辨認產物片段大小，結果與預期片段大小相差1 bp內可判斷為陽性結果，如ALV-A的預期PCR產物片段大小為155 bp，若得到的PCR產物含有154～156 bp的片段，即可認為ALV-A檢測結果為陽性。GeXP毛細管電泳后，經過軟件分析，PCR產物以單峰形式呈現，單峰峰值2 000熒光單位(absorbance units，A.U.)以上為陽性擴增。本研究的敏感性試驗中，多重模板的最低檢測水平為每種模板100 copies·20 μL-1反應體系，最小的峰值為9 000 A.U.，遠遠高于陽性閾值，說明建立的多重GeXP -PCR方法具有優良的敏感性。

再次，建立的多重GeXP-PCR方法具高通量的優點[16]。GeXP能辨認110～400 bp范圍內的PCR片段，只要兩個目的片段之間相差7～10 bp即可分辨，故每個反應可檢測20個以上目的基因；應用嵌合引物和通用引物的多重PCR，一個反應也可以同時檢測8個以上目的基因[14，23-25]，比傳統的多重PCR或多重定量PCR每個反應檢測目的基因數目多一倍以上[26-27]。檢測一份樣品，只需抽提一次，PCR加樣一次，電泳一次，即可得到8種以上目的基因的檢測結果。一個電泳上樣板為96孔板，操作一次GeXP即可檢測96份樣品。這在進行大規模檢測或流行病學調查時，尤其凸顯其高通量的優勢。

應用建立的多重GeXP-PCR方法檢測300份臨床樣品，同時用本研究設計的特異性引物進行單重定量PCR檢測，PCR產物測序驗證陽性結果的準確性為100%。同時經過不斷的流行病學調查，我們也發現病毒不斷處于變異的狀態，故一套多重GeXP-PCR體系將不能長期滿足臨床檢測的需求，需要不斷更新病毒序列信息，設計更多的引物來達到應對病毒不斷變異的要求。

在實際操作中，MDV和 CIAV 是DNA病毒，ALV (以ALV-A/B/J為主)、REV、IBDV和ARV是RNA病毒，故使用RNA/DNA共提試劑盒進行核酸提取，再進行反轉錄，使用的反轉錄試劑盒對核酸中的DNA成分無影響。同時ALV和REV屬于逆轉錄病毒，抽提的DNA中也含有病毒基因組逆轉錄嵌入宿主基因組的前病毒DNA，故進行多重PCR檢測時，是同時以ALV和REV的基因組RNA和前病毒DNA為模板。

4　結　論

本研究建立的基于GeXP多基因表達分析系統的多重PCR方法，能夠特異、敏感和高通量的鑒別檢測6種雞免疫抑制病病毒，可以成為臨床鑒別診斷和流行病學調查時的有力工具。

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(編輯白永平)

Simultaneous Detecting Six Immunosuppressive Chicken Viruses by a GeXP Analyser-based Multiplex PCR Assay

ZENG Ting-ting，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，LUO Si-si，HUANG Li，HUANG Jiao-ling

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandDiagnostics，

The objective of this research was to develop a novel，high-throughput Genome Lab Gene Expression Profiler Analyser-based multiplex PCR method (GeXP-multiplex PCR) for simultaneous detection of 6 immunosuppressive chicken viruses.Using chimeric primers，6 immunosuppressive chicken viruses，including Marek’s disease virus (MDV)，three subgroups of avian leucosis virus (ALV-A/B/J)，reticuloendotheliosis virus (REV)，infectious bursal disease virus (IBDV)，chicken infectious anaemia virus (CIAV) and avian reovirus (ARV) were amplified and identified by their respective amplicon sizes.The concentration of the chimeric primers，Mg2+andTaq，and annealing temperature，and time were optimised according to the amplification efficiency of the GeXP-multiplex PCR assay.The assay specificity for each immunosuppressive viral target was individually and simultaneously tested with a mixture of 8 sets of chimeric primers in a multiplex PCR assay.Plasmid DNA and transcribed ssRNA were diluted to a final concentration ranging from 105copies·20 μL-1to 1 copy·20 μL-1and then subjected to the GeXP-multiplex PCR assay with 8 sets of chimeric primers，both individually and in pre-mixed solutions.A total of 300 clinic specimens of disease chicken were detected by using GeXP-multiplex PCR.The results were confirmed using independent real-time PCR and sequencing to determine true positives.The specificity and sensitivity of the optimised GeXP-multiplex PCR assay were evaluated，and the data demonstrated that this technique could selectively amplify these 6 viruses at a sensitivity of 100 copies·20 μL-1when all 6 viruses were present.Of the 300 examined clinical specimens，190 were positive for immunosuppressive viruses according to the GeXP-multiplex PCR assay.The GeXP-multiplex PCR assay is a high-throughput，sensitive and specific method for the detection of 6 immunosuppressive viruses that can be used for differential diagnosis and molecular epidemiologic surveys.

GeXP analyser；multiplex PCR；high-throughput；chicken immunosuppressive viruses

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.015

2015-09-29

國家自然科學基金(31160512)；廣西自然科學基金(2014GXNSFCA118006)；廣西特聘專家專項基金 (2011B020)；廣西水產畜牧獸醫局科技項目(桂漁牧科201452003；201528013)

曾婷婷(1986-)，廣西合浦人，碩士，助理研究員，主要從事禽病原分子生物學研究，E-mail：tingtingzeng1986@163.com

謝芝勛，研究員，廣西特聘專家，E-mail：xiezhixun@126.com

S858.315.3

A

0366-6964(2016)06-1198-11