BMPR-IB基因的克隆及其在絨山羊成纖維細胞中的表達

孫洪新，王紅娜，張英杰*，劉月琴，陳曉勇，敦偉濤

(1.河北農業大學動物科技學院，保定 071001； 2.河北省畜牧獸醫研究所，保定 071000)

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BMPR-IB基因的克隆及其在絨山羊成纖維細胞中的表達

孫洪新1，2，王紅娜1，張英杰1*，劉月琴1，陳曉勇2，敦偉濤2

(1.河北農業大學動物科技學院，保定 071001； 2.河北省畜牧獸醫研究所，保定 071000)

本研究旨在克隆BB基因型小尾寒羊的BMPR-IB基因編碼區，構建重組載體，瞬時轉染絨山羊成纖維細胞，并對BMPR-IB等基因的表達情況進行檢測。采用 RT-PCR方法擴增BMPR-IB基因完整編碼區，構建真核表達載體pEGFP-BMPR-IB，經脂質體Lipofectamine LTX&PLUS介導轉染絨山羊成纖維細胞，并分別于轉染后48和72 h收集細胞，分別提取RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot方法檢測相關基因的表達情況。結果擴增得到了包含BMPR-IB基因完整編碼區全長在內的1 550 bp片段，與已知序列高度同源；Real-time PCR檢測結果均表明，轉基因組細胞中BMPR-IB表達量顯著高于空白對照組(P<0.01)，IGF-Ⅰ基因表達量也顯著上調(P<0.01)，TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因的表達量顯著降低(P<0.01)；Western blot檢測表明，轉染組BMPR-IB、IGF-I的表達有所增加，BMP4、TLR4的表達略有降低，但差異均不顯著(P>0.05)。本研究成功實現了小尾寒羊BMPR-IB基因在山羊成纖維細胞中的表達，為轉BMPR-IB基因陽性細胞株和細胞系的建立提供了基礎；研究表明BMPR-IB(BB型)基因的過表達能上調IGF-Ⅰ基因的表達，下調TLR4基因的表達。

BMPR-IB基因；真核表達載體；絨山羊成纖維細胞；表達

FecB基因最早是在澳大利亞Booroola羊中發現的一個與高繁殖率相關的主效基因，能顯著提高羊的繁殖率。后來的研究證明FecB基因的本質為骨形態蛋白Ⅰ型受體基因(Bone morphogenetic protein receptor-IB，BMPR-IB)。BMPR-IB基因屬于轉移生長因子β亞基(TGF-β)受體家族成員，存在于許多細胞類型中，是調節生長和分化的多功能蛋白[1]。該基因編碼區由10個外顯子組成，共1 509 bp，編碼502個氨基酸[2-3]，在生殖器官中，BMPR-IB可能是參與聯結前列腺素通路和下游前列腺素作用的平行通路[4]。

2001年，3個研究小組幾乎同時發現在Booroola綿羊BMPR-IB基因編碼區第746位上發生了A→G置換，使受體細胞內激酶區編碼蛋白由野生型的谷胺酰氨變為精氨酸(Q249R)，正是這個突變 (Q249R)與Booroola母羊高繁殖力完全相關[2-3，5]。激酶區3亞區的突變改變了Smads的表達和磷酸化，導致了Booroola羊表現出大量小的有腔卵泡早熟和排卵率提高[2]。P.Mulsant等[3]通過研究重組GDF5和BMP4在體外對顆粒細胞分化和孕酮分泌的影響，發現BMPR-IB基因(A746G)突變減少了小型有腔卵泡的分化活性；BMP4對野生型(++)綿羊顆粒細胞的促分化作用比對突變型(BB)有所增強；BB型母羊顆粒細胞對GDF5和BMP4的敏感性明顯低于++型母羊的顆粒細胞。這說明BB型母羊的Q249R突變致使BMPR-IB基因部分失活，對顆粒細胞生成的抑制作用減弱，因此顆粒細胞可進一步分化，排卵卵泡進一步成熟，表現為排卵數的增加，進而提高綿羊的排卵率和繁殖力。

研究表明，BMPR-IB基因編碼區的A746G突變對Booroola Merino羊(澳大利亞)、Javanese綿羊(印度尼西亞)、Garole綿羊(印度)以及中國的湖羊、小尾寒羊和中國美利奴羊多胎品系等的排卵數或產羔數都有顯著影響[6-9]，該基因作為影響綿羊產羔數的主效基因，可用于對綿羊產羔數的選擇[10]。目前，該基因已被用于小尾寒羊、湖羊等品種的純種選育及其與引進品種雜交育種中多胎的輔助選擇的標記基因，如寒泊羊、魯西黑頭杜泊羊等種群的選育[11-12]。

除了綿羊，國內還開展了多個山羊品種BMPR-IB基因多態性研究，但迄今未見在山羊中存在BMPR-IB基因A746G突變的報道。如李麗萍[13]、儲明星[14]、孟麗娜[15]、李文楊[16]等分別對云嶺黑山羊、濟寧青山羊、河北絨山羊、美姑黑山羊、承德黑山羊和河南槐山羊、崇明白山羊、徐淮山羊、奶山羊、努比山羊、戴云山羊、閩東山羊、福清山羊和南江黃羊等品種的BMPR-IB基因多態性進行了檢測，均未檢測到A746G突變。在轉基因方面，于振興等[17]獲得了轉湖羊FecB基因的新疆細毛羊陽性細胞株。李新秀[18]研究了沉默BMPR-IB基因對豬卵巢顆粒細胞凋亡及BMP通路上相關基因表達的影響。而有關該基因在山羊細胞中的表達情況未見報道。本研究旨在克隆BB型小尾寒羊BMPR-IB基因完整編碼區序列，構建重組真核表達載體 pEGFP-BMPR-IB，瞬時轉染絨山羊成纖維細胞，對其中BMPR-IB基因及與繁殖、免疫、生長發育等相關基因的表達情況進行檢測，為進一步研究BMPR-IB基因的功能和轉基因優質肉羊品種培育提供基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1細胞培養用組織及采樣方法自河北易縣絨山羊場采集7日齡遼寧絨山羊耳組織。用剃須刀除凈耳邊緣部耳毛，碘酒、酒精(脫碘)消毒干凈后，用消過毒的耳號鉗快速剪下耳邊緣組織塊，在盛有酒精的小燒杯中涮洗30 s，最后用含雙抗(250 U·mL-1青霉素和250 U·mL-1鏈霉素)的無菌生理鹽水沖洗2～3遍后，將組織塊浸泡入裝有含雙抗的PBS溶液1.5 mL離心管中，用封口膜封口，4℃保存，3～4 h 送回實驗室。

1.1.2藥品試劑pEGFP-N2質粒為本實驗室保存，限制性核酸內切酶購自TaKaRa公司，膠回收純化試劑盒購自上海生工公司，質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。基因組提取試劑盒和大腸桿菌DH5a購自全式金生物技術有限公司。DMEM/F12購自 Hyclone，胎牛血清購自GIBCO公司，脂質體Lipofectamine LTX & PLUS Reagent購自Invitrogen公司，細胞培養瓶、6孔板購自CORNING公司。熒光定量用SYBR Green購自東洋紡生物科技有限公司。Western blot用抗體分別購自Eterlife 和Santa公司。

1.2試驗方法

1.2.1卵巢組織的采集、RNA提取及反轉錄在唐縣肉羊養殖開發中心，選取已知BMPR-IB基因型為 BB型(突變型)的小尾寒羊進行屠宰，采集卵巢，于液氮保存，帶回實驗室，用Trizol法提取總RNA，利用全式金公司反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA。

1.2.2BMPR-IB基因CDS區的擴增根據GenBank中公布的序列(GI：AF357007)，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并根據該序列編碼區和pEGFP-N2質粒多克隆位點的限制性內切酶酶切位點分析比對結果，在引物5′端分別添加BamH I和EcoR I限制性內切酶酶切位點和保護堿基，用于擴增BMPR-IB基因編碼區序列。引物序列：上游：5′-CgCGGATCCAAACAAgCAAgCCTgTCATAC -3′(下劃線處為BamH I酶切位點)，下游：5′-CCggAATTCgAgCTTAATGTCCTGGGACTCT-3′(下劃線處為EcoR I 酶切位點)。

PCR擴增反應體系為25 μL：buffer 3.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物 1.0 μL，LA Taq 0.3 μL (1.5U)，cDNA 1.0 μL，ddH2O 15.7 μL。預期擴增產物長度大小約為1 550 bp。 擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 95 s，5個循環；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 95 s，30個循環；72 ℃ 10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。

1.2.3pEGFP-BMPR-IB表達載體的構建分別取pEGFP-N2質粒和上述PCR產物各40 μL，分別加入10×M Buffer 12 μL，BamH I 和EcoR I各6 μL，ddH2O 36 μL組成100 μL體系，37 ℃水浴6 h，進行雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳酶切產物，膠回收BMPR-IB片段和pEGFP-N2骨架片段，用T4連接酶進行16 ℃過夜連接，轉化E.coliDH5α感受態細胞，涂具有卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃培養過夜，篩選陽性克隆，搖菌，提取質粒，進行酶切和測序鑒定。對雙酶切和測序均正確的菌液，進行質粒中提，測定濃度后備用，獲得的重組真核表達載體命名為pEGFP-BMPR-IB。

1.2.4耳組織成纖維細胞的培養遼寧絨山羊耳組織成纖維細胞的培養采用組織塊法進行。具體方法見參考文獻[19]。將絨山羊耳緣組織在無菌條件下用PBS洗滌2～3次后，用眼科剪刀將組織剪成為1 mm3左右的小塊，用黃色滅菌槍頭將其放入25 mL培養瓶中。按每塊間隔0.3～0.5 cm放置貼于培養瓶中，倒置在37 ℃，5% CO2的培養箱中，待組織塊周圍開始變干(約3～4 h)緩慢加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養液浸潤組織塊后翻轉培養瓶，進行過夜培養。培養6～7 d后，開始有細胞長出，待細胞長成致密單層后，用0.25%胰酶消化，待大部分細胞變圓時，加培養液終止消化，并反復吹打，只收集脫壁細胞。鑒于成纖維細胞消化脫壁比上皮細胞快，在前3代傳代經酶消化，待細胞剛變圓即終止消化，可得到純化的成纖維細胞。細胞生長至70%～80%匯合狀態時即可冷凍保存，以備基因轉染使用。

1.2.5細胞轉染細胞轉染利用 Lipofectamine LTX & PLUS Reagent試劑盒進行。轉染前將生長狀態良好的G4代絨山羊耳組織成纖維細胞分別接種到6孔板中，密度為1×105個·mL-1，進行常規培養，待細胞長到70%～80% 匯合時，在脂質體介導下，用重組質粒pEGFP-BMPR-IB進行細胞轉染。根據轉染試劑說明進行轉染。取125 μL雙無細胞培養液，加入2.5 μg pEGFP-BMPR-IB質粒，加入3 μL PLUS，輕輕混勻后備用，另取125 μL細胞培養液稀釋12 μL 脂質體。將上兩種稀釋液輕輕混合后在室溫下孵育5 min形成復合物(此為6孔板每孔用量)。將上述復合物加入6孔培養板中，輕輕搖動混勻。在37 ℃、5% CO2條件下培養6 h后，更換為含10% FBS的DMEMF12培養液。轉染后12 h開始利用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP表達情況。以未轉染的細胞作為空白對照，分別于轉染后48和72 h后收集細胞，進行RNA和蛋白提取。

1.2.6RT-PCR檢測轉染山羊細胞中有關基因表達轉染48 h后，分別收集試驗組和空白組細胞，利用Trizol提取總RNA，按 Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行逆轉錄，以GAPDH作為內參對照，利用Real-time PCR對BMPR-IB等基因的表達量進行檢測，檢測基因及所用引物見表1。

表1實時熒光定量所用引物

Table 1Primers used in real-time fluorescence quantitative PCR

基因Gene序列號Accession引物序列(5'-3')PrimersequenceTm值/℃Annealingtemperature片段長度/bpLengthofproductsGAPDHJF825527CAAGTTCCACGGCACAGTCACTCAGCACCAGCATCACCC59.8061.90118BMPR-IBDQ666418CGAATGAAGTTGACATACCACTCGTAAGAGGGGTCACTGG67.5067.30232BMP4EF632080GCTTCCACCACGAAGAACATCACCTCATTCTCTGGGATGC60.1260.62101GDF5XM_005688496TCCAGACCCTGATGAACTCCCAGAGGCCAGTGTTGCTACC60.0560.85176INHXM_005692605CTGGACTCTTTGGCATCACCTGTGTGGTTTCTCACGAACG60.6660.76116IGF-ID11378TCAGCAGTCTTCCAACCCAAAAGGCGAGCAAGCACAGG63.7056.80118MHCAB008346GCCAAGGGCAACGCACAGACTCCTCGTTCAGGGCGATGTAAT60.1064.00188IFNM73244CAGTCGCTGTATCCCTTCTCCGCTTCAACCTCTTCCACA59.8057.60227PNRPJF729302ATGTGGAGTGACGTGGGCGAGGTGGATAGCGGTTGC59.6059.60115TRL4JF825527GTTTCCACAAGAGCCGTAATCCTGTTCAGAAGGCGATA55.4055.40198

Real-time PCR的反應體系為20 μL：SYBR qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，ROX 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，H2O 7.4 μL。Real-time PCR程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。自動生成Ct值，以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法對結果進行校正，各基因的相對表達量重復3次，取平均值。其中ΔCtl=轉染后的Ct值-對應內參Ct值，ΔCt2=空白組的Ct值-對應內參Ct值，ΔΔCt=ΔCtl-ΔCt2，2-ΔΔCt值為轉染后較空白組各基因表達量的倍數。

1.2.7Western blot檢測山羊細胞中相關基因的表達轉染72 h后收集細胞，制備裂解液，4℃離心取上清提取蛋白，測定濃度后使用Western blot方法檢測蛋白表達情況。利用Total Lab Quant軟件讀出樣品和內參的灰度值，按蛋白表達量=目的灰度數值/內參灰度數值，對蛋白表達情況進行分析統計。1.2.8數據分析基因表達試驗數據用Excel和 GraphPad軟件進行分析，每個處理做3個重復。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結　果

2.1BMPR-IB基因的RT-PCR

以反轉錄獲得的cDNA為模板，用PCR技術擴增目的基因，PCR 產物經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在1.5和 2 kb之間有特異性條帶，約1 550 bp，與預期條帶大小一致(圖 1)，條帶明亮清晰，可用于后續試驗。

1～3.PCR產物；M.DNA相對分子質量標準1-3. PCR products; M. Marker DL2000圖1　PCR產物電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR products

2.2重組表達載體pEGFP-BMPR-IB的構建及鑒定

將經BamH I和EcoR I雙酶切后的目的片段與pEGFP-N2線性化片段用T4連接酶進行過夜連接后轉化培養，隨機挑取10個克隆進行PCR檢測，對陽性克隆菌液進行擴大培養，提取質粒后用BamH I和EcoR I進行雙酶切，對酶切產物進行電泳，結果產生了長約1.5和4.7 kb的兩條帶，與預期的片段長度一致(圖2)。對雙酶切正確的質粒樣品進行測序，結果發現，酶切較短片段長度為1 550 bp，該片段包含BMPR-IB基因完整編碼區，經 BLAST比對發現，除A746G外，序列與已知綿羊BMPR-IB編碼區序列一致。表明BMPR-IB基因已成功克隆入pEGFP-N2質粒的MCS區，pEGFP-BMPR-IB載體構建成功，重組質粒圖譜見圖3。

2.3細胞轉染

使用Lipofectamine LTX & PLUS Reagent試劑盒進行細胞轉染。更換培養液培養12 h后，在倒置顯微鏡下觀察，細胞生長狀態良好，轉染24 h后有少量綠色熒光，轉染48 h后熒光有所增加，轉染72 h后呈現熒光細胞數最多。表明所克隆基因可以和報告基因融合表達。

1～2.雙酶切產物；M.DNA相對分子質量標準1-2.The double digestion products; M. Marker DL5000圖2　pEGFP-BMPR-IB的雙酶切鑒定Fig.2　Identification of pEGFP-BMPR-IB digested by BamHⅠ and EcoRⅠ

圖3　重組pEGFP-BMPR-IB質粒圖譜Fig.3　Vector map of recombinant plasmid

A.未轉染；B.轉染24 h； C.轉染48 h；D.轉染72 hA.Control; B. Transfection for 24 hours; C. Transfection for 48 hours; D. Transfection for 72 hours圖4　pEGFP-BMPR-IB轉染山羊成纖維細胞 100×Fig.4　The transfection of pEGFP-BMPR-IB into goat fibroblast cells 100×

2.4轉染pEGFP-BMPR-IB山羊成纖維細胞相關基因mRNA表達水平

利用實時熒光定量PCR方法對轉染48 h后遼寧絨山羊成纖維細胞中BMPR-IB基因的表達量進行檢測。以未轉染細胞組做為空白(對照組)，以GAPDH做為內參基因。定量結果表明，轉染后BMPR-IB表達量有所增加。當Lipofectamine LTX用量為12 μL，質粒用量為2.5 μg，PLUS用量為3 μL時，試驗組BMPR-IBmRNA的表達量顯著高于未轉染組(P<0.01)(圖5)。

圖5　相關基因mRNA相對表達量的變化Fig.5　The relative expression change of different genes

以GAPDH做為內參基因，利用實時熒光定量方法分別對未轉染和pEGFP-BMPR-IB質粒瞬時轉染遼寧絨山羊成纖維細胞中BMP4、GDF5、INH、IGF-I、TLR4、IFN、MHC和PNRP基因的表達情況進行檢測，結果，轉染組IGF-I基因表達量顯著高于空白組(P<0.01)；BMP4基因表達量基本無變化(P>0.05)， 轉染組GDF5、INH、TLR4、IFN、MHC、PNRP基因表達量顯著低于空白組(P<0.01)(圖5)。

2.5pEGFP-BMPR-IB轉染山羊成纖維細胞中相關基因蛋白水平的表達

轉染72 h后分別收集空白對照和轉染細胞，提取蛋白后，分別利用Western blot方法對BMPR-IB、IGF-I、BMP4和TLR4蛋白的表達情況進行檢測，結果見圖6、圖7。

圖6　相關蛋白表達情況Fig.6　The expression of different proteins

圖7　部分蛋白相對表達量的變化Fig.7　The relative expression change of different proteins

由圖6、7均可以看出，相對于空白對照組，瞬時轉染組BMPR-IB、IGF-I的表達均有所升高但差異均不顯著(P>0.05)，BMP4和TLR4的表達略有降低，差異也不顯著(P>0.05)。

綜合看，轉染組和未轉染租BMPR-IB、IGF-I、BMP4和TLR4的mRNA和蛋白水平表達趨勢基本趨于一致。

3　討　論

本研究采用分子克隆技術，通過在上、下游引物兩端分別引入BamH I和EcoR I酶切位點以及保護堿基進行擴增，直接對RT-PCR產物和pEGFP-N2質粒進行BamH I和EcoR I雙酶切、回收，用T4連接酶進行16 ℃過夜連接、轉化、克隆、酶切及測序鑒定構建載體，相比于克隆目的基因后，再進行酶切、連接，構建載體省時省力；PCR擴增和雙酶切產物電泳及測序后均證實重組真核表達載體 pEGFP-BMPR-IB構建成功。

試驗過程中利用組織塊貼壁法進行遼寧絨山羊耳組織成纖維細胞培養，根據上皮樣細胞與成纖維細胞對胰酶消化敏感性的不同，采用低濃度胰蛋白酶作用分離純化成纖維細胞，經2～3次傳代得到了高純度的成纖維細胞，為后續細胞轉染研究提供了保障。

試驗將成功構建的重組pEGFP-BMPR-IB經Lipofectamine LTX & PLUS介導瞬時轉染絨山羊耳組織成纖維細胞，并分別提取RNA和蛋白對BMPR-IB等基因的表達情況進行了檢測，定量和蛋白檢測結果均表明，BMPR-IB表達量有所增加，成功實現了小尾寒羊BMPR-IB(BB型)基因在山羊成纖維細胞中的表達，為轉BMPR-IB基因陽性細胞株和細胞系的建立提供了基礎。

應用成纖維細胞進行核移植生產體細胞克隆動物具有許多優勢，但克隆中存在孕期流產率高、圍產期死亡率高、胎兒過度生長以及出生后生長異常等問題。甚至有些克隆動物在出生后不久死亡，并表現出某些器官發育異常。李世杰對成纖維細胞克隆新生死亡牛器官中的染色質修飾基因、類胰島素生長因子系統等22個對發育有重要作用的基因表達差異進行研究，認為它們的異常表達可能是造成克隆動物出生死亡和器官發育異常的原因[20]。瞬時轉染過表達BMPR-IB基因細胞中，繁殖、生長發育以及抗病基因的表達是否也存在異常呢？ IGF-I具有類似于胰島素樣的生物合成代謝功能，一方面可提高組織攝取葡萄糖的能力，另一方面抑制肝糖原的分解并促進肝糖原及肌糖原的合成，同時，IGF-I本身又是生長激素的介質，具有促進生長的作用。BMP4除作為形態發生過程的信號因子外，還能促進或維持有關組織的細胞分裂。而TLR4 作為TLRs家族成員之一，能夠識別革蘭陰性菌細胞壁成分中的脂多糖和脂磷壁酸，通過信號轉導，誘發炎癥因子(例如TNF-α、IL-1、IL-6)與Type I型IFN的產生[21]。TypeⅠ型 IFN可以在病毒復制的任何階段發揮作用，由于其在天然免疫與獲得性免疫中具有抗病毒的活性與調節功能，Ⅰ型IFN能夠通過調節NK細胞、T 細胞等重要的免疫細胞來發揮功能，是連接天然免疫和適應性免疫的橋梁，在抗病毒和其他型的感染與免疫方面具有重要的作用[22]。試驗分別對BMP4、GDF5、INH、IGF-I、TLR4、IFN、MHC和PNRP等的表達量進行檢測，發現轉染BMPR-IB基因后，IGF-I基因表達量顯著增加(P<0.01)；TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因表達量顯著降低(P<0.01)，表明BMPR-IB基因的過表達可上調IGF-I的表達，下調TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因的表達。轉染后細胞中生長發育相關IGF-I表達量的升高，免疫相關的TLR4、IFN、MHC和PNRP基因的表達降低，是否和體細胞克隆轉基因羊后代存在的體型大，先天免疫力低，抗病性差存在關聯，需進一步研究。

基因表達分為轉錄和翻譯兩個層面，即mRNA和蛋白水平。試驗中因未能找到合適的抗體，只對BMPR-IB、BMP4、IGF-I和TIR4基因的蛋白表達情況進行了檢測。真核基因表達的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔，而轉錄后又會有轉錄后加工，轉錄產物的降解、翻譯、翻譯后加工及修飾等幾個層面，所以轉錄水平和翻譯水平并不完全一致。本試驗中，未轉染組BMPR-IB、IGF-I和TLR4基因的mRNA和蛋白水平表達趨勢趨于一致，而BMP4基因mRNA和蛋白水平表達的變化剛好相反，可能是由于BMP4蛋白的表達還在增加中。

基因的表達受多種因素影響，BMPR-IB基因的過表達直接或間接通過某個途徑導致轉基因細胞中BMP4、GDF5、INH、IGF-I、TLR4、IFN、MHC和PNRP等基因表達的變化，其具體原因還需進一步研究。

4　結　論

本研究成功克隆了小尾寒羊BB型BMPR-IB(即FecB)基因完整編碼區，構建了重組表達載體pEGFP-BMPR-IB，并實現了其在山羊成纖維細胞中的表達，為轉BMPR-IB基因陽性細胞株和細胞系的建立提供了基礎；RT-PCR和Westen blotting檢測表明，BMPR-IB基因在山羊成纖維細胞中的表達能上調IGF-I和下調TLR4基因的表達，具體原因需進一步研究。

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(編輯郭云雁)

Cloning and Expression ofBMPR-IBGene in Cashmere Goat Fibroblast Cells

SUN Hong-xin1，2，WANG Hong-na1，ZHANG Ying-jie1*，LIU Yue-qin1，CHEN Xiao-yong2，DUN Wei-tao2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001，China；2.HebeiInstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，Baoding071000，China)

The research was conducted to cloneBMPR-IBgene coding sequence of the Small-tailed Han sheep with BB genotype，construct the recombinant eukaryotic expression vectorwhich was transiently transfected into cashmere goat fibroblast cells，and detect the expression ofBMPR-IBand other genes.TheBMPR-IBgene was amplified by RT-PCR and the eukaryotic expression vector pEGFP-BMPR-IB was constructed by cloningBMPR-IBgene fragments into the pEGFP-N2vector frame，which were followed by the transfer of recombinant plasmids into goat fibroblast cells by liposome Lipofectamine LTX&PLUS.After transfection for 48 and 72 h，transfection cells were collected to extract RNA and total protein.Real-time quantitative PCR and Western blot approachs were used to identify the expression level of target genes and other related genes.The results showed thatBMPR-IBgene which was amplified including CDS region was about 1 550 bp in length，and highly homologous with the published sequences.Real-time PCR detection results showed that the expression ofBMPR-IBgene in transgenic cells were significantly higher than that in control group (P<0.01).The expression level ofIGF-Igene in transfected cells were significantly higher than that in control group (P<0.01)，while the expression ofTLR4，IFN，MHC，PNRP，GDF5 andINHgenes were significantly lower (P<0.01).Western blot detection results showed that the expression of BMPR-IB and IGF-I in transgenic cells was higher than that in control group，although the expression of BMP4 and TLR4 decreased，the difference did not reach significant level (P>0.05).The result showed that expression vector ofBMPR-IBwas constructed successfully and the expression ofBMPR-IBgene in goat fibroblast cells was realized，which provide the basis for the preparation of positive cell strains，cell lines and transgenic animals.It is also concluded that the over-expression ofBMPR-IBgene up-regulates theIGF-Iexpression and down-regulates theTLR4 expression in transfected cells.

BMPR-IBgene；eukaryotic expression vector；cashmere goat fibroblast cells；expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.006

2015-11-05

國家肉羊產業技術體系資助項目(CARS-39)

孫洪新(1978-)，女，山東臨清人，高級畜牧師，博士生，主要從事羊遺傳繁育研究，E-mail：sdlqshx@126.com

張英杰，教授，博導，主要從事羊遺傳育種及營養研究，E-mail：zhangyingjie66@126.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2016)06-1124-09