GnRH主動免疫對公豬體內糞臭素代謝的影響

隨芬芬，韓興發，曹曉涵，杜小剛，孟風艷，儲明星，曾憲垠*

(1.四川農業大學生命科學學院原子能農業應用研究室，雅安 625014；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部畜禽遺傳資源與種質創新重點實驗室，北京 100193)

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GnRH主動免疫對公豬體內糞臭素代謝的影響

隨芬芬1，韓興發1，曹曉涵1，杜小剛1，孟風艷1，儲明星2，曾憲垠1*

(1.四川農業大學生命科學學院原子能農業應用研究室，雅安 625014；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部畜禽遺傳資源與種質創新重點實驗室，北京 100193)

旨在探討促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)主動免疫對公豬體內糞臭素代謝的影響。36只公豬隨機分為免疫組(10周齡時初免，18周齡加免)、手術去勢組(1周齡外科閹割)及完整對照組(不作任何處理)。應用ELISA檢測血清中睪酮、雌二醇及雄烯酮含量，采用高效液相色譜檢測脂肪中糞臭素、雄烯酮和血液中雄烯酮含量，熒光定量PCR檢測肝中糞臭素代謝相關基因mRNA表達量，ELISA檢測肝中糞臭素代謝相關蛋白表達。結果顯示，GnRH主動免疫后，血清睪酮濃度顯著下降(P<0.05)，睪丸嚴重萎縮。免疫組和手術組公豬血清中睪酮、雌二醇、雄烯酮濃度和脂肪中糞臭素、雄烯酮含量相似(P>0.05)，均顯著低于對照組(P<0.05)。免疫組公豬肝中CAR、COUP-TF1、CYP2E1、CYB5A、CYP2C49、GSTO2 mRNA表達變化與手術組相似(P>0.05)，均顯著高于對照組(P<0.05)；CYP2A19 mRNA表達量手術組顯著高于免疫組(P<0.05)，免疫組顯著高于對照組(P<0.05)；而PXR、SULT1A1 mRNA表達量在3組間無明顯差異(P>0.05)。免疫組公豬肝中CYP2A19、CYP2C49和GSTO2蛋白表達變化與手術組相似(P>0.05)，均顯著高于對照組(P<0.05)； CYP2E1和CYB5A蛋白表達量在手術組最高，對照組最低，免疫組介于兩組之間，與兩組均有顯著性差異(P<0.05)；而SULT1A1蛋白表達量在3組間無明顯差異(P>0.05)。綜上表明，GnRH主動免疫降低公豬血清中睪酮、雌二醇和雄烯酮含量，上調肝CYP450s和GSTO2基因和蛋白表達，加速糞臭素在肝中的代謝，從而降低公豬膻味。

GnRH主動免疫；肝；糞臭素代謝；公豬膻味

糞臭素是引起公豬膻味(Boar taint)的2種物質之一，主要由色氨酸在大腸中經微生物降解產生，機體吸收后經肝代謝，代謝產物主要由尿液排出，其中未被代謝的部分經外周血液循環，沉積在脂肪組織中，形成“膻味”[1-2]。糞臭素在動物肝中的代謝主要分為I相代謝和II相代謝，I相代謝主要是給糞臭素加上親水性的羥基；II相代謝是通過I相添加的羥基連接磺基等水溶性基團，以增強糞臭素的水溶性，便于經尿液排出體外[3-6]。研究表明細胞色素P450家族中CYP2E1、CYP2A19、CYB5A和CYP2C49主要參與糞臭素I相代謝，而磺基轉移酶(SULT1A1)和谷胱甘肽-S-轉移酶2(GSTO2)主要參與糞臭素II相代謝反應[7]。孤兒核受體((Constitutive androstane receptor，CAR)和(Pregnane X receptor，PXR))通過調節機體內外源物質新陳代謝進而參與糞臭素代謝[8-9]。

有研究表明，GnRH主動免疫可有效抑制睪丸發育，降低動物生殖激素濃度及公豬肉中“膻味”物質含量，從而去除公豬肉中的“膻味”，已成為最有望替代傳統外科閹割去勢方法[10-15]。GnRH主動免疫能有效降低公豬肉中糞臭素含量[16-17]，其主要原因是對糞臭素在肝中的代謝產生影響[18]。GnRH主動免疫對公豬糞臭素代謝影響的分子機制至今鮮見報道。為此，本試驗擬研究GnRH主動免疫后公豬體內相關激素含量變化和肝中糞臭素代謝相關基因(CYP2E1、CYP2A19、CYB5A、CYP2C49、GSTO2 和SULT1A1 )mRNA和蛋白表達變化，以闡明GnRH主動免疫對公豬體內糞臭素代謝影響的分子機制。

1　材料與方法

1.1疫苗制備

G6k-GnRH-tandem的合成采用R.H.Meloen等[19]報道的方法，以賴氨酸、色氨酸等10種氨基酸為原料，并用D型賴氨酸(D-lysine)取代第6位的甘氨酸(Glysine)，合成品用高壓液相色譜純化。G6k-GnRH-tandem -dimer (TDK-GnRH)合成采用DMSO法將合成的G6k-GnRH-tandem純化物進行二聚化，得到GnRH并列體二聚物(TDK-GnRH)。EDCI法將TDK-GnRH與雞卵清蛋白(OVA)連接，形成免疫復合抗原，并與specol佐劑充分乳化。

1.2試驗動物選取及處理

1.2.1試驗動物的選擇、分組及飼養管理選取10周齡、體重一致、健康狀況良好的大白×長白×杜洛克公豬36頭，按體重隨機分為3組，每組12頭，組Ⅰ為正常完整對照組、組Ⅱ為GnRH免疫組、組Ⅲ為手術去勢組。每組分3圈飼養，每圈4頭豬。試驗期間動物統一飼喂商品日糧和自由飲水。

1.2.2動物免疫程序免疫組公豬10周齡初免，18周齡加免，采用頸部肌肉注射，注射劑量為2 mL(62.5 μg G6k-GnRH-tandem)，對照組公豬不作任何處理，手術組公豬于1周齡進行外科閹割去勢。

1.2.3樣品采集初免當天頸靜脈采血，以后每4周采血1次，直至屠宰。每次所采血樣在4 ℃放置過夜，3 000 r·min-1離心20 min，制備血清，-20 ℃保存。所有試驗豬于育肥期末(26周齡)屠宰。屠宰后立即采集睪丸、肝和背部脂肪組織，用電子天平稱睪丸重量，用游標卡尺測量每側睪丸長度和寬度，睪丸體積釆用公式：V=(4*π(寬度/2)2(長度/2))/4進行計算，記錄為每對睪丸的平均體積。用生理鹽水清洗采取組織后迅速放入液氮中備用，再轉入-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.3激素含量測定

2.1.2 手術禁忌證 TURBT并無絕對禁忌證，但在遇到以下情況時，應在患者一般情況調整好或病情基本穩定后手術：①系統疾病。如嚴重的高血壓、急性心肌梗死、未能控制的心力衰竭、嚴重的心律失常、近期發生腦血管意外者；嚴重的支氣管哮喘、肺氣腫合并肺部感染、肺功能顯著減退者；嚴重的肝、腎功能異常；全身出血性疾病；嚴重糖尿病，血糖未能有效控制者；精神障礙、不能配合手術者。②局部或專科疾病。如急性泌尿生殖系統感染；嚴重的尿道狹窄或尿道閉鎖，經尿道擴張或尿道內切開術仍不能置入電切鏡鞘者；髖關節強直，不能采取截石位者。

采用酶聯免疫試劑盒測血清中睪酮和雌二醇濃度[20]。睪酮靈敏度是0.05 ng·mL-1，最低檢測值是0.1 ng·mL-1；雌二醇靈敏度是25 pg·mL-1，最低檢測限值是20 pg·mL-1。采用高效液相色譜檢測血液雄烯酮的濃度及脂肪中糞臭素和雄烯酮含量[21]。

1.4基因表達測定

使用苯酚-氯仿法提取肝總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板在特定引物下進行定量檢測。95 ℃10 s；95 ℃變性5 s，58～61 ℃退火+延伸25 s，40個循環，最后進行熔解曲線分析以檢測PCR擴增產物的特異性，每個樣品3次重復。目的mRNA相對表達水平采用標準曲線法進行計算。引物序列見表1。

表1引物序列

Table 1Primer sequences of body tissue genes

基因Gene收錄號GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence長度/bpLength退火溫度/℃AnnealingtemperatureCOUP-TF1XM_003123784.1F:CACTACGGCCAATTCACCTGCR:GCCCACTTTGAGGCACTTCTTG16288.6CARNM001037996F:CCGCCATATGGGCACTATGTR:GCGAAATGCATGAGCAGAGA15488.7PXRNM001038005F:CACCAGCAGGTGCATTAATGTCR:ATGCCCAGAAGGTAGGAAGGA16487.6CYB5ANM_001001770F:CCGAACAGTCCGACAAAGCCR:CACCTCCAGCTTGTTCCCTTAA16887.4CYP2E1NM_214421F:ACCCTGAGATACGGGCTCCTAAR:ACGGCATCCAGGTAGGGCAT14086.0GSTO2NC_010456.4F:CAGCATGAGATTCTGTCCTTTCGR:TGGCACCAGACCTGAGGGATT13986.8SULT1A1NM_213765F:GACCACAGCATCTCAGCCTTCAR:GGTTACAGCCTGCCATCTTCTCA12187.1CYP2A19NM_214417F:GGAGAAGAAGAATCCTGACACCGR:GCCTCCACATCCGGTTTCTT14488.6CYP2C49NM_214420F:TCCCCAACCCAGAGGTGTTR:CCTTCTCCCACACAAATTCGTT15288.2β-actinDQ845171.1F:GGCCGCACCACTGGCATTGTCATR:AGGTCCAGACGCAGGATGGCG10460

應用Real-time PCR測定肝中CAR、PXR、COUP-TF1(轉錄因子)、CYP2E1、CYP2A19、CYB5A、CYP2C49、SULT1A1、GSTO2 mRNA相對表達量。

1.5蛋白表達測定

取一部分肝組織，稱重，液氮研磨，加入500 μL PBS緩沖液(pH=7.4)并充分震蕩，3 000 r·min離心20 min，仔細收集上清。應用酶聯免疫法進行酶含量測定，嚴格按照ELISA試劑盒(Antibodies-online.com)說明書進行操作。

1.6數據處理

利用SAS 9.0統計學軟件中GLM對所測數據進行單因子方差分析，采用Duncan法進行數據間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2　結　果

數據處理過程剔除4頭犯病公豬，其中對照組2頭，手術組與免疫組各1頭，最后統計各組動物數分別為對照組10頭，免疫組11頭，手術組11頭。當樣品激素含量(睪酮、雌二醇)低于最低檢測值時，以最低檢測限值統計。

2.1血清抗GnRH抗體滴度

如圖1所示，公豬初免后產生較好的免疫反應，免疫后血清抗GnRH抗體滴度顯著升高，初免后4周上升到32%，屠宰時(初免后16周)抗體滴度上升到63%。

2.2睪丸重量和體積

如表2所示，GnRH主動免疫后，免疫去勢公豬睪丸嚴重萎縮，免疫去勢公豬睪丸重量和體積均下降到對照組33%(P<0.01)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)；箭頭表示免疫時間點Different letters among treatments donate a significant difference (P<0.05)；arrows indicate time-points of vaccination圖1　血清抗GnRH抗體滴度(n=11)Fig.1　Serum anti-GnRH antibody titers (n=11)

2.3血清中睪酮、雌二醇和雄烯酮激素濃度

GnRH主動免疫顯著降低公豬血清睪酮，雌二醇和雄烯酮的濃度(表 2)。屠宰時，免疫組公豬血清中睪酮、雌二醇和雄烯酮濃度與手術組相似(P>0.05)，且極顯著低于完整對照組(P<0.01)。

2.4背部脂肪中糞臭素和雄烯酮含量

屠宰時背部脂肪中糞臭素和雄烯酮含量見表2。與完整對照組相比，GnRH主動免疫顯著降低脂肪中糞臭素和雄烯酮含量(P<0.05)；手術組公豬脂肪中糞臭素和雄烯酮含量與免疫組相似(P>0.05)，均顯著高于完整對照組(P<0.05)。

表2屠宰時睪丸重量、體積，脂肪中糞臭素和雄烯酮及血液中激素的含量

Table 2Testicular weight，volume，skotole and androstenone in fat and hormones in plasma of entire male，immuno- castrates，surgical castrates at slaughter

項目Items對照組(n=10)Entiremale免疫組(n=11)Immuno-castrates手術組(n=11)Surgicalcastrates睪丸重量/gTesticularweight229.07±56.61a73.59±35.66b—睪丸體積/cm3Testicularvolume185.31±48.45a61.40±25.65b脂肪中膻味物質Boartaintcompoundsinfat糞臭素/(ng·g-1)Skatole45.33±9.84a16.48±4.23b14.62±1.54b雄烯酮/(μg·g-1)Androstenone1.06±0.08a0.17±0.04b0.16±0.04b血液中激素Hormonesinplasma睪酮/(ng·mL-1)Testosterone5.80±0.46a0.15±0.03b0.11±0.01b雌二醇/(pg·mL-1)E271.96±7.57a32.61±3.84b27.53±2.34b

同行不同上標小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lower-case superscripts letter within row donates a significant difference (P<0.05)

2.5肝組織中CAR、PXR和COUP-TF1 mRNA表達變化

以β-actin為參考基因，肝組織中CAR、PXR和COUP-TFmRNA相對表達量如圖2所示。免疫組和手術組公豬肝中CAR、COUP-TF1 mRNA表達量相似(P>0.05)，均顯著高于對照組(P<0.05)；PXRmRNA表達量在3組間無明顯差異 (P>0.05)。

2.6肝組織中CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、CYB5A、GSTO2和SULT1A1 mRNA相對表達量

以β-actin為參考基因，肝組織中CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、CYB5A、GSTO2、SULT1A1的mRNA相對表達量見圖3。免疫組公豬肝中CYP2E1、CYP5A、CYP2C49、GSTO2 mRNA表達量與手術組相似(P>0.05)，均顯著高于對照組(P<0.05)；CYP2A19 mRNA表達量手術組顯著高于免疫組(P<0.05)，免疫組顯著高于對照組(P<0.05)；而SULT1A1 mRNA表達量在3組間無明顯差異(P>0.05)。

處理間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Different letters among treatments donate a significant difference (P<0.05).The same as below圖2　完整對照組、免疫組和手術組肝組織中CAR、PXR和COUP-TF1 mRNA表達量Fig.2　mRNA expression of CAR，PXR，COUP-TF1 in the liver from intact males，immuno-castrates and surgical castrates

2.7肝組織中CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、CYB5A、GSTO2和SULT1A1蛋白表達量

CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、CYB5A、GSTO2和SULT1A1蛋白表達量如圖4。免疫組公豬肝中CYP2A19、CYP2C49和GSTO2蛋白表達量與手術組相似(P>0.05)，均顯著高于對照組(P<0.05)；公豬肝中CYP2E1和CYB5A蛋白表達量在手術組最高，對照組中最低，免疫組在兩者之間，與兩組均有顯著性差異(P<0.05)，SULT1A1蛋白表達量在3組間無明顯差異(P>0.05)。

1.CYP2E1；2.CYP2A19；3.CYP2C49；4.CYB5A；5.GSTO2；6.SULT1A1圖3　完整對照組、免疫組和手術組肝組織中CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、CYB5A、GSTO2、SULT1A1 mRNA表達Fig.3　mRNA expression of CYP2E1，CYP2A19，CYP2C49，CYP5A，GSTO2，SULT1A1 in the liver from intact males，immuno-castrates and surgical castrated pigs

3　討　論

GnRH主動免疫后，血液中睪酮含量顯著降低，睪丸嚴重萎縮，與前人研究結果一致[10-12，14]。本研究中GnRH主動免疫公豬脂肪糞臭素和雄烯酮含量下降到外科閹割公豬水平，表明GnRH主動免疫可有效降低公豬肉中由糞臭素和雄烯酮沉積引起的膻味，與文獻[14，16]研究結果一致。

免疫組公豬脂肪糞臭素含量降低，主要是由于肝中參與糞臭素代謝的酶活性增加，加速肝糞臭素代謝。而肝中糞臭素代謝是由細胞色素P450家族的一系列酶催化完成，可分為Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝兩個階段[8]。 I相代謝中，發現細胞色素P450家族中的CYP2E1、CYP2A、CYB5A和CYP2C49是催化糞臭素氧化產生具羥基、氨基和巰基，使糞臭素進入II相代謝反應的重要酶[18，22]。糞臭素II相代謝主要由磺基轉移酶(SULT1A1)和谷胱甘肽-S-轉移酶2(GSTO2)參與完成[8-9]。其中，SULT1A1主要使I相代謝產物加上磺基團增加其水溶性，便于排出體外[23]；而GSTO不僅可以轉運糞臭素的代謝物排出體外，還可以與糞臭素結合提高糞臭素在組織中轉運速度[7]。本研究GnRH主動免疫顯著上調公豬肝糞臭素代謝I相代謝CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、CYB5A，及II相代謝GSTOmRNA和蛋白表達水平，表明GnRH主動免疫能有效增強公豬肝對糞臭素的親水代謝反應和轉運能力，繼而提高公豬體內糞臭素代謝的能力。

1.CYP2E1；2.CYP2A19；3.CYP2C49；4.GSTO2；5.CYB5A；6.SULT1A1圖4　完整對照組、免疫組和手術組肝組織中CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49、GSTO2、CYB5A和SULT1A1的蛋白表達量Fig.4　Protein expression of CYP2E1，CYP2A19，CYP2C49，GSTO2，CYB5A，SULT1A1 in the liver from intact males，immuno-castrates and surgical castrated pigs

GnRH主動免疫后，引起CYP450 mRNA和蛋白表達水平增高，主要原因是免疫后公豬血清中性激素顯著下調，而性激素可以直接或間接作用于CYP450，影響其活性。性激素是調節糞臭素代謝CYP450酶活性一個重要因子，睪酮可以抑制CYP2E1、CYP2A19的活性[23-26]，而雌二醇和雄烯酮主要對CYP2E1表達有抑制作用[16，27]。與上述研究結果相同，本研究中手術去勢與免疫組相似，睪酮、雌二醇及雄烯酮含量顯著降低，而公豬肝糞臭素代謝CYP2E1、CYP2A、CYB5A、CYP2C49和GSTO2基因表達和蛋白水平顯著上調，也表明性激素對肝糞臭素代謝重要酶具有抑制作用。由此推測，GnRH主動免疫可能也是主要通過降低睪丸性激素合成，繼而增強肝糞臭素相關代謝酶的活性，從而降低公豬脂肪糞臭素含量。

性激素除直接抑制CYP450s表達和活性外，還可以與核受體結合從而啟動一些糞臭素代謝相關基因的轉錄[8，25，26]。參與糞臭素代謝的主要核受體包括CAR和PXR。其中CAR主要在肝上表達，由性激素和雄烯酮前體物抑制其活性，通過改變核上配體結合的部位來啟動CYB5A、CYP2A和CYP2B基因的轉錄[28]。本研究中與對照組相比，免疫組和手術組肝CARmRNA表達顯著上調而對PXR無顯著作用。CAR表達增加可啟動肝上CYP2A19、CYB5A轉錄來加速糞臭素I相代謝反應，從而降低脂肪中糞臭素含量。因此，GnRH主動免疫可通過上調公豬肝臟核受體CAR表達，上調CYP450s基因表達和蛋白活性，加速糞臭素I相氧化反應來有效減少脂肪糞臭素含量。

4　結　論

綜上表明，GnRH主動免疫公豬通過下丘腦-垂體-性腺軸降低睪丸產生的類固醇激素睪酮、雌二醇、雄烯酮的合成，從而直接或間接通過核受體CAR上調肝中CYP450s和GSTO2基因表達和蛋白活性，加快肝糞臭素代謝，從而降低公豬背部脂肪中糞臭素含量。

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(編輯程金華)

Effects of Active Immunization against GnRH on Skatole Metabolism in Male Pigs

SUI Fen-fen1，HAN Xing-fa1，CAO Xiao-han1，DU Xiao-gang1，MENG Feng-yan1，CHU Ming-xing2，ZENG Xian-yin1*

(1.IsotopeResearchLaboratory，CollegeofLifeScience，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China；2.KeyLaboratoryofFarmAnimalGeneticResourcesandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The objective of the present study was to investigate the effects of active immunization against GnRH on skatole metabolism in boars.Thirty-six boars at the age of 10 weeks were randomly allocated to 3 groups.Included intact males(not administrated)，Immuno-castrates(immunized against GnRH at 10 and 18 weeks of age)，and Surgical castrates (surgically castrated at the age of one week).The hormone levels of testosterone and estradiol in plasma were determined by ELISA，the androstenone levels in plasma and androstenone，skatole levels in fat were determined by HPLC.The mRNA expression of skatole-metabolism genes in the liver were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR technique，and the protein expression of them were determined by ELISA.Active immunization against GnRH in boars resulted in a atrophy of testes and reduction of plasma testosterone levels (P<0.05).Plasma testosterone，androstenone，estradiol levels and fat androstenone and skatole levels in immunized boars were similar to that of surgical castrated boars (P>0.05)，in which were significantly lower than that of intact controls (P<0.05).In the liver，CARCOUP-TF1，CYP2E1，CYB5A，CYP2C49，GSTO2 mRNA expression in immune-castrated boars were similar to that of surgical castrated boars (P>0.05)，which were significantly higher than that of intact controls (P<0.05)；theCYP2A19 mRNA expression in surgical castrated pigs was higher than in intact controls (P<0.05)，whileCYP2A19 mRNA expression in immunized boars was in between，which was significantly different from either surgical castrates or intact controls (P<0.05)，PXRandSULT1A1 mRNA expression were not significantly different among 3 groups (P>0.05).In the liver，the CYP2E1，CYB5A protein expression were highest for surgical castrated pigs and lowest for intact controls，with vaccinated pigs at an intermediate level；CYP2A19，CYP2C49，GSTO2 protein expression in surgical castrated boars were similar to that of surgical castrated boars (P>0.05)，in which both were significantly higher than intact controls(P<0.05)；but SULT1A1 protein expression had no significant difference among 3 groups (P>0.05).Active immunization against GnRH in boars decreased plasma testosterone，estradiol and androstenone levels，increasedCYP450s andGSTO2 mRNA and protein expression and to reduce boar-taint by accelerating skatole metabolism in the liver.

active immunization against GnRH；liver；skatole metabolism；boar taint

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.008

2015-12-01

四川農業大學雙支計劃(00770107)；四川省教育廳重點項目(15ZA0005)

隨芬芬(1989-)，女，山東濟寧人，碩士生，主要從事動物生殖免疫調控研究，E-mail：suifen90@163.com

曾憲垠，博士生導師，主要從事動物生理與生殖免疫調控研究，E-mail：yzeng1966@163.com

S828.3

A

0366-6964(2016)06-1140-07