Let-7a對犬流感病毒誘導細胞凋亡調控作用的初步研究

胡仁峻，涂黎晴，孫凌霜，賈　坤，遠立國，李守軍*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642)

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Let-7a對犬流感病毒誘導細胞凋亡調控作用的初步研究

胡仁峻1，2，涂黎晴1，2，孫凌霜1，2，賈坤1，2，遠立國1，2，李守軍1，2*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642)

犬流感(CI)是由犬流感病毒(CIV)感染犬引起的傳染性疾病，感染犬主要表現為急性呼吸道癥狀。為了探究犬microRNA let-7a對CIV誘導細胞凋亡的調控作用，在體外用CIV對MDCK細胞進行感染，通過AO/EB染色和流式細胞術檢測是否能引起細胞凋亡，并用熒光定量PCR測定let-7a的轉錄水平，最后通過轉染let-7a來評價其對于細胞凋亡的影響。結果表明，CIV能夠引起MDCK細胞發生凋亡且被感染細胞內let-7a轉錄下調，而過轉錄細胞內let-7a則能夠有效地抑制病毒誘導的凋亡。研究結果顯示，犬let-7a在CIV感染細胞中起著抗凋亡作用，而let-7a的低轉錄促進了細胞凋亡，并且這一機制可能在CIV感染犬的呼吸道損傷中扮演了一定的角色。

let-7a；H3N2；犬流感；MDCK；細胞凋亡

犬流感(canine influenza，CI)是由犬流感病毒(CIV)引起的，CIV屬于正黏病毒科、甲型流感病毒屬，包括H3N8和H3N2亞型[1-2]。2006年，本實驗室在中國華南地區分離得到第一株禽源性H3N2亞型CIV[3]。CIV能夠引起犬的體溫升高、咳嗽、流鼻涕、打噴嚏、呼吸困難、精神沉郁、厭食等癥狀[4]。據報道犬多有偶發感染其他亞型流感病毒的情況[5-6]，作為伴侶動物，犬攜帶CIV對人類和其他動物造成潛在的威脅，所以犬流感的流行研究和機制研究對于其預防和治療具有很重要意義。microRNA是一類大小為20～22個核苷酸(nt)的RNA分子，它來源于基因編碼區的內含子[7]。它是由大小約為70 nt的發卡狀前體剪切得來，并對基因在轉錄后水平起調節作用[8]。CIV感染犬后，會導致呼吸系統損傷，而在基因層面上，會導致犬肺和氣管細胞內一系列microRNA和炎癥及凋亡基因表達的變化[9-11]。Let-7a作為犬肺和氣管內表達豐度第二高的家族，其對細胞免疫或凋亡起著重要作用[9]。

目前對于CIV的研究，主要集中在流行病學調查、病毒基因測序、動物感染性或傳播性試驗，更深入的研究主要是在轉錄組學和蛋白質組學方面。作者用CIV在體外感染MDCK細胞，測定其能否引起細胞凋亡，后通過轉染microRNA，測定microRNA對于細胞凋亡的影響，從而了解microRNA在生物體內可能扮演的角色。

1　材料與方法

1.1病毒和細胞

病毒株H3N2亞型犬流感(A/canine/Guangdong/1/2006(H3N2))和犬腎細胞(MDCK)均由本實驗室(廣東省獸醫臨床重大疫病綜合防控重點實驗室)保存。

1.2主要試劑和儀器

AO/EB細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物；FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國貝克曼(Beckman)公司；反轉錄酶M-MLV購自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR Mix購自瑞士羅氏(Roche)公司；microRNA反轉錄引物、PCR引物及microRNA擬似物和抑制物合成自廣州銳博生物技術有限公司；DNA酶和轉染試劑Lip2000購自美國英杰生命技術有限公司(Invitrogen)。流式細胞儀購自美國Beakman公司；熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏(Roche)公司。

1.3microRNA擬似物和抑制物序列

Let-7a，正義鏈，5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3′，反義鏈，5′-AGCUGUACGCCG-CCCAUUUGG-3′；陰性對照，正義鏈，5′-GAAAG-CCAAACGAGGGCAGGCG-3′，反義鏈，5′-CCUG-CCCUCGUUUGGCUUUCCG-3′；抑制劑，5′-AA-CUAUACAACCUACUACCUCA-3′；抑制劑陰性對照，5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.4病毒培養及病毒細胞半數感染量(TCID50)測定

將病毒接種到9到11日齡的雞胚尿囊腔，37 ℃培養48 h，然后將雞胚置于4 ℃環境過夜，次日以無菌操作收獲尿囊液，-80 ℃儲存備用。測定TCID50，將病毒樣按10-1到10-8進行倍比稀釋，后接種到鋪滿單層細胞的96孔板中。每個稀釋度接種8孔，設2列正常細胞對照。置于37 ℃，5%CO2的培養箱中培養，觀察細胞病變(CPE)，根據Reed-Muench法計算TCID50值。

1.5病毒感染MDCK細胞

將3×105個MDCK細胞接種到12孔板中，等到細胞密度達到80%以上，將100TCID50CIV和1 μg·mL-1TPCK胰酶接種到細胞上。于感染后24和48 h檢測細胞凋亡。

1.6細胞凋亡檢測

1.6.1AO/EB法檢測細胞凋亡感染病毒的細胞按AO/EB細胞凋亡檢測試劑盒操作方法收集并處理之后，在熒光倒置顯微鏡下觀察，綠色細胞為正常細胞，橙紅色細胞為凋亡細胞。計數200個以上細胞，計算凋亡率。

1.6.2流式細胞術檢測細胞凋亡感染病毒的細胞按Annexin-V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作方法收集并處理后，在流式細胞儀(Beckman)上測定，最終結果用CXP軟件(Beckman)進行分析。

1.7熒光定量PCR測定let-7a轉錄及其轉染條件

分別在病毒感染細胞后24和48 h，收集全部細胞，并用TRIzol抽提總RNA，之后用DNA酶處理。通過分光光度計測定其濃度和純度，并通過RNA電泳檢測其質量。然后取1 μg RNA，在20 μL的體系里用microRNA特異性的頸環引物進行反轉錄，小分子RNA U6作為內參。熒光定量PCR反應體系20 μL，PCR mix 10 μL，模板1 μL，上下引物各0.5 μL，其余用DEPC水補足。條件設置：預變性95 ℃ 5 min，擴增，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，45個循環，設置溶解曲線。結果計算用2-ΔΔCT法。測定let-7a轉染條件，待12孔板里的MDCK細胞鋪滿單層后，用Lip2000轉染相同濃度(50 μmol·L-1)和不同濃度(25～200 μmol·L-1)let-7a mimic，轉染相同濃度microRNA的細胞在不同時間點(12～48 h)收集，轉染不同濃度microRNA的細胞在相同時間收集(24 h)。總RNA提取及PCR反應按上述過程進行。

1.8流式細胞術測定轉染microRNA后MDCK細胞的凋亡情況

根據最佳轉染條件轉染microRNA mimic(擬似物)及其inhibitor(抑制劑)，并設置不同的組別。在轉染后24 h，接種100TCID50病毒量和1 μg·mL-1TPCK胰酶，接種病毒48 h后，通過流式細胞儀測定凋亡率。

1.9數據分析

2　結　果

2.1犬流感病毒感染MDCK細胞后引起細胞凋亡

測得本試驗所用毒株效價為103.83TCID50·0.1 mL-1，以100TCID50病毒量接種細胞后，細胞出現了明顯的病變，包括細胞聚集、脫壁漂浮、細胞皺縮、破裂等現象(圖1)。

圖1　CIV感染MDCK細胞后，引起了明顯的細胞病變(100×)Fig.1　Obviously cytopathic changes are observed after CIV infection(100×)

AO/EB染色結果可見在流感病毒處理后24和48 h，細胞都發生了顯著的凋亡。計數200個細胞，測得感染后24和48 h，凋亡率分別為(20.7±1.6)%和(22.3±2.2)%，顯著高于對照組的(8.1±1.1)%和(8.9±1.7)%(圖2)。

圖2　AO/EB染色檢測感染病毒后細胞的凋亡率(100×)Fig.2　AO/EB staining was used to detect the apoptosis rate of the cells infected with CIV(100×)

流式細胞術測定結果顯示感染后24 和48 h，凋亡率分別達到(15.53±0.49)%和(15.87±0.58)%，顯著高于對照組的(4.13±0.24)%和(7.20±0.38)%(圖3)。

圖3　流式細胞術檢測感染病毒后細胞的凋亡率Fig.3　The apoptosis rate of infected cells was detected by flow cytometry

2.2病毒感染細胞后let-7a轉錄及其轉染條件優化

AO/EB染色和流式細胞術分析結果表明CIV能夠誘導MDCK細胞發生凋亡。通過熒光定量PCR測得，在細胞凋亡發生的同時，犬let-7a的轉錄是顯著下調的。與對照組相比，病毒感染后24和48 h，let-7a轉錄水平下調到(39.37±2.46)%和(26.90±7.58)%(圖4)，具體擴增曲線和熔解曲線如圖5所示。為了進一步探究let-7a對MDCK細胞凋亡的影響，作者轉染let-7a進細胞，并對轉染條件進行優化，結果表明50 μmol·L-1let-7a mimic轉染24 h的let-7a轉錄水平最高(圖6)。

2.3let-7a對CIV誘導的細胞凋亡產生明顯的抑制作用

為了探究let-7a在凋亡過程中所起的作用，作者轉染let-7a擬似物或抑制劑進MDCK細胞，測定擬似物或抑制劑對細胞凋亡的影響。如圖7各組順序，流式細胞術測得各轉染組凋亡結果為(8.83±0.55)%、(24.90±1.39)%、(24.17±0.74)%、(22.83±0.73)%、(43.33±1.76)%、(13.07±0.75)%、(28.93±0.95)%和(18.87±1.36)%。通過統計學軟件計算得出，與對照組相比，MDCK細胞感染CIV以后凋亡率極顯著增加(P<0.01)，而脂質體Lip2000對細胞凋亡影響不大(P>0.05)。與scrambled mimic組相比，let-7a過轉錄組凋亡率極顯著降低(P<0.01)，而let-7a低轉錄組的凋亡率則極顯著上升(P<0.01)。轉染let-7a mimic的同時轉染inhibitor能使得凋亡率極顯著上升(P<0.01)，而scrambled inhibitor盡管也使得凋亡率上升(P=0.02)，但其對于細胞凋亡的影響不如let-7a inhibitor。

圖4　感染CIV后，細胞內let-7a轉錄變化Fig.4　Let-7a transcription changes of MDCK cells after CIV infection

圖5　let-7a和U6的擴增曲線及熔解曲線Fig.5　Amplification and dissolution curve of let-7a and U6

圖6　let-7a轉染條件優化Fig.6　Optimization of transfection conditions of let-7a

圖7　let-7a或抑制劑對CIV誘導細胞凋亡的影響Fig.7　Effect of let-7a or inhibitor on apoptosis of MDCK cells induced by CIV

3　討　論

2003年美國報道了H3N8亞型犬流感的出現，隨后中國和韓國相繼在2006年和2007年發現了H3N2亞型CIV。一直以來美國均未曾有過H3N2亞型CIV的報道，然而近年美國卻報道了犬感染H3N2亞型CIV。因為CIV流行區域的擴大并且具有和其他流感病毒重組的可能性，所以它對犬和人類都有一定潛在的威脅[12-13]。因此闡明CIV感染犬的內在分子機制，對于其預防和治療都具有重要的意義。很多研究表明流感病毒感染細胞，都有凋亡現象的發生[14-16]，雖未經證實，但不難推測H3N2亞型CIV也能夠誘導細胞凋亡。本研究證實H3N2亞型CIV感染MDCK細胞后，誘導細胞產生了凋亡，這與蛋白質組學和轉錄組學所得出的結論，即凋亡相關蛋白質和基因的廣泛表達的結果相吻合[9-11]。凋亡作為機體的一種保護機制，其意義在于能夠有效地限制病毒復制。本研究從側面為CIV誘導的呼吸道損傷提供了理論依據，即CIV感染呼吸道上皮細胞后，機體細胞為了限制病毒復制，受凋亡信號刺激，激活凋亡通路，執行凋亡過程，從而使得病毒復制受阻，挽救整個器官。本研究也是對流感病毒誘導凋亡研究的一個補充，某種程度上為流感病毒的基礎研究、防治提供進一步的理論支持。

microRNA具有非常廣泛和強大的功能，其在生物體內的功能不容忽視[17]。作者還初步探究了let-7a對于CIV誘導凋亡的影響，結果表明，let-7a為一個抗凋亡因子，細胞內的某些凋亡蛋白可能是其靶點[18-19]。CIV感染的細胞下調了let-7a的轉錄，可能是為了利于凋亡相關蛋白質的表達，從而有助于凋亡的發生。作者所闡述的關于let-7a在凋亡機制中所扮演的角色，在小分子RNA方面為抗病毒復制提供了新的思路。結果可為microRNA與流感病毒的進一步研究從量上提供一定的參考。未來通過控制細胞凋亡來對付流感病毒，具有理論上的可行性，但其實際應用還有待對凋亡的機制作更深入的研究和臨床試驗。

4　結　論

犬let-7a在CIV感染細胞中起著抗凋亡作用，而let-7a的低轉錄促進了細胞凋亡，并且這一機制可能在CIV感染犬的呼吸道損傷中扮演了一定的角色。

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(編輯白永平)

Study on Regulation Function of Let-7a on Canine Influenza Virus Induced Cells Apoptosis

HU Ren-jun1，2，TU Li-qing1，2，SUN Ling-shuang1，2，JIA Kun1，2，YUAN Li-guo1，2，LI Shou-jun1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPreventionandControlforSevereClinicalAnimalDiseases，Guangzhou510642，China)

Canine influenza (CI) is an infectious disease caused by canine influenza virus (CIV) infection，which is mainly manifested as acute respiratory symptoms.In order to explore the effect of let-7a on CIV induced cells apoptosis，MDCK cells were infected by CIVinvitro，and AO/EB staining and flow cytometry were used to detect cells apoptosis，and the transcription of let-7a was also determined by real time PCR，and the effect of let-7a on cell apoptosis was evaluated by the transfection of let-7a.The results showed that CIV could induce apoptosis of MDCK cells and downregulate the transcription of let-7a in infected cells，and over-transcription of let-7a could effectively inhibit the virus induced apoptosis.This study showe that let-7a plays an anti-apoptotic role in CIV infected cells，and the low transcription of let-7a promotes apoptosis，and this mechanism may play a role in the respiratory tract injury of CIV infected dogs.

let-7a；H3N2；canine influenza；MDCK；cells apoptosis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.021

2015-11-25

國家自然科學基金(31372448)；公益性行業(農業)科研專項(201303042)；廣東省自然科學基金(S2013020013858)；廣東省促進科技服務業發展計劃項目(2013B040200032)；廣東省科技計劃項目(2013B020202001；2013B020224001)；廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室(2013A061401013)

胡仁峻(1990-)，男，江蘇鹽城人，碩士生，主要從事犬流感感染與microRNA相關研究，E-mail：1149243709@qq.com

李守軍，男，博士，教授，博士生導師，主要從事犬流感及其流行病學相關研究，E-mail：shoujunli@scau.edu.cn

S855.3

A

0366-6964(2016)06-1247-06