催產素受體在雌性山羊頸動脈體的分布

黃　雙，孫　曼，金秀芳，徐永平，李　強

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

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催產素受體在雌性山羊頸動脈體的分布

黃雙，孫曼，金秀芳，徐永平*，李強

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

研究催產素受體(OTR)在雌性山羊頸動脈體(CB)中是否存在及其分布特點，為催產素(OT)是否對CB起調節作用提供形態學基礎。用免疫組織化學SP法對雌性山羊的CB進行OTR免疫組織化學染色，觀察CB中OTR的分布特點。結果顯示，在雌性山羊CB的實質細胞群和間質組織中均有不同程度的OTR陽性反應產物存在。OTR強陽性產物分布在Ⅰ型細胞、Ⅱ型細胞的細胞質和細胞膜，在Ⅰ型細胞的細胞核呈弱陽性表達，在Ⅱ型細胞的細胞核呈強陽性表達。在間質組織中，血管內皮細胞和神經纖維中有中等陽性反應產物存在，并且實質細胞群和間質組織的OTR相對表達量差異性極顯著(P<0.01)。結果表明，OTR主要分布于CB的實質細胞群中，CB具備接受OT調控的條件。因此，催產素可以通過激活CB中的OTR來影響CB的功能活動。

頸動脈體；催產素受體；免疫組織化學SP法；雌性山羊

1895年，G.Oliver等研究發現垂體后葉提取物具有血管收縮活性[1]，1906年，英國生理學家H.H.Dale證實垂體后葉提取物具有促進子宮收縮的活性[2]。1928年，O.Kamm在垂體后葉提取物中分離出血管加壓素(vasopressin)和催產素(oxytocin，OT)[3]，直至1953年，V.Du Vigneaud等研究確定了催產素的化學結構，為一種九肽化合物，并進行了人工合成[4]，因此獲得1955年諾貝爾化學獎。催產素(oxytocin，OT)主要是由下丘腦室旁核和室上核神經元合成后經軸漿運輸并貯存于神經垂體的一類神經肽類化合物，OT具有促進子宮收縮和乳汁分泌的作用。但是，隨著對OT研究的不斷深入，發現OT除了對生殖系統發揮作用外，也可作為神經遞質或神經調質影響中樞神經系統的活動，如學習、記憶、睡眠覺醒、影響藥物成癮性及對社會適應性行為等，還可以參與機體其他系統的活動，如體溫的調節和心血管系統的調節等活動[5]。M.V.Sofroniew等發現，來自室旁核的催產素能神經纖維可直接投射到腦干背側，腦干背側是調節心血管活動的重要區域[6]。W.Gaida等發現在患高血壓大鼠的下丘腦OT表達量明顯降低，并且在外周注射催產素可以降低大鼠的平均動脈壓，提示OT與血壓、血管緊張性調節相關[7]。OT的生物活性是由催產素受體(oxytocin receptor，OTR)介導的[8]，在杏仁核、海馬、腦干等腦區都有OTR分布，提示OT可以通過影響中樞神經系統的OTR進而對心血管系統發揮調節作用。OT不僅可作用于中樞OTR網絡，也可經神經垂體系統釋放到外周循環，作用于外周的OTR。M.Jankowski等在大鼠的心以及肺動脈和腔靜脈等大血管的血管內皮細胞內也檢測到OTR的分布[9]，提示OT也可以直接作用于分布在心血管系統的OTR，從而影響心血管的功能活動。 因此，OT可以直接作用于心血管系統的OTR或者間接作用于心血管神經中樞的OTR進而影響心血管的功能活動。

頸動脈體(carotid body，CB)是由神經嵴衍生而來的一個重要的外周化學感受器[10]，位于頸總動脈的分叉處，能感受動脈血液中的PO2、PCO2和pH的變化，并將化學信號轉為電信號，通過竇神經傳入到腦干區域的呼吸中樞和心血管中樞，在呼吸、心血管和神經體液的調節中發揮重要作用。OT能通過中樞神經系統間接調節心血管活動，也能通過外周循環直接作用于心血管系統，頸動脈體作為重要的外周化學感受器，對心血管活動的調節發揮著重要的作用。那么，在頸動脈體內是否存在OTR？OT能否通過作用于CB進而影響心血管的活動呢？作者采用免疫組織化學SP法檢測OTR在頸動脈體的分布，為進一步探索OT能否通過影響外周化學感受器CB進而對心血管活動進行調節提供形態學依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

健康非妊娠雌性成年關中奶山羊5只(均來自陜西楊凌屠宰場)；內源性生物素阻斷試劑盒(貨號：BLK-0001，購自福州邁新生物技術開發有限公司)；免疫組織化學SP超敏試劑盒(兔)(貨號：KIT-9706，購自福州邁新生物技術開發有限公司)；兔抗大鼠OTR多克隆抗體(貨號：BA23081，購自武漢博士德生物工程有限公司)；DAB試劑盒(美國sigma，貨號：M1417-1，購自福州邁新生物技術開發有限公司)；抗體稀釋液(貨號：CW2340，購自北京康為世紀生物公司)；Leica石蠟切片機(型號：LeicaRM2235，德國Leica公司)，Motic生物顯微鏡(型號：BA310，Motic實業集團有限公司廈門總部)等。

1.2方法

1.2.1頸動脈體石蠟切片制作將山羊保定、麻醉、頸動脈放血處死后，從寰枕關節處將羊頭取下，從頸動脈的斷端分離至頸動脈分叉處，迅速取下兩側CB，立即投入40 g·L-1多聚甲醛磷酸緩沖固定液中固定10 h以上。固定好的組織塊經修整后用流動自來水沖洗12 h，在體積分數分別為50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟塊修整后，切片(5 μm)，恒溫水浴鍋中展片，貼片，烘箱烘干。切片分為4套，第一套做HE染色，作為組織定位對照，第二套做免疫組織化學SP法OTR陽性組織細胞定位，第三套切片用于免疫組織化學SP法染色后做蘇木精復染，第四套做免疫組織化學SP法OTR空白對照，以確定反應的特異性。

1.2.2HE染色將第一套切片脫蠟、復水后，蘇木精染色10 min、1%鹽酸-乙醇分化20 s、流動自來水沖洗30 min、伊紅染色5 min、脫水、透明、中性樹膠封片、晾干、Motic顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3免疫組織化學SP法染色第二套和第三套切片經脫蠟、復水后，放入檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原熱修復20 min后，自然冷卻至室溫，滴加內源性生物阻斷劑A、B液各孵育20 min，按照免疫組織化學SP法試劑盒說明書，依次滴加A、B液各孵育10 min，之后加兔抗大鼠OTR多克隆抗體(稀釋倍數為1∶200)于4 ℃條件下過夜，隔天取出復溫后，再依次滴加C、D液各孵育10 min，各步驟之間用PBS液沖洗，DAB顯色。其中第三套切片DAB顯色后進行蘇木精復染，以對陽性結構進行定位觀察，脫水，透明，封片。第四套切片染色過程用PBS液代替一抗，其余過程同上。

2　結　果

山羊頸動脈體HE染色見圖1，OTR免疫組織化學SP法染色見圖2。

a.Ⅰ型細胞；b.Ⅱ型細胞；c.微血管；d.血管內皮細胞a.Type Ⅰ cell；b.Type Ⅱ cell；c.Microvascular；d.Vascular endothelial cells圖1　雌性山羊頸動脈體HE染色Fig.1　HE staining of the CB of female goat

A.OTR的免疫組織化學SP法染色；B.OTR的免疫組織化學SP法染色；C.OTR的免疫組織化學SP法染色及蘇木精復染；D.OTR的免疫組織化學SP法陰性對照組及蘇木精復染；比例尺=20 μm；a.Ⅰ型細胞；b.Ⅱ型細胞；c.微血管；d.小動脈；e.小靜脈；f.血管內皮細胞A.Immunohistochemical SP staining of OTR；B.Immunohistochemical SP staining of OTR；C.Immunohistochemical SP staining of OTR and hematoxylin counterstain of OTR；D.Immunohistochemical SP staining of OTR of the negative control group and hematoxylin counterstain；bar=20 μm；a.Type Ⅰ cell；b.Type Ⅱ cell；c.Microvascular；d.Small artery；e.Small vein；f.Vascular endothelial cells圖2　雌性山羊頸動脈體OTR免疫組織化學SP法染色Fig.2　Immunohistochemical staining of OTR in CB of female goat

2.1頸動脈體HE染色

雌性山羊的CB位于頸總動脈的分叉處后方，借由結締組織連于動脈壁上，其上連接有舌咽神經、鯡魚神經等。HE染色結果顯示，雌性山羊CB由實質細胞、毛細血管和神經纖維以及結締組織成分構成，實質細胞包括有Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞，Ⅰ型細胞細胞核呈橢圓形，數量多，體積大，Ⅱ型細胞細胞核呈長條形，數量少，體積小，兩種細胞數量比為(3～5)∶1，數個Ⅰ型細胞聚集成團，Ⅱ型細胞包繞在其周圍，形成小葉狀結構，結締組織包繞小葉，中間穿插著毛細血管和神經纖維等結構(圖1)。

2.2雌性山羊頸動脈體OTR免疫組織化學SP法染色

陰性對照組經蘇木精復染后只見藍色(圖2，D)，無其他著色，表明OTR的SP染色無非特異性著色。根據頸動脈體內陽性顆粒產物的染色程度，將結果分為四個等級：棕黃色為強陽性；黃色為中等陽性；淡黃色為弱陽性；無著色為陰性。

試驗組SP染色結果顯示，OTR在雌性山羊的CB中廣泛分布，在實質細胞群中，Ⅰ型細胞、Ⅱ型細胞和微血管內皮細胞有不同程度陽性著色，在間質組織中，神經纖維、小動脈和小靜脈的血管內皮細胞有不同程度著色，結締組織無著色。在Ⅰ型細胞(圖2，A-a，B-a)中有呈顆粒狀的OTR免疫陽性產物分布，在細胞膜和細胞質的染色最強，為棕黃色，呈強陽性；細胞核染色為無色或淡黃色，基本為空泡狀，呈陰性或弱陽性。Ⅱ型細胞(圖2，A-b，B-b)中OTR免疫陽性產物為棕黃色，呈強陽性。實質細胞群和間質中穿插的微血管、小動脈、小靜脈的血管內皮細胞呈黃色，呈中等陽性(圖2，A-c，B-d，B-e)。在包裹著實質細胞群的周圍結締組織結構中，基本無OTR免疫陽性著色，呈陰性，結締組織中穿行的神經纖維呈黃色，呈中等陽性。圖像分析顯示CB中OTR免疫陽性物質在實質細胞群的平均光密度為0.447±0.560，非實質細胞的平均光密度為0.214±0.423，實質細胞群的平均光密度極顯著高于非實質細胞結構(P<0.01)。

2.3雌性山羊頸動脈體OTR陽性表達區域的平均光密度

平均光密度值分析結果(表1)表明：雌性山羊CB中實質細胞群的平均光密度值極顯著高于間質組織(P<0.01)。

組織結構Structureoftissue染色強弱Dyeingstrength平均光密度Averageopticaldensity實質細胞群Parenchymacells棕黃色0.447±0.560a間質組織Interstitialtissue淡黃色0.214±0.423b

所標字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

Different letter in the same row means very significant different between treatments(P<0.01)

3　討　論

OT主要是由下丘腦室旁核和視上核的神經元合成，具有激素和神經遞質的雙重作用。OT除了能作為生殖激素發揮促進子宮收縮和排乳等生理作用外，還可以作為神經遞質發揮非生殖調控作用，如社會行為、認知、體溫調節、心血管活動調節等[11]。OT對心血管活動的作用途徑相當廣泛，它可通過作用于中樞和外周神經系統、外周器官(如心、血管和腎)以及通過影響其他調節因子(如心房鈉尿肽、NO和α2腎上腺素能受體)影響心血管系統的活動[12]。

在中樞神經系統，OT能神經纖維投射到不同的腦區，可以與腦干內調節心血管系統的神經核團形成突觸聯系[13]。在大腦孤束核也存在較高濃度的OT，孤束核接受內臟反射和心血管系統壓力感受器的感覺傳入神經纖維。在大鼠的迷走神經運動背核顯微注射OT也能降低心率。OT發揮調節作用和信號傳導都是由OTR介導的，OTR屬于G蛋白偶聯受體家族[14]，根據OTR偶聯的特異的G蛋白，細胞類型以及在膜上的不同位置，催產素能激活不同的第二信使，導致不同的生理作用[15]。OTR mRNA在腦中的分布區域基本上與OT的結合位點一致[16-17]。在外周神經系統，任妮等通過采用免疫組織化學SP法證明OTR在雌性山羊頸胸神經節中廣泛分布，心及附近大血管的交感神經支配主要來自頸胸神經節[18]，OT能通過影響該交感神經途徑調節心血管的活動。OT不僅能通過作用于中樞和外周神經系統間接的影響心血管系統活動，也能通過神經垂體后葉釋放到外周血液循環，對心血管系統發揮直接的調節作用。在外周注射OT會降低大鼠的平均動脈壓[19]，M.Jankowski等發現，在離體灌注的心中，OT具有促進心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)釋放和降低心率以及心肌收縮力的作用[20]。在主動脈和腔靜脈內的OT濃度高于心臟右心室濃度，說明OT可能通過自分泌或旁分泌作用對血壓和血流量發揮直接的調節作用[9]。在大鼠的心以及肺動脈和腔靜脈等大血管的血管內皮細胞內也檢測到OTR的分布，提示OT可能作為內分泌激素通過直接作用于心和血管內的OTR，參與內分泌調節作用，調節心血管活動[21-22]。以上資料表明，OT可通過中樞神經系統、外周交感神經途徑以及直接作用于靶器官來調節心血管系統的活動，但OT能否通過影響外周化學感受器來調節心血管的活動尚未見報道。受體的存在對激素的調節作用具有重要的意義，因此，采用免疫組織化學方法檢測OTR在外周化學感受器CB內是否存在，能為OT是否能影響CB的活動提供一定的形態學依據。

CB是機體內重要的感知血液內化學信號的外周化學感受器，在機體血液內出現O2分壓降低、CO2分壓升高、H+濃度增加等變化時，CB能感受動脈血變化而使機體發生適應性改變[23]。CB的實質細胞群包括Ⅰ型細胞(球細胞)和Ⅱ型細胞(支持細胞)[24]，球細胞內含有豐富的神經遞質，認為其屬神經內分泌細胞，是CB神經體液調節體系中的一個重要的信息整合樞紐[25-26]。試驗結果顯示，OTR在球細胞的細胞質和細胞膜表達呈強陽性，說明CB的球細胞是OT影響CB作用的主要靶點，OT可能通過激活球細胞內的OTR影響球細胞內神經遞質的釋放，進而通過神經內分泌的途徑影響CB對心血管活動的調節作用。在包裹著實質細胞的間質組織中穿行的神經纖維上OTR免疫陽性產物呈中等陽性，熊喜龍等利用HRP法對CB的神經支配進行分析，發現CB受舌咽神經遠節(巖神經節)和頸上節(頸前神經節)發出的神經支配，CB還接受發自頸動脈竇神經、結狀神經節的神經支配，豐富的神經纖維成分為頸動脈體調節心血管活動提供豐富的神經通路[27]，提示OT對CB的影響可能存在感覺、交感、副交感神經通路。頸動脈體是一個血管極其豐富的器官，具有很高的血流/體積比，頸動脈體的供血小動脈主要來自枕動脈和頸內動脈、頸外動脈的分支，后又分支為無數微動脈，穿行于頸動脈體的實質細胞群和間質中，在間質間的小動脈和小靜脈的血管內皮細胞也存在OTR免疫陽性產物，提示催產素可能通過OTR調節CB的局部血流量。

CB作為重要的化學感受器，其功能活動直接影響機體的心血管活動，以適機體不同生理時期的活動。本試驗通過從外周化學感受器CB著手，通過對其上OTR的檢測，發現OTR在CB內廣泛分布，提示CB具備接受OT調控的條件，并將外周化學感受器和中樞神經系統的作用相互聯系起來，豐富了OT的非生殖調控作用和CB的神經內分泌調節作用。

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(編輯白永平)

Distribution of Oxytocin Receptor in the Carotid Body of Female Goat

HUANG Shuang，SUN Man，JIN Xiu-fang，XU Yong-ping*，LI Qiang

(CollegeofAnimalMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

This experiment was conducted to detect the existence of oxytocin receptors (OTR) in the carotid body (CB) of female goats to discuss effects of oxytocin (OT) on the activity of CB.The distribution characteristics of OTR in the carotid body of female goats were studied by using immunohistochemical SP staining.The results showed that，the parenchyma cells and the interstitial tissue were immunolabelled in different degrees.In the type Ⅰ cells and type Ⅱ cells of CB，uniformly strong immunostaining was found in the whole cell membrane and cytoplasm，whereas the nucleus of type Ⅰ cells were not or weekly immunolabelled，the nucleus of type Ⅱ cells were strong immunolabelled.In the interstitial tissue，moderate immunoreactivity products distribute in the vascular endothelial cells and nerve fibers.Image analysis documented a significant difference of OTR expression between the parenchyma cells and the interstitial tissue.The OTRs were widely distributed in CB of female goat，suggesting that oxytocin may exert potential effects on carotid body.

carotid body；oxytocin receptor；immunohistochemical SP method；female goat

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.023

2015-12-15

國家自然科學基金(31072184)；陜西省農業推廣項目(K332021401)

黃雙(1990-)，女，湖北松滋人，碩士生，主要從事基礎獸醫學研究，E-mail：huangshuang519@163.com

徐永平，E-mail：xuyp717@nwsuaf.edu.cn,Tel:029-87091117

S852.1

A

0366-6964(2016)06-1260-06