ω-黑麥堿基因沉默對小麥1B/1R易位系加工品質的影響

柴建芳王海波馬秀英 張翠綿 董福雙

河北省農林科學院遺傳生理研究所/河北省植物轉基因中心， 河北石家莊 050051

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ω-黑麥堿基因沉默對小麥1B/1R易位系加工品質的影響

柴建芳*王海波*馬秀英 張翠綿 董福雙

河北省農林科學院遺傳生理研究所/河北省植物轉基因中心， 河北石家莊 050051

摘 要：ω-黑麥堿是造成小麥 1B/1R易位系加工品質差的一個重要因素， 為探索解決這一問題， 構建了 ω-黑麥堿基因沉默表達載體， 并通過農桿菌介導轉化小麥品種金禾9123， 獲得3個T0代轉基因植株， 再經連續的擴繁和PCR檢測， 獲得純合轉基因 T4代株系。酸性 PAGE檢測結果表明， 這些純合轉基因株系中 ω-黑麥堿的總表達量平均下降53%。這些 ω-黑麥堿基因沉默的轉基因株系的面筋指數、沉降值和穩定時間均顯著提高， 而其農藝性狀， 如株高、穗粒數、千粒重和小區產量， 均沒有受到不良影響， 說明沉默 ω-黑麥堿基因可以在不影響產量的前提下提高小麥1B/1R易位系的加工品質。

關鍵詞：小麥1B/1R易位系； 黑麥堿； RNA干擾； 基因沉默； 加工品質

本項目由河北省自然科學基金項目（C2014301005）資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province， China （C2014301005）.

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1605.010.html

小麥1B/1R易位系具有抗性好、高產和適應性廣等優點， 在我國大面積推廣的高產小麥品種中占有很大的比例［1］。目前， 來自黑麥品種 Petkus的抗病基因已失去抗性［2-3］， 新的非Petkus來源的抗病小麥1B/1R易位系已陸續培育成功［4-5］， 顯示1B/1R易位系仍將在未來的小麥育種和生產上發揮重要作用。但是， 小麥 1B/1R易位系普遍存在加工品質差的問題， 主要表現為面筋強度低、耐揉性差和面團發黏， 對面包和面條加工品質都有明顯的不良影響［6-7］。研究認為， 小麥1B/1R易位系1RS染色體上的ω-黑麥堿基因是導致面團加工品質變差的一個重要原因［8］，因此， 封阻 ω-黑麥堿基因的表達可能是改善小麥1B/1R易位系加工品質的一條有效途徑。

為封阻ω-黑麥堿基因的表達， 利用ph基因誘導同源染色體重組和利用 1R染色體的單體附加系自交已創造了不含ω-黑麥堿基因的小麥1B/1R易位系［9-10］，但高產和抗逆等有利基因是否會隨ω-黑麥堿基因一同丟失， 目前尚不清楚。

RNA干擾（RNAi）是近年來發展起來的一項新技術［11-12］， 可用來沉默多個序列高度相似基因的表達， 在小麥上已成功應用［13-14］。ω-黑麥堿基因是一個包括多個成員的基因家族， 不同家族成員之間DNA序列高度相似［15］， 適合用RNA干擾封阻ω-黑麥堿基因的表達。本研究旨在明確ω-黑麥堿基因沉默是否會對小麥重要農藝性狀造成影響， 該基因沉默技術能否應用于小麥1B/1R易位系加工品質的遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1B/1R易位系蘭考906和非1B/1R易位系中國春用于克隆構建表達載體的相關基因片段， 1B/1R易位系金禾9123用于遺傳轉化。金禾9123由本研究團隊選育， 2008年通過黃淮北片審定， 2012年通過黃淮南片審定， 但該品種加工品質比較差（農業部農作物品種審定第1877號公告）。

從蘭考906花后15 d的籽粒中提取總RNA， 用植物RNA提取及第一鏈cDNA合成試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）， 按說明書程序反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2 ω-黑麥堿基因RNA干擾表達載體的構建

ω-黑麥堿基因 RNA干擾片段由正向 ω-黑麥堿基因片段、含內含子的DNA片段和反向ω-黑麥堿基因片段3部分依次連接組成。根據我們［15］報道的ω-黑麥堿基因不同成員編碼區的序列， 選取編碼區5′相對保守的區段設計引物， 引物序列為 P3-1∶5′-ttcccggg ccttcctcatctttgtcct-3′ （下畫線部分為Sma I酶切位點）； P4-1∶ 5′-taggatcc gctctggtctctggggttg-3′ （下畫線部分為BamH I酶切位點）。以蘭考906的cDNA為模板進行PCR擴增， 擴增參數為94℃ 4 min； 94 ℃ 45 s， 65℃ 45 s， 72℃ 1 min， 30個循環； 72℃ 7 min。對 PCR產物進行克隆測序， 選取其中一個與Chai等［15］報道的黑麥堿序列完全一致的克隆作為載體構建黑麥堿基因的正向片段。

設計反 P4-1/反 P3-1引物對， 前者序列為5′-AATTTCTAgA AgCTCTggTCTCTggggTTg-3′ （下畫線部分為Xba I酶切位點）， 后者序列為5′-AATAgAgCTC CCTTCCTCATCTTTgTCCT-3′ （下畫線部分為Sac I酶切位點）。以上述含正向黑麥堿基因片段的克隆為模板進行PCR擴增， 擴增參數相同獲得反向的黑麥堿基因片段。

利用P內1/P內2引物對， 從小麥的蠟質蛋白基因擴增攜帶內含子的DNA片段， 引物序列P內1為5′-AATTggATCCggCggCCTCggCgACgTCCTCg-3′（下畫線部分為 BamH I酶切位點）； P內 2為5′-AATTTCTAgA ACCCggTgACCgTTggCCTgCA-3′（下畫線部分為 Xba I酶切位點）。以中國春基因組DNA為模板進行PCR擴增， 擴增參數與擴增正向黑麥堿基因片段時相同， 擴增后對產物進行克隆測序，選取與Murai等［16］報道的小麥Waxy基因第一內含子序列完全一致的片段構建載體。

在用pBS-T克隆試劑盒進行克隆時會出現一些沒有插入片段的藍斑， 選擇一個藍斑搖菌提質粒得到閉環的pBS-T質粒載體， 該載體具有Sma I-BamH I-Xba I-Sac I結構的多克隆位點。以該質粒載體為中間載體， 依次通過Sma I-BamH I雙酶切、BamH I-Xba I雙酶切和Xba I-Sac I雙酶切把正向的黑麥堿基因片段、含內含子的DNA片段和反向的黑麥堿基因片段連接起來， 再用Sma I/Sac I雙酶切， 把植物雙元表達載體pAHC25中的Gus基因替換為已連接好的黑麥堿基因RNA干擾片段“正向黑麥堿基因片段-內含子片段-反向黑麥堿基因片段”， 得到抗性篩選基因為 Bar基因的黑麥堿基因沉默表達載體pAHC25-Sec。為得到適于農桿菌轉化的黑麥堿基因沉默表達載體， 進一步用Hind III/EcoR I部分雙酶切上述pAHC25-Sec表達載體， 回收6.1 kb的片段并將其與同樣雙酶切的農桿菌表達載體pCAMBIA0390連接， 得到可用于農桿菌轉化的黑麥堿基因沉默表達載體 pCAMBIA0390-Sec （圖 1），該表達載體的抗性篩選基因為Bar基因。

圖1 黑麥堿沉默表達載體pCAMBIA0390-Sec結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of pCAMBIA0390-Sec expression vector

1.3 農桿菌轉化

取金禾9123開花后12～15 d的籽粒， 先用70%酒精溶液浸泡1 min， 1%次氯酸鈉溶液消毒10 min，再以無菌水沖洗4次； 在無菌條件下用手術刀片挑取幼胚盾片朝上放到愈傷組織誘導培養基 SD2上（MS培養基+1 mg L-1VB1+150 mg L-1天門冬酰胺+2 mg L-12，4-D+30 g L-1蔗糖+3 g L-1植物膠， pH 5.8）， 于25℃黑暗條件下誘導愈傷組織， 4～10 d后進行轉化。

將預培養的幼胚愈傷組織放入含有黑麥堿沉默表達載體的農桿菌 EH105侵染液（1/10MS無機鹽+3%蔗糖+1%葡萄糖+100 μmol L-1乙酰丁香酮， pH 5.4， 菌液OD600值為0.5）侵染30 min， 然后于裝有無菌濾紙的平皿中 23℃黑暗條件下共培養 2～3 d， 再將其轉移到SD2+300 mg L-1羧卞青霉素的抑菌培養基上恢復培養 2周， 及分化培養基（1/2MS+2%蔗糖+300 mg L-1羧卞青霉素+5 mg L-1玉米素+3～5 mg L-1Bialaphos） 25℃光照條件下分化篩選2周， 將抗Bialaphos （Bar基因抗性）的再生芽轉移到 1/2MS+ 2%蔗糖+0.3 mg L-1IAA+0.5 mg L-1多效唑培養基上壯苗， 再生植株生長到苗高 6～8 cm、根系較好時移入培養缽， 幼苗在 4～8℃下春化 20 d后移栽到溫室。

1.4 小麥抗性再生植株的分子檢測及Basta涂葉檢測

當小麥抗性再生植株生長至 4～5片葉時， 用CTAB法提取葉片的基因組DNA進行PCR檢測。檢測引物為ω-sec-P3 （5′-ccttcctcatctttgtcctc-3′）和P內2 （5′-acccggtgaccgttggcctgca-3′）， 擴增區域為正向黑麥堿基因片段加上內含子片段， 擴增片段大小為548 bp。擴增程序為94℃ 5 min； 94℃ 30 s， 60℃ 30 s， 72℃ 1 min， 35個循環； 72℃ 10 min。

用記號筆在植株倒數第2片葉距葉尖1 cm處畫上橫線， 用100 mg L-1Basta溶液雙面涂抹橫線到葉尖的部位， 1周后觀察涂抹部位顏色變化情況。

1.5 種子醇溶蛋白與高低分子量麥谷蛋白的電泳檢測及其統計分析

采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）檢測種子醇溶蛋白［17］， 采用SDS-PAGE檢測高、低分子量麥谷蛋白［18］。用Image J 149v軟件量化處理醇溶蛋白電泳中ω-黑麥堿條帶的亮度， 并用DPS v3.01軟件統計分析。

1.6 轉基因小麥的農藝性狀與加工品質測定及其統計分析

將得到的3個T4代純合轉基因株系及其受體對照金禾 9123按隨機區組設計進行小區產量比較試驗， 每個小區種5行， 行長4 m， 每行播240粒種子，行距30 cm， 3次重復， 收獲前從每小區隨機選20個莖稈調查株高和穗粒數， 收獲后稱取小區產量和千粒重， 委托河北省農作物品種品質檢測中心測定蛋白質含量、吸水率、濕面筋含量、面筋指數、Zeleny沉降值和穩定時間。試驗結果選用DPS v3.01軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 陽性轉基因植株的獲得

通過農桿菌介導的遺傳轉化， 得到金禾9123的10個T0代抗性再生植株， 其中3株為目的基因PCR陽性（圖2）。用100 mg L-1Basta溶液涂葉處理表明，PCR陽性植株葉片涂抹部位顏色沒有變化， 而其他7株葉片涂抹部位變黃， 從而排除了農桿菌污染導致 PCR假陽性的可能性， 說明目的基因已整合到 3個小麥植株的基因組中。

圖2 T0代轉基因植株的PCR檢測Fig.2 Electrophoregram of PCR products from T0putative transgenic wheat plants

2.2 純合轉基因株系的獲得與 ω-黑麥堿基因的表達

T0代陽性轉基因植株經連續自交和 PCR檢測，從T2代分離群體中獲得純合轉基因株系， 經過進一步的擴繁和 PCR檢測， 轉基因性狀能夠穩定遺傳，最終得到3個T4代純合轉基因株系（K1-5、K1-15和K1-16）， 并且收獲了足夠種子用于小區產量比較試驗。酸性PAGE檢測結果顯示， 在4個ω-黑麥堿條帶中， 除表達量最弱的條帶 2變化不明顯外， 轉基因株系的其他 3個黑麥堿條帶的表達量均顯著降低（圖3）， 轉基因株系ω-黑麥堿基因的總表達量為受體品種ω-黑麥堿基因總表達量的47.5% （表1）。其他非黑麥堿條帶沒有出現一致變弱的情況， 說明黑麥堿基因沉默具有較高的特異性。

表1 轉基因小麥株系及其受體對照種子中不同ω-黑麥堿的表達量比較Table 1 Comparison of ω-secalins in seeds of wheat transgenic lines and the non-transgenic recipient

圖3 轉基因小麥種子中ω黑麥堿的酸性PAGE檢測Fig.3 Detection of ω secalin in transgenic wheat seeds by acid PAGE

為了解ω-黑麥堿基因表達沉默對麥谷蛋白基因表達的影響， 對3個純合轉基因株系及其對照進行了高低分子量麥谷蛋白的電泳檢測， 結果轉基因株系麥谷蛋白各條帶的表達量與對照相比沒有明顯變化（圖4）， 說明ω-黑麥堿基因沉默沒有影響麥谷蛋白基因的表達。

圖4 轉基因小麥種子中麥谷蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.4 Detection of glutenin subunits in transgenic wheat seeds by SDS-PAGE

2.3 轉基因小麥的加工品質

3個轉基因株系的籽粒蛋白質含量、吸水率和濕面筋含量與受體對照沒有顯著差異， 但面筋指數明顯提高， 其中2個株系與對照達到顯著差異， 沉降值和穩定時間也比對照顯著提高（表2）， 說明 ω-黑麥堿基因的沉默顯著提高了金禾9123的加工品質。

2.4 轉基因小麥的農藝表現

3個轉基因株系的株高、穗粒數、千粒重和小區產量與對照非常接近（表 3）， 株系間差異均不顯著， 說明沉默黑麥堿基因的表達沒有影響轉基因株系的農藝表現。

表2 轉基因小麥及其受體品種金禾9123的籽粒加工品質Table 2 Grain processing quality of transgenic lines and their receptor

表3 轉基因小麥及其受體品種金禾9123的農藝性狀Table 3 Agronomic traits of transgenic lines and their receptor

3 討論

1B/1R易位系金禾9123是一個高產品種， 加工品質較差， 不利于推廣應用。本研究嘗試利用 ω-黑麥堿基因沉默技術來改善金禾9123的加工品質， 發現ω-黑麥堿基因沉默在不影響產量的前提下確實能顯著提高金禾9123的加工品質。在本研究中， ω-黑麥堿基因的沉默效率平均為 52.5%， 沉默效率不高，可能與使用的Ubiquitin啟動子有關， Gil-Humanes等［19］用種子特異性啟動子構建的沉默表達載體轉化小麥取得了更高程度的沉默效果。目前， 我們也構建了由小麥種子特異性啟動子驅動的ω-黑麥堿基因沉默表達載體， 并通過基因槍法共轉化小麥 1B/1R易位系科農199， 得到了沉默效果更好的轉基因株系， 其加工品質提高的幅度更為顯著， 相關結果將另文報道。由此推測， 通過沉默 ω-黑麥堿基因的表達可以改良小麥1B/1R易位系的品質。

ω-黑麥堿是一類高度水溶性的蛋白［20］。本研究中， 轉基因株系的濕面筋含量沒有提高， 麥谷蛋白各組分的表達量也沒有明顯變化， 而轉基因株系的面筋指數卻顯著提高， 說明轉基因株系用與對照相同量的面筋產生了更多的不溶性面筋聚合體。這暗示ω-黑麥堿對不溶性面筋聚合體的形成產生了不良影響， 但 ω-黑麥堿如何影響不溶性面筋聚合體的形成， 值得進一步研究。

本研究得到的ω-黑麥堿基因沉默株系與以往報道的 ω-黑麥堿基因缺失材料［9-10］有不同特點。據報道， 小麥1B/1R易位系的1RS上有一個控制根系大小的基因， 且該基因位于 ω-黑麥堿基因的附近［21］。在文獻報道的 ω-黑麥堿基因缺失材料［9-10］中， 控制根系大小的基因是否已隨ω-黑麥堿基因區段一同丟失尚不清楚， 因為缺乏相關農藝性狀的報道， 而 ω-黑麥堿基因沉默株系由于不涉及染色體區段缺失，不會導致鄰近的根系大小相關基因的丟失， 本研究中ω-黑麥堿基因沉默株系的農藝性狀沒有受到不良影響恰好證明這一點。另外， 基因沉默性狀作為一個顯性性狀［22-23］， 可在不同 1RS來源的小麥 1B/1R易位系上應用， 不會因為 ω-黑麥堿基因缺失材料上的抗性基因失去抗性而失去應用價值， 其應用范圍應更廣。

4 結論

利用RNA干擾技術沉默ω-黑麥堿基因的表達，顯著提高了金禾9123的加工品質， 且未對其重要農藝性狀造成不良影響， 是改善小麥 1B/1R易位系加工品質的有效手段。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00627

*通訊作者（

Corresponding authors）∶ 柴建芳， E-mail∶ chai87652130@163.com； 王海波， E-mail∶ nkywanghb@163.com

收稿日期Received（）∶ 2015-09-28； Accepted（接受日期）∶ 2016-03-02； Published online（網絡出版日期）∶ 2016-03-11.

Effect of ω-Secalin Gene Silencing on Processing Quality of Wheat 1B/1R Translocation Line

CHAI Jian-Fang*， WANG Hai-Bo*， MA Xiu-Ying， ZHANG Cui-Mian， and DONG Fu-Shuang
Genetics and Physiology Institute， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang 050051， China

Abstract：Omega-secalin is an important factor for the poor processing quality of wheat 1B/1R translocation lines.In this study，an expression vector of silencing ω-secalin gene was constructed and transferred into wheat variety Jinhe 9123 via Agrobacterium tumefaciens strain EH105.The three T0transgenic plants obtained were consecutively multiplied after PCR validation until the T4lines.Acid-PAGE assay indicated that total amount of ω-secalins in the transgenic lines decreased 53% on average compared with that in their respective control.In the three homozygous transgenic lines， gluten index， precipitation value， and stabilization time increased significantly， whereas the agronomic traits， such as plant height， grain number per spike， 1000-grain weight and plot yield， had no significant changes compared with those in the wild type.These results suggest that silencing ω-secalin genes can improve the processing quality of wheat 1B/1R translocation lines on the premise of not affecting grain yield.

Keywords：Wheat 1B/1R translocation line； Secalin； RNAi； Gene silencing； Processing quality