利用簡化基因組技術分析甘薯種間單核苷酸多態性

石 璇王茹媛唐 君李宗蕓，*羅永海，*

1江蘇師范大學生命科學學院， 江蘇徐州221116；2中國農科院甘薯研究所/國家甘薯改良中心， 江蘇徐州 221121

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利用簡化基因組技術分析甘薯種間單核苷酸多態性

石 璇1王茹媛1唐 君2李宗蕓1，*羅永海1，*

1江蘇師范大學生命科學學院， 江蘇徐州221116；2中國農科院甘薯研究所/國家甘薯改良中心， 江蘇徐州 221121

摘 要：選用Xushu 18 （6x）和Nancy Hall （6x）、2個二倍體I.trifida （2x）品系（4597-10和4597-21）、四倍體I.trifida （4x）、六倍體I.trifida （6x）、二倍體I.temussima （2x）和I.littorallis （2x）以簡化基因組測序技術SLAF-seq測序， 獲得724 589 個SLAF標簽， 其中多態性SLAF標簽35 310個。通過序列分析， 獲得40 765個有效單核苷酸多態（SNP）， 并用這些SNP分析了8個種質的群體結構和系統發生樹。結果表明， 利用簡化基因組測序技術SLAF-seq能高效、低成本地開發出大量可用于群體遺傳分析的SNP標記； 通過構建進化樹發現甘薯栽培種和野生種I.trifida的親緣關系比較近。這些分析結果為進一步研究甘薯栽培種的起源提供了基礎數據。

關鍵詞：甘薯； SLAF-seq； 分子標記； SNP； 進化分析

本研究由江蘇高校優勢學科建設工程資助項目， 農業部農作物保護項目（2015NWB006）， 江蘇省自然科學基金面上項目（BK2012579，BK20141146）和江蘇省高校自然科學研究重大項目（12KJA180001）資助。

This study was supported by the Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions， the Project on Crop Conservation Funded by the Ministry of Agriculture of China （2015NWB006）， the General Projects Funded by Natural Science Foundation of Jiangsu Province （BK2012579， BK20141146）， and the Major Project Funded by Natural Science Foundation of Jiangsu Higher Education Institutions （12KJA180001）.

第一作者聯系方式∶ E-mail∶ shixuanluck@163.com

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160218.1503.006.html

甘薯［Ipomoea batatas （L.） Lam］又稱甜薯、地瓜、白薯、紅薯， 旋花科甘薯屬草本植物， 是世界范圍內最重要的經濟作物之一［1］。甘薯是六倍體作物（2n=6x=90）， 由于形態相似程度高、進化過程中發生難以追蹤的雜交以及表型可塑性等問題， 很難僅僅根據甘薯及其近緣物種的形態學特征來構建其系統發生樹［2-3］。時至今日， 甘薯的起源和馴化歷史仍不明確。現有的研究表明， 甘薯有可能起源于異源多倍體， 其祖先種可能是 I.leucantha、I.triloba和 I.trifida［4］； 但是更多的研究提示甘薯可能起源于同源多倍體， 推測由二倍體I.trifida染色體加倍而成［2，3，5-8］。盡管如此， 現有數據并不足以確定甘薯的起源關系，特別是缺少高質量的I.trifida和I.batatas的核基因組序列和葉綠體基因組序列， 不能通過比較基因組學分析證明二倍體的I.trifida是否是六倍體的甘薯栽培種I.batatas的祖先。

隨著現代生物技術的發展， 分子標記越來越廣泛地被用于確定物種間的親緣關系。早期人們利用RAPD、RFLP、AFLP、ISSR等分子標記技術來構建甘薯遺傳圖譜， 但由于準確性差、工作量大、可重復性差、成本高等問題［2，9-12］， 都無法開發出高通量的分子標記。隨著測序技術的發展以及因此帶來的測序成本降低， 高通量測序技術越來越多地被應用于分析復雜物種間的親緣關系。在過去幾十年，基因組學蓬勃發展， 眾多高等植物的基因組如擬南芥、水稻、苜蓿草、大豆、小麥等均已經完成了測序， 但是甘薯基因組的測序仍未成功。甘薯基因組構成復雜， 異質性高， 缺乏高解析度的遺傳圖譜。即便在今天的技術條件下， 要克服這些障礙、對甘薯進行全基因組測序和組裝依然困難重重。此外， 甘薯是一種異花授粉的作物， 一般情況下不僅品種內自交不親和， 同一種群內品種間也存在自交不親和現象。這些情況嚴重限制了甘薯遺傳學、基因組學和育種學的研究， 提示研究人員應該從研究方法或技術手段上多些創新和嘗試。

簡化基因組測序是在高通量測序技術（主要是二代測序技術）基礎上發展起來的， 它利用酶切技術、芯片捕獲技術或其他實驗手段降低物種基因組復雜程度， 進而研究基因組代表性遺傳變異的技術手段［13-14］。SLAF-seq （specific-locus amplified fragment sequencing）是特異性位點擴增片段測序技術的簡稱， 是基于高通量測序技術發展起來的一種簡化基因組深度測序技術。簡要地說， SLAF-seq先利用生物信息學方法， 對目標物種的參考基因組（例如目標物種已知的 BAC序列或近緣物種的基因組）系統分析； 再根據參考基因組的GC含量、重復序列情況和基因特點等信息， 設計酶切方案， 構建 SLAF-seq文庫， 篩選特異性長度片段， 應用高通量測序技術獲得高通量標簽序列； 然后對數據分析， 獲取測序深度和質量均滿足要求的 SLAF片段； 這些片段可以充分代表全基因組的序列特征信息， 依據這些片段可以開發出大量的分子標記特別是單核苷酸多態（SNP）。該技術可以且已經運用于大規模種質資源研究、高密度遺傳連鎖圖譜構建、不同個體間的多態性分析和目標性狀相關的基因組區段或候選功能基因快速定位。它具有高準確性、高通量、低成本、獲得的分子標記能作為序列信息直接進行后續工作、能縮短試驗周期、可以多性狀并行研究等優點［15-17］。本文嘗試將 SLAF-seq技術應用于甘薯生物學的研究， 測定8個甘薯栽培種及其近緣物種基因序列， 擬揭示品種間親緣關系， 有效提高在復雜農作物中開發大規模分子標記、研究其物種起源與進化關系的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用8個甘薯或其近緣物種， 分別是六倍體栽培種Xushu 18 （6x）和Nancy Hall （6x）、2個二倍體I.trifida （2x）品系（4597-10和4597-21）、四倍體I.trifida （4x）、六倍體I.trifida （6x）、二倍體I.temussima （2x）和I.littorallis （2x）（基本信息列于表1）。

表1 本研究所用的8種甘薯或其近緣品種Table 1 Eight germplasms of sweetpotato and its relatives in this study

1.2 基因組DNA制備

用液氮速凍新鮮葉片， 存于-80℃冰箱備用， 用CTAB法分別提取8個樣品的基因組 DNA， 用Nanodrop 2000C和Qubit 2.0進行DNA的質量檢測，以確保所提基因組 DNA質量達到建庫要求（即OD260與OD280的比值分布在1.8～2.0之間； DNA濃度達到30 ng μL-1）。

1.3 酶切方案的設計

由于沒有合適的甘薯或其近緣物種參考基因組可用， 我們選擇馬鈴薯基因組為參考基因組進行電子酶切預測。馬鈴薯基因組大小約為651 Mb， GC含量為34.80%［18］。利用SLAF酶切預測軟件對參考基因組進行酶切預測， 選擇最合適的酶切方案， 其原則如下∶ （1）位于重復序列的酶切片段比例盡可能低；（2）酶切片段在基因組上盡量均勻分布； （3）酶切片段長度與具體實驗體系的吻合程度較高［17］； （4）最終獲得酶切片段（SLAF標簽）數達到預期標簽數。同時，通過設置對照基因組（擬南芥）進行同樣流程的測序、評估對照基因組的測序數據， 進而驗證實驗過程是否正常， 確定所用酶切方案的有效性。

1.4 測序、SLAF標簽分析、SNP鑒定

根據選定的最適酶切方案， 對各樣品基因組DNA分別進行酶切， 分離目標酶切片段， 對其進行3＇端加A處理、連接測序接頭、PCR擴增、純化、混樣、純化等試驗操作， 文庫質檢合格后用Illumina HiSeq 2500進行雙端測序（PE100）。對測序得到的原始數據進行識別、過濾、質檢、評估等分析， 獲取各個樣品的序列（reads）。

測序產生的序列（reads）來源于同一限制性內切酶對不同樣品作用產生的長度相同或相近的酶切片段， 根據相似性可以將各樣品的序列（reads）聚類，聚到一起的序列（reads）被認為來源于同一個 SLAF酶切片段， 稱為一個序列組（SLAF標簽）。一般來說，同一SLAF標簽在不同樣品間的序列相似度遠高于不同SLAF標簽間的相似度； 同一個SLAF標簽在不同樣品間序列有差異， 即可定義為多態性 SLAF標簽。通過分析多態性SLAF標簽， 鑒定其中存在的單核苷酸多態性（SNP）， 利用這些SNP分析群體。

1.5 群體遺傳分析和親緣關系分析

對鑒定到的SNP分子標記過濾， 選擇次要基因型頻率（MAF）大于0.05和完整度大于0.8的SNP進行群體差異性分析。使用 Admixture軟件［19］分析群體結構， Cluster［20］軟件分析主元成分， MEGA5［21］軟件、Neighbor-Joining［22］分析進化關系。

2 結果與分析

表2 SLAF-seq基因組測序數據統計表Table 2 Summary of genomic sequences generated by SLAF-seq

2.1 簡化基因組序列的產出和質量評估

利用 SLAF酶切預測軟件分析， 最終確定使用Rsa I酶切， 酶切片段長度在264～314 bp的片段定義為目標酶切片段， 預測能得到 107 700個 SLAF標簽。試驗中， 從對照基因組（擬南芥）獲得了1.79百萬序列（MReads）。通過序列分析可知， Rsa I的酶切效率為 93.50%， 雙端比對效率（一條序列兩端在對照基因組上的比對跨度介于50～1000 bp的reads占總reads的比例）為 85.15%。這些數據顯示我們選定的酶切方案和試驗結果均達到試驗預期。從 8個甘薯栽培種及其近緣物種共獲得 18.66百萬序列（MReads）， 平均Q30 （測序堿基質量值， 即測序時錯誤識別的概率是0.1%、正確率為99.9%的堿基比例）為90.74%， 平均GC含量為38.69% （表2）。所測序列的 GC含量處于較低水平， 對本試驗測序反應的影響不大； Q30數據表明測序質量很高， 測序結果可靠。

2.2 SLAF標簽和SNP分子標記的鑒定

通過序列分析， 從8個甘薯甘薯栽培種及其近緣物種共獲得了724 589個SLAF標簽， 每個樣品獲得的SLAF標簽數從123 205至292 800不等（表3）。每個樣品的平均測序深度（即各個樣品中平均每個SLAF標簽上對應的測序reads數）有所差別， 從6.62 至17.03， 平均測序深度為11.46， 達到了 SLAF試驗預期（一般認為， 測序深度達到5即可提供較可靠的、高通量的分子標記， 可用于研究物種的親緣關系）。

從這些SLAF標簽中共鑒定到多態性SLAF標簽35 310個。通過分析， 鑒定到89 375個SNP （表4）∶ 每個樣品的SNP數目從7 096至14 860不等。這些SNP的平均完整度（即SNP所在位點在全部樣品中的信息完整度）介于17.41%～36.45%之間。根據次要基因型頻率（MAF）大于5%和完整度大于80%的選擇標準， 從這些SNP中篩選出40 765個有效SNP，用于群體遺傳分析。

表3 SLAF標簽統計表Table 3 Summary of obtained SLAF tags

表4 群體SNP統計表Table 4 Summary of identified SNPs

此外， 分析所鑒定到的 SNP可以看到， 不同樣品的SNP雜合率存在較大差異， 多數樣品具有較高的雜合率。其中六倍體栽培種Xushu 18 （6x）和Nancy Hall （6x）、野生種四倍體 I.trifida （4x）、六倍體 I.trifida （6x）的SNP雜合率都超過了92% （表4）， 表明它們的基因組高度雜合。相反地， 野生種I.temussima （2x）和I.littorallis （2x）的SNP雜合率分別只有7.61% 和15.05%， 表明其基因組的純合度很高（表4）。

2.3 群體遺傳分析

基于篩選出的有效 SNP， 采用 Admixture軟件計算了8個甘薯栽培種及其近緣物種的群體結構（圖1）。根據交叉驗證錯誤率來確定分群數， 擁有最低交叉驗證錯誤率的分群數為最優分群數。從圖1可見，當K為8時值最低， 這反映了8個甘薯栽培種及其近緣物種的遺傳結構并不明顯。

利用這些SNP信息， 繪制8個甘薯栽培種及其近緣物種的進化樹（圖2）。從進化樹可見， 2個六倍體栽培種Xushu 18 （6x）和Nancy Hall （6x）的親緣關系最近； 二倍體I.trifida （2x）的2個品系在進化樹上相鄰， 顯示它們更高的親緣關系。值得關注的是， 2個六倍體栽培種與四倍體 I.trifida （4x）和六倍體 I.trifida （6x）比二倍體I.trifida （2x）的親緣關系近。此外， 可看出， I.temussima （2x）和I.littorallis （2x）與甘薯栽培種的親緣關系較遠。

3 討論

3.1 傳統分子標記技術的局限性

分子標記技術是生物學研究不可或缺的技術手段。盡管我們已經步入后基因組時代， 在很多物種中， 分子標記依然十分有限。甘薯栽培種染色體數目多（2n=6x=90）， 遺傳背景復雜， 嚴重影響甘薯分子生物學和分子育種的研究［19］。早期人們利用RFLP來研究甘薯及其近緣野生種的親緣關系， 但是花費較高， 工作量較大， 效率相對較低。也有研究者使用RAPD技術來研究種質資源間的遺傳多樣性，但其結果的準確性及可重復性的問題很難解決［2］。近年來， Jarret等［3，9］和賀學勤等［10］綜合運用RAPD、AFLP和ISSR等分子標記分析并明確了一些甘薯品種的親緣關系， 發現ISSR標記產生的聚類圖與系譜圖最吻合， 因而認為用ISSR標記分析甘薯品種的親緣關系具有較高的效率和準確度。但是， ISSR標記存在一些局限性， 限制了其進一步的發展與應用。這些局限性包括， 需要一定的時間來摸索反應條件、篩選標記； 系顯性遺傳標記， 不能區分顯性純合基因型和雜合基因型； 通量小、精確性較低、耗時耗力、成本高等［11-12］。盡管人們已經利用這些傳統的分子標記技術研究了甘薯的親緣關系、構建了一些甘薯及其親緣物種的遺傳圖譜［23-29］， 但是利用高通量測序技術開發全基因組范圍內的分子標記并用于親緣關系分析的報道仍然缺少。本文嘗試應用簡化基因組技術之一的 SLAF-seq在甘薯及其近緣物種間開發大規模SNP， 并取得了成功。

3.2 簡化基因組技術在復雜農作物分子標記開發上的可行性及優勢

圖1 基于所鑒定SNP分析群體結構Fig.1 Analysis of population structure by using identified SNPs

圖2 基于所鑒定SNP的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on identified SNPs

簡化基因組測序對沒有參考基因組的物種特別適用， 能有效克服基因組復雜、序列與標記信息缺乏等問題， 進而大規模的開發和分析SNP標記。目前主要發展起來的簡化基因組測序技術有， 限制性酶切位點相關的 DNA（RAD）測序、基因分型測序（GBS）、基于II B型限制性內切酶位點相關的DNA（2b-RAD）測序和特異性長度擴增片段測序（SLAF-seq）技術。這些技術都是通過限制性內切酶來降低基因組 DNA的復雜程度［30］。由于酶切產生的標記是全基因組范圍內呈現特異性酶切位點附近的小片段DNA， 它們一定程度上代表了整個基因組的序列特征， 因此對酶切標簽進行二代測序能夠在大多數物種中獲得成千上萬的單核苷酸多態性（SNP）標記。本研究運用SLAF-seq技術， 在8個甘薯栽培種或其近緣物種中共獲得 18.66百萬序列（MReads），開發了724 589個SLAF標簽（其中多態性SLAF標簽35 310個）， 從中鑒定到89 375個SNP， 進一步分析篩選出40 765個有效SNP并利用這些分子標記分析了相應種質的雜合率和群體結構， 構建了它們的系統發生樹， 從而為甘薯栽培種的起源提供了新的證據。我們的研究表明， 利用簡化基因組測序技術SLAF-seq能高效、低成本地開發出大量可用于群體遺傳分析的 SNP標記（表 4）。這為下一步利用該技術在更大范圍內分析甘薯栽培種及其近緣種的親緣關系， 為闡明甘薯栽培種的起源歷程創造了可能性，同時也為開發分子標記用于基因定位（例如， 全基因組關聯分析）和分子育種奠定了基礎。

3.3 甘薯栽培種起源的探討

針對甘薯的起源目前主要有3種假說［31］。第一種假說認為甘薯起源于二倍體的 I.leucantha， 然后通過染色體多倍化派生出四倍體的 I.littoralis［32］，這2個物種再雜交產生三倍體的I.trifida， 進而染色體加倍產生六倍體的野生甘薯， 對這些野生甘薯進一步的篩選和馴化即產生了六倍體的I.batatas。第二種假說認為甘薯的野生祖先是 I.batatas， 它是由I.trifida和I.triloba雜交產生的六倍體［33］。第三種假說認為 I.trifida的同源多倍體是甘薯的祖先， 有可能是其產生的 2n配子參與了一系列的染色體多倍體化［33］。此外， Roullier等［12］、Caroline等［34］、Otto［35］、Zohary［36］和Allaby等［37］通過分析ITS序列和SSR分子標記， 推測栽培種甘薯是從I.trifida進化而來的同源六倍體。他們發現， I.triloba與甘薯栽培種的親緣關系比I.trifada更遠， 無法得出其與甘薯存在明顯的親緣關系， 也就無法確切地證明甘薯是來源于I.trifida和I.triloba的異源六倍體［35］。從我們的數據可以看出， 甘薯栽培種和野生種I.trifida的親緣關系比較近， 而且， 2個六倍體甘薯栽培種與四倍體I.trifida （4x）和六倍體I.trifida （6x）的比二倍體I.trifida （2x）的親緣關系更近（圖2）。這個數據與之前甘薯栽培種可能起源于I.trifida同源多倍化的假設相一致， 提示了I.trifida （2x）可能先多倍化形成I.trifida （4x）， 之后進一步形成I.trifida （6x）， 再經自然選擇或者人工馴化形成甘薯栽培種［11，23，31，34］。當然， 該假說需要進一步的基于比較基因組學、群體遺傳學的分析以便獲得無可辯駁的證據。

4 結論

通過簡化基因組測序技術 SLAF-seq在甘薯栽培種及其近緣野生種中成功開發了高通量SNPs， 并將其用于親緣關系的分析， 為進一步研究甘薯的起源提供了基礎數據。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00641

*通訊作者（

Corresponding authors）∶ 羅永海， E-mail∶ yhluo@jsnu.edu.cn； 李宗蕓， E-mail∶ zongyunli@jsnu.edu.cn

收稿日期Received（）∶ 2015-10-19； Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11； Published online（網絡出版日期）∶ 2016-02-18.

Analysis of Interspecific SNPs in Sweetpotato Using a Reduced-Representation Genotyping Technology

SHI Xuan1， WANG Ru-Yuan1， TANG Jun2， LI Zong-Yun1，*， and LUO Yong-Hai1，*

1School of Life Science， Jiangsu Normal University， Xuzhou 221116， China；2Sweetpotato Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Sweetpotato Improvement Centre， Xuzhou 221121， China

Abstract：Xushu 18 （6x）， Nancy Hall （6x）， I.trifida （2x） 4597-10， I.trifida （2x） 4597-21， I.trifida （4x）， I.trifida （6x）， I.temussima （2x）， and I.littorallis （2x） were used as experimental materials for sequencing by specific-locus amplified fragment sequencing （SLAF-seq）， a high-throughput reduced-representation genotyping technology.In total， 724 589 SLAF tags were obtained and 40 765 SNPs were identified out of 35 310 polymorphic SLAF tags.A total of 40 765 single nucleotide polymorphisms （SNPs） were obtained by sequence analysis.Population structure and phylogenetic relationship of eight germplasm were analyzed using the SNP dataset， which suggests that SLAF-seq can be used to develop large-scale SNPs for population genetic analysis，effectively and economically.Our analysis revealed that the relationship between sweet potato cultivars and the wild species I.trifida is closer.These results provide empirical data for further study of the origin of sweet potato.

Keywords：Sweetpotato； SLAF-seq； Molecular marker； SNP； Phylogenetic analysis