一個水稻黃綠葉突變基因的定位和遺傳研究

初志戰郭海濱劉小林陳遠玲劉耀光，*

1華南農業大學生命科學學院/亞熱帶農業生物資源保護與利用重點實驗室， 廣東廣州 510642；2華南農業大學公共基礎課實驗教學中心， 廣東廣州 510642；3宜春學院， 江西宜春 336000

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一個水稻黃綠葉突變基因的定位和遺傳研究

初志戰1郭海濱2劉小林3陳遠玲1劉耀光1，*

1華南農業大學生命科學學院/亞熱帶農業生物資源保護與利用重點實驗室， 廣東廣州 510642；2華南農業大學公共基礎課實驗教學中心， 廣東廣州 510642；3宜春學院， 江西宜春 336000

摘 要：從粳稻品種日本晴經60Co-γ誘變的 M1材料中發現一個黃綠葉突變體， 其葉片從萌發到三葉前期表現白化，三葉后期開始轉為黃綠葉， 直到衰老。遺傳分析表明， 該突變表型受一對隱性核基因控制， 將該黃綠葉突變體暫定名為ygl8951。與野生型相比， ygl8951的葉綠素含量與類胡蘿卜素含量顯著降低。電子顯微鏡觀察表明ygl8951內葉綠體數量明顯減少， 葉綠體內沒有基粒類囊體， 只有類似間質類囊體結構。基因表達定量分析表明， 突變體中光系統 I和光系統II基因表達水平明顯下調， 核糖體結構基因和質體編碼的RNA聚合酶亞基基因表達明顯上調。利用ygl8951與秈稻品種黃華占雜交獲得的F2分離群體， 將該基因定位于水稻第6染色體上的In/Del標記607489與607611之間，物理距離191 kb的范圍內， 通過分析確認該基因為一個新的調控葉色的基因。

關鍵詞：水稻； 黃綠葉； 基因定位； 遺傳分析

本研究由亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題（SKL-CUSAb-2013-04）， 江西省教育廳科技計劃項目（GJJ14707）和廣東省自然科學基金-博士啟動項目（2015A030310485）資助。

This study was supported by the Open Fund Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources （SKL-CUSAb-2013-04）， the Science and Technology Program from Education Department of Jiangxi Province （GJJ14707）， and the Natural Science Fund of Guangdong Province-the Launch Program for Doctor （2015A030310485）.

第一作者聯系方式∶ E-mail∶ chuben@scau.edu.cn

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160218.1503.004.html

葉片是植物光合作用的主要器官， 水稻產量的95%來自葉片的光合作用［1］。葉色突變在水稻種植過程中較為常見， 多因為葉綠素合成或降解過程發生變化所導致。過去常常認為葉色突變無任何利用價值， 但隨著生物技術的發展， 人們發現探究葉色調控不僅可以深入研究植物光合作用機制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的結構功能和遺傳發育調控機制， 也可以在作物性狀標記、水稻葉色改良等領域［2-3］有一定的應用價值。

水稻葉色突變類型豐富， 包括白化、黃化、黃綠（淡綠）、條斑、斑馬葉等多種表型。迄今為止， 已報道的水稻葉色突變體超過180個， 已成功克隆的葉色相關基因有37個。從葉色突變基因的分布來看，12條染色體上均有發現， 其中以第3染色體上最多。由于葉綠體是半自主型細胞器， 其生物發生及發育受核基因組和葉綠體基因組共同調控， 因此引起葉色變異的機制較復雜， 其中葉綠素、類胡蘿卜素等色素合成過程中酶的突變， 導致葉綠素合成缺陷，是目前發現最多的一類， 例如OsDVR［4］、YGL1［5］、OsCAO1［6］、OsPDS （水稻八氫番茄紅素脫氫酶）、OsZDS （水稻ζ-胡蘿卜素脫氫酶）、OsCRTISO （水稻類胡蘿卜素異構酶）、β-OsLCY （水稻番茄紅素β-羥化酶）［7］均屬這一類。葉綠體自身結構發育異常也常常導致葉色的突變， 例如， OsPPR1［8］、轉綠型白葉突變體v1［9］、轉綠型白葉突變體v2［10］、OsCHR4突變體［11］均屬此類型。葉綠素分解代謝障礙也可以導致葉色突變， Sgr突變［12-14］、NYC1 （non-yellow coloring）［15］變異均表現出葉片滯綠。

本實驗室利用60Co-γ誘變日本晴， M1獲得一個水稻黃綠葉突變體， 暫命名為 ygl8951。對 M2材料遺傳分析表明， 該性狀由單個隱性基因控制。本研究對該突變體進行生理生化分析和顯微觀察， 并定位該突變基因， 以期為該基因的克隆及對葉綠體發育過程的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 突變體材料

黃綠葉突變體萌發至三葉期前期為白化表型，三葉期后期開始轉為黃綠苗， 突變體生長較野生型緩慢且矮化， 分蘗數減少， 只有2～4個， 整個生命周期延長近60 d。

1.2 葉綠素含量測定

分別取突變體和野生型材料的分蘗期葉片， 測定其葉綠素含量， 重復3次， 取平均值。測定方法參照文獻［16］， 并略加修改。

1.3 葉綠體顯微結構觀察

取分蘗期的野生型及突變體葉片， 用4%戊二醛（以pH 7.2的磷酸緩沖溶液配置） 4℃過夜固定， 磷酸緩沖溶液沖洗3次， 1%鋨酸固定1 h， 磷酸緩沖溶液沖洗3次， 用30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇和丙酮逐級脫水5 min， 最后用樹脂包埋， 切片后用醋酸鈾染色， 透射電鏡下觀察。

1.4 定位群體的構建

選取6株黃綠葉突變單株， 與秈稻品種黃華占雜交， 獲得F1種子。播種F1后， 自交繁殖獲得F2種子，分株系種植F2群體， 作為定位群體。

1.5 基因定位

采用SDS法［17］分別提取24株黃綠植株葉片總DNA， 用于基因初步定位。根據初步定位結果， 采用快速打葉法［18］對定位群體植株進行兩側標記檢測，并利用內部In/Del引物進一步精細定位。

用于基因定位的In/Del分子標記， 一部分為本實驗室已有的， 另一部分為根據已公布的水稻品種93-11和日本晴全基因組序列自行開發。這些標記均勻分布于水稻12條染色體上， 共147對。

1.6 葉綠體基因表達分析

取分蘗期的葉片提取RNA， 并反轉錄cDNA， 由于葉綠體Rubisco基因表達受到影響， 因此利用β-Actin （Os03g0718100）作為內參基因， 以64對引物檢測野生型與突變體中葉綠體基因組基因的表達量。β-Actin引物序列為， F∶ 5′-CACATTCCAGCAGAT GTGGA-3； R∶ 5′-ACCACAGGTAGCAATAGGTA-3′。根據Bio-Rad公司的《熒光定量PCR應用指南》數據處理， 通過計算2-ΔΔCT值來確定每個基因在野生型和突變體的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 突變體表型鑒定

正常的自然條件下， 黃綠葉突變體種子萌發后子葉為白色， 從真葉長出至三葉期葉片完全為白色，從三葉期后突變體逐漸轉為黃綠色（圖1）。

圖1 野生型（左）和突變體（右）表型Fig.1 Phenotypes of wild type （left） and ygl8951 mutant （right）

2.2 突變體的葉綠素含量變化

黃綠葉突變體的葉綠素 a/b幾乎不變， 但葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量下降明顯， 表明突變體的葉綠素合成受到明顯抑制（表1）。

表1 野生型和ygl8951突變體中色素含量Table 1 Photosynthetic pigments contents in wild type （WT） and ygl8951 mutant

2.3 葉綠體的顯微結構

利用透射電鏡（TEM）觀察發現， 野生型材料細胞中葉綠體含量豐富， 基粒結構清晰， 而突變體葉綠體中沒有清晰的基粒類囊體， 僅有類似間質類囊體結構（圖2）。

2.4 葉綠體基因的定量表達分析

通過定量結果可以看出， 該葉色突變對葉綠體基因的影響是全面的， 并且上調基因明顯多過下調基因， 共有30個基因明顯上調（上調倍數＞2）， 上調基因主要為核糖體結構基因（chl44， chl63， chl42，chl43， chl45）和 RNA聚合酶亞基基因（chl10， chl09，chl08）； 表達量明顯降低的基因多為光系統基因（chl06， chl16， chl01， chl05）以及Rubisco大亞基基因（chl23）（圖3）。

2.5 突變體的遺傳分析及定位結果

圖2 野生型（A， C）和ygl8951突變體（B， D）分蘗期的超微結構Fig.2 Transmission electron microscopy observation of wild type （A， C） and ygl8951 mutant （B， D） on tillering

突變材料M1中， 野生型植株與黃綠突變植株分別為38株和11株， 符合3∶1的分離關系（χ2c=0.06 ＜ χ20.05=3.84； P ＞ 0.05）。單株收獲M1葉色正常的植株種子， 種植M2代， 約有1/3的植株后代全部葉色正常， 不再分離， 其余2/3的植株后代又表現出大致3∶1的分離比。選取6株黃綠葉單株與秈稻親本黃華占雜交， F1種子自交獲得F2群體， 分別統計正常植株與黃綠苗數目， 正常植株與黃綠突變植株分別為334株和102株， 分離比例符合3∶1 （χ2c=0.517 ＜ χ20.05=3.84； P ＞ 0.05）， 因此確定該突變為單基因隱性遺傳。

選取在兩親本間有多態性的In/Del標記， 共有147對， 均勻分布于水稻12條染色體上。用24株黃綠苗， 將黃綠基因初步定位在第6染色體的短臂上， 分子標記In/Del 606949與In/Del 607611之間， 物理距離約為662 kb。

為了進一步縮小定位區間， 選取F2群體中1121株黃綠植株和2380株正常表型植株做精細定位群體。根據公布的粳稻日本晴與秈稻93-11序列， 在In/Del標記606949與607611之間， 找到了8對在2個親本有差異的新標記（表2）， 并最終將黃綠葉基因ygl8951定位在In/Del標記607420與607611之間， 物理距離約為191 kb （圖4）。

3 討論

突變體 ygl8951從種子萌發到三葉前期為白化表型， 三葉后期以后為黃綠葉表型這種類型的突變尚未見報道。ygl8951突變體葉綠素、類胡蘿卜素含量明顯下降， 這與大部分的黃綠葉突變體研究結果相似［19-20］。根據孔萌萌等［21］的關于葉綠體發育階段研究， 葉綠體發育分為3個階段， 即前質體時期、單片層時期和基粒形成期。ygl8951突變體的電鏡結果顯示突變體的葉綠體中沒有清晰的基粒類囊體， 僅有類似間質類囊體結構， 因此葉綠體發育一直處在單片層形成期， 說明突變基因影響了基粒類囊體的形成。

圖3 部分葉綠體編碼基因在野生型和ygl8951突變體的表達比較Fig.3 Expression analysis of some chloroplast-encoded genes in wild type and ygl8951 mutant

圖4 ygl8951 在水稻第6染色體的定位Fig.4 Location of ygl8951 on rice chromosome 6

水稻（Oryza sativa）葉綠體基因組測序工作在1989年已經完成［22］， 葉綠體編碼蛋白預測超過100個［23］。由于很多預測基因片段太小， 無法設計合適的引物檢測， 因此只對64個葉綠體基因組基因表達進行了定量分析， 結果發現， 在突變體中光系統I和光系統II基因表達下調明顯。由于光系統I和ATP合酶集中分布在基質類囊體和基粒類囊體邊緣， 而光系統II和捕光天線復合體II主要分布于基粒垛疊區域［24］， 因此可以認為不僅基粒類囊體沒有形成，間質類囊體也發育不完整。葉綠體基因組轉錄至少需要2種RNA聚合酶——核基因組編碼的RNA聚合酶（NEP）和質體基因組編碼的RNA聚合酶（PEP）［25］。核糖體結構基因和質體編碼的 RNA聚合酶亞基上調明顯， 目前沒發現有這方面的報道， 猜測可能是植物的應激反應。

通過圖位克隆將目標基因 ygl8951定位在 191 kb的范圍， 在目前已報道的水稻葉色突變材料中，有15個突變基因被定位到第6染色體， 其中引起黃綠葉表型的有yl6［26］和ygl2［27］， 它們與ygl8951均非等位基因， 在該區間內也沒有別的葉色相關基因的報道， 因此為一個新基因。

表2 用于精細定位的新In/Del標記Table 2 New In/Del markers for mapping

4 結論

粳稻品種日本晴經60Co-γ誘變后， 在M2材料中發現了一個穩定遺傳的黃綠葉突變體ygl8951， 從芽萌發至三葉期前期葉片完全為白色， 從三葉期后期逐漸轉為黃綠色， 其葉綠素、類胡蘿卜素含量下降明顯， 葉綠體中沒有清晰的基粒類囊體， 僅有類似間質類囊體結構， 說明突變基因影響了基粒類囊體的形成。光系統I和光系統II基因表達下調明顯； 核糖體結構基因和質體編碼的 RNA聚合酶亞基表達上調明顯， 這幾大類基因之間的調控網絡目前未知，也未見相關報道。ygl8951被定位在第6染色體In/Del標記607489和607611之間191 kb的范圍， 推測是一個新基因。但是要想回答上面的問題及了解調控網絡，則需要進一步精細定位和克隆該突變基因。

致謝： 感謝華南農業大學亞熱帶農業生物資源保護與利用重點實驗室的張群宇老師提供葉綠體基因組引物及序列。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00684

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 劉耀光， E-mail∶ ygliu@scau.edu.cn

收稿日期Received（）∶ 2015-09-25； Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11； Published online（網絡出版日期）∶ 2016-02-18.

Genetic Analysis and Gene Mapping of a Yellow-green Leaf Mutant in Rice

CHU Zhi-Zhan1， GUO Hai-Bin2， LIU Xiao-Lin3， CHEN Yuan-Ling1， and LIU Yao-Guang1，*

1College of Life Sciences， South China Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangzhou 510642， China；2Center of Experimental Teaching for Common Basic Course， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，China；3Yichun University， Yichun 336000， China

Abstract：A yellow-green leaf rice mutant， temporarily named as ygl8951 （yellow-green leaf 8951）， was identified from60Co γray radiation mutation in japonica rice variety Nipponbare.The mutant showed albino phenotype from germination to 3-leaf-stage，then turned yellow-green phenotype till apoptosis.The contents of chlorophyll and carotenoid were obviously decreased in ygl8951 compared with the wild type.Electron microscope observation showed that no grana thylakoids but some stroma thylakoids-like structures were found in chloroplast of ygl8951 mutant.The expression levels of some genes involved in photosystem I and photosystem II were dramatically decreased， while the ribosomal and RNA polymerase genes in chloroplast were increased in ygl8951 mutant compared with the wild type.Mapping-based cloning was used to identify the ygl8951 locus using an F2population from a crossing between the mutant and Huanghuazhan.The result showed that the mutated locus was located in a 191 kb region on chromosome 6， which was assumed to be a new gene controlling leaf color.

Keywords：Rice； Yellow-green leaf； Gene mapping； Genetic analysis