擬南芥低葉綠素熒光LCF3基因的克隆與功能分析

劉凌云 劉 浩 趙 晶 王艷霞 王棚濤

河南大學生命科學學院/棉花生物學國家重點實驗室/植物逆境生物學重點實驗室， 河南開封 475004

?

擬南芥低葉綠素熒光LCF3基因的克隆與功能分析

劉凌云 劉 浩 趙 晶 王艷霞 王棚濤*

河南大學生命科學學院/棉花生物學國家重點實驗室/植物逆境生物學重點實驗室， 河南開封 475004

摘 要：葉綠素熒光動力學技術在測定葉片光合作用中光系統對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨特的作用。本研究借助葉綠素熒光成像儀， 從擬南芥EMS誘變突變體庫中篩選到一株低葉綠素熒光突變體lcf3-1 （lower chlorophyll fluorescence 3-1）。遺傳分析表明lcf3-1突變體為單基因隱性突變。突變基因圖位克隆結果顯示LCF3是PsbW的等位基因。另外， LCF3基因的T-DNA插入突變體及功能回補轉基因植物的葉綠素熒光分析結果均證明LCF3基因突變導致擬南芥葉綠素熒光Fv/Fm值降低。進一步實驗結果顯示， LCF3蛋白定位于葉綠體， 且LCF3基因在植株中普遍表達。PsbW蛋白可能細微調整PSII-LHCII超復合體的組裝及穩定。

關鍵詞：擬南芥； 葉綠素熒光； 光合作用； 圖位克隆

本研究由國家自然科學基金項目（31170253）和河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（142300413206）資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31170253） and the Basic and Advanced Technology Research Project in Henan Province （142300413206）.

第一作者聯系方式∶ E-mail∶ lingyunl@henu.edu.cn

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160125.1622.010.html

光合作用是綠色植物最重要的生理活動之一，該作用分為光反應和暗反應2個階段， 是植物和光合細菌將光能轉化為化學能的重要過程。光反應中光的吸收是由僅能吸收利用長波光的系統 PSI （photosystem I）和只能吸收利用短波光的系統 PSII （photosystem II）完成［1-2］。其中PSII是由多個亞單位組成的色素-蛋白復合體， 該復合體參與植物光合系統中光解放氧過程［3］。藍藻PSII復合體主要由分子量＜10 kD的低分子量蛋白組成， 高等植物PSII復合體則含有藍藻中不具備的3個低分子量蛋白PsbR、PsbTn和PsbW［4］， 這3個蛋白的細胞定位及功能特點還不完全清楚。

PsbW是一個6.1 kD的PSII低分子量蛋白亞基，最初發現是菠菜PSII的組成成分［5-6］， 該蛋白僅參與PSII但不涉及PSI蛋白復合體的組成［7-8］， 具有穩定PSII同源二聚體結合的潛在作用［9］。然而， 近年發現PsbW與Lhcb蛋白一起參與PSII后續組裝步驟［10-13］，并且PsbW缺失導致有序排列的PSII-LHCII （lightharvesting complex II）超復合體的大結構域不能形成，從而使PSII亞單位之間能量傳遞效率降低， 同時PSII對光脅迫響應的調節變慢［14］。

植物吸收太陽光主要用于光合作用、熱耗散和葉綠素熒光。葉綠素熒光發射除了受到激發能的傳遞、天線色素和反應中心色素性質和定位的影響外，還受PSII反應中心供體側和受體側氧化還原狀態的影響［15-17］。葉綠素各熒光參數的變化間接反映葉綠體及其內部葉綠素狀態。因此， 葉綠素熒光成為光合作用研究中極重要的富含信息的高效指示劑。

葉綠素熒光動力學技術是一種以光合作用理論為基礎， 利用體內葉綠素作為天然探針， 研究和探測植物光合生理狀況及各種外界因子對其影響的新型植物活體測定和診斷技術。本研究運用此技術，篩選出葉綠素熒光參數Fv/Fm值較野生型低的突變體lcf3-1， 并對其進行分子克隆及基因定位研究。轉基因回補實驗證實該基因是PsbW的等位基因。LCF3定位于葉綠體， 并在植物中普遍表達。對LCF3的研究使葉綠素熒光技術篩選突變體的理論和方法得到不斷的完善， 并且為光合作用機制的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

將野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）的生態型Columbia （Col）用于表型篩選， 生態型Landsberg erecta （Ler）用于圖位克隆。擬南芥突變體lcf3-1是EMS （甲基磺酸乙酯）誘變Col野生型得到的低葉綠素熒光突變體。

1.2 材料種植

擬南芥種子用0.01%升汞懸浮浸泡5 min， 無菌水漂洗5次后， 播種于含0.6%瓊脂的MS培養基上。4℃春化2～4 d后放入培養間， 待種子萌發， 生長10 d左右移至土中繼續生長。生長條件為22℃ （晝）/18℃ （夜）， 光周期為16 h （光）/8 h （暗）， 光強為120～130 μmol m-2s-1。

1.3 突變體的遺傳分析

以突變體lcf3-1為母本、野生型Ler為父本， 雜交得到F1代， F1自交獲得F2代。觀察F2代表型， 并統計植株表型的分離比。

1.4 轉基因材料的獲得

以野生型Col基因組DNA為模板， 以LCF31F∶5'-GGGGGATCCTCTCAGAATGCAGAATATCAGA-3'和LCF31R∶ 5'-CCCAAGCTTCCATGTTAACTATAT GTGTATTC-3'為引物擴增LCF3基因構建回補載體LCF3∶pCAMBIA1300-COM； 以LCF32F∶ 5'-GGGAA GCTTCAGATATAGTTCACAGCAACAT-3'和LCF32R∶5'-CCCGGATCCGCGGAGGCAGTAAAGCTAGCC-3'為引物構建pLCF3∶pCAMBIA1391-GUS載體； 以野生型Col的cDNA為模板， 分別以LCF33F∶ 5'-GGGG GTACCATGGCTAGCTTTACTGCCTCCG-3'和LCF3 3R∶ 5'-GGGGGATCCGAGTGAAAGACCAGATTCT TC-3'及LCF34F∶ 5'-GGGAAGCTTATGGCTAGCTTT ACTGCCTCCG-3'和LCF34R∶ 5'-GGGGGTACCGA GTGAAAGACCAGATTCTTC-3'為引物構建帶GFP標簽的永久表達載體LCF3∶super1300+-GFP和瞬時表達載體LCF3∶∶pHBT-GFP。將以上獲得的重組載體分別以農桿菌介導［18］或者PEG介導［19］的方法轉入突變體lcf3-1或野生型擬南芥Col， 以及野生型Col葉肉細胞原生質體。對其中永久表達植株通過潮霉素篩選獲得陽性轉基因材料進行功能分析， 葉肉細胞原生質體瞬時表達LCF3∶GFP在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光， 進行LCF3蛋白亞細胞定位分析。

1.5 葉綠素熒光的測定

參照 Wang等［20］方法進行 β-葡糖苷酸酶（GUS）的組織化學染色和共聚焦顯微鏡觀察 GFP熒光定位。利用葉綠素熒光成像儀（CF Imager， Technologica公司）于25℃下測定葉綠素熒光猝滅過程。葉片暗適應30 min后， 測定Fv/Fm值。Fv/Fm比值反映光合系統II光化學反應的最大光合效率。該參數被廣泛應用于光合系統受脅迫程度的檢測， Fv/Fm值降低暗示光合系統II受損傷。

2 結果與分析

2.1 葉綠素熒光突變體lcf3-1的表型分析

突變體 lcf3-1在植株形態和葉片顏色及開花時間上與野生型均無明顯差異。在培養皿中培養lcf3-1 10 d后， 利用葉綠素熒光成像儀檢測其葉綠素熒光表型， 發現突變體Fv/Fm值低于Col及Ler野生型（圖1-B）。將突變體lcf3-1移栽土中培養25 d后， 其Fv/Fm值仍低于野生型（圖1-D）， 數據統計分析顯示兩者之間存在顯著相差（P ＜ 0.05）。經暗處理3 d后， 二者在葉綠素含量上無明顯區別（圖2-A）， 但二者Fv/Fm值相差0.20左右， 較暗處理前差異明顯增大（圖2-B）。

圖1 葉綠素熒光突變體的篩選Fig.1 Mutants screening by chlorophyll fluorescence imaging

圖2 lcf3-1突變體葉綠素含量及Fv/Fm值Fig.2 Chlorophyll content and chlorophyll fluorescence Fv/Fmin WT and lcf3-1 mutant

表1 突變體遺傳分析Table 1 Genetic analysis of lcf3-1 mutant

2.2 突變體lcf3-1的遺傳分析

將突變體與Col野生型回交， 回交F1代所有植株均表現野生型表型， F1代自交得到F2代， F2代種下后經暗處理， 葉綠素熒光成像檢測Fv/Fm， 發現F2代表型出現分離， 分離比例接近 3∶1 （表 1）， 這表明lcf3-1為單基因隱性突變， 可以通過圖位克隆的方法找到該突變位點。

2.3 LCF3基因的圖位克隆

將lcf3-1突變體和Ler野生型雜交得到F1代， F1自交得到F2代， 挑選F2代中具有lcf3-1突變體表型的88株植株分別提取DNA， 利用TAIR網站上的引物（marker）信息粗定位。經過 PCR及凝膠電泳檢測發現lcf3-1突變位點與第 2染色體中下游NGA168 BAC明顯連鎖， 重組率約為10.94%。由此推斷， 該突變基因位于第 2染色體下端附近。在此基礎上擴大遺傳群體， 用616個F2代lcf3-1低葉綠素熒光表型植株的DNA在NGA168 BAC的兩端分別設計引物進一步細定位， 發現突變位點可能位于 T6B20 BAC上， 重組率為1.62% （圖3-A）。通過進一步精細定位和測序確定突變基因為 At2G30570， 該基因只含有一個內含子， lcf3-1突變體中At2G30570內含子的3′端剪接邊界區發生突變， 由鳥嘌呤（G）轉換為腺嘌呤（A）（圖3-B）， 從而使lcf3-1突變體中LCF3基因的 mRNA出現不同大小的剪接版本（圖 4）， 表明lcf3-1突變體中LCF3正常的剪接過程出現了錯誤。

2.4 LCF3影響葉綠素熒光表型的功能驗證

從SALK中心獲得了PsbW （At2G30570）基因的T-DNA插入突變體 SAIL_885_A03， 命名為 lcf3-2，并通過半定量RT-PCR檢測其At2G30570未表達（圖5）。在lcf3-1突變體背景下構建了PsbW自身啟動子驅動的 PsbW回補轉基因植株， 暗處理后， 突變體lcf3-1和lcf3-2均顯示出明顯低于野生型的低葉綠素熒光表型（圖6-A）， 而lcf3-1突變體背景的回補轉基因植株則表現出和野生型相似的表型（圖6-B）。這一結果進一步證實 lcf3-1突變體的低葉綠素熒光表型是由LCF3/PsbW （At2G30570）基因突變所致。

2.5 LCF3蛋白亞細胞定位分析

LCF3基因突變導致擬南芥低葉綠素熒光表型，推斷 LCF3蛋白可能是在葉綠體中發揮作用。pHBT-GFP空載體轉化擬南芥葉肉細胞原生質體時，GFP熒光幾乎充滿整個細胞質部分（圖7-A）。融合蛋白LCF3∶∶GFP的綠色熒光則特異地出現在細胞內葉綠體中（圖7-B）。另外LCF3∶super1300+-GFP永久轉基因植株也顯示氣孔保衛細胞中LCF3∶GFP融合蛋白綠色熒光與葉綠體紅色自發熒光完全重合（圖7-C）。以上結果說明LCF3蛋白定位于葉綠體中。

圖3 LCF3基因的克隆Fig.3 Map-based cloning of LCF3 gene

圖4 lcf3-1突變體基因突變位點分析Fig.4 Analysis of mutation site of lcf3-1 mutant

圖5 野生型及lcf3-2突變體中LCF3基因表達情況Fig.5 Expression analysis of LCF3 in WT and T-DNA insertion line lcf3-2 by RT-PCR

圖6 LCF3基因突變導致低葉綠素熒光表型的驗證Fig.6 Verification of the function of LCF3 gene on chlorophyll fluorescence

2.6 LCF3基因組織表達分析

利用分離得到的 LCF3基因啟動子與報告基因GUS融合的轉基因植株， 檢測 LCF3在擬南芥不同組織中的表達模式。組織化學染色表明， 14 d齡植株葉片與根成熟區有強烈的GUS表達， 而根尖分生組織沒有GUS表達。植物抽薹后對花進行GUS活性染色， 發現花萼、花藥以及柱頭中均有GUS表達（圖8）。這一結果暗示LCF3可能在植物發育的不同時期均有作用。

3 討論

本文根據葉綠素熒光動力學原理， 用葉綠素熒光成像儀篩選出熒光參數 Fv/Fm值比野生型低的擬南芥突變體 lcf3-1， 并發現其低葉綠素熒光表型可以穩定遺傳。對lcf3-1突變體的遺傳分析表明， lcf3-1是單基因隱性突變體。突變基因經圖位克隆最終將突變位點限定在擬南芥第2染色體中下部的T6B20 和F7F1 BAC之間， 對這2個BAC間所有基因的生物信息學分析， 找到 3個可能與光合作用有關的基因， 并進行基因測序， 最終認定lcf3-1突變體中突變基因LCF3為At2G30570。在lcf3-1突變體中， 該基因內含子3'邊界一個堿基發生突變， 由鳥嘌呤（G）轉換為腺嘌呤（A）。該突變導致LCF3基因的轉錄本在剪切成熟過程中發生錯誤， 部分轉錄本的內含子無法被剪切， 導致所編碼的蛋白功能異常。我們所克隆的LCF3突變基因與已經報道的PsbW基因是等位基因。LCF3基因突變導致擬南芥葉綠素熒光Fv/Fm值低于野生型。LCF3的 T-DNA插入缺失突變體lcf3-2也表現出類似于lcf3-1的低葉綠素熒光表型。結合我們獲得的表型回補轉基因植株能夠恢復擬南芥 lcf3-1突變體低葉綠素熒光表型， 證明該突變體出現的低葉綠素熒光表型確實是由PsbW （At2G30570）基因突變所致。

圖7 LCF3蛋白亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of LCF3

圖8 LCF3基因的組織表達分析Fig.8 Organ-specific expression of LCF3 in Arabidopsis

PsbW基因編碼一個分子量為6.1 kD的小分子蛋白， 存在于真核光合細胞中， 是光系統 II蛋白復合體的一個成分。已有文獻報道PsbW基因T-DNA插入敲除突變體與反義抑制突變體均導致光系統 II超分子復合體不穩定［14］。只有光系統 II （PSII）與集光復合體（LHCII）未結合形成超分子復合體時， 能夠檢測或分離出游離的PsbW蛋白。PsbW蛋白缺失表現出葉綠素熒光參數 Fv/Fm減少， 光系統 II核心蛋白磷酸化作用顯著降低， 以及暗適應葉片中質體醌池氧化還原狀態的明顯改變。此外， PsbW蛋白缺失還導致質體醌池中氧化還原反應加快。PsbW缺失突變體和反義抑制突變體能夠光自養正常生長， 說明PsbW蛋白對光合細胞來說不是必不可少的亞基。雖然PsbW缺失突變體植株PSII-LHCII超復合體結構改變， 但突變體細胞中葉綠體結構與野生型類似。因此PSII-LHCII超分子復合體的穩定性對植物葉綠體類囊體膜上基粒的形成可能不是必需條件［21］。PsbW 蛋白亞基在高等植物葉綠體中的進化源于陸生植物， 其與葉綠體膜上的捕光天線色素蛋白一起參與光合作用。PsbW蛋白可能細微調整PSII-LHCII超復合體的組裝及穩定， 因此能在葉綠體基粒膜上形成PSII-LHCII超復合體的有序排列， 優化陸生植物的光合作用， 有效地應對植物生存環境條件的改變。

葉綠素熒光動力學技術作為光合作用研究手段，在植物光合作用突變體篩選中起到了重要作用［22-24］，本文的實驗結果也印證了這一點。同時這一技術也隨著人們對光合作用認識的不斷深入而改進。

4 結論

利用圖位克隆技術成功克隆到 LCF3基因。該基因突變導致擬南芥葉綠素熒光降低。lcf3-1突變體的葉綠素熒光表型為 At2G30570基因突變所致。LCF3基因在植物中普遍性表達。LCF3定位于葉綠體， 與其參與光合作用調節的功能相吻合。

References

［1］Qin X， Suga M， Kuang T， Shen J R.Photosynthesis Structural basis for energy transfer pathways in the plant PSI-LHCI supercomplex.Science， 2015， 348∶ 989-995

［2］Waters M T， Wang P， Korkaric M.GLK transcription factors coordinate expression of the photosynthetic apparatus in Arabidopsis.Plant Cell， 2009， 21∶ 1109-1128

［3］Barber J.Photosystem II∶ an enzyme of global significance.Biochem Soc Trans， 2006， 34∶ 619-631

［4］Shi L X， Schr?der W P.The low molecular mass subunits of the photosynthetic supracomplex， photosystem II.Biochim Biophys Acta， 2004， 1608∶ 75-96

［5］Irrgang K D， Shi L X， Funk C， Schr?der W P.A nuclear-encoded subunit of the photosystem II reaction center.J Biol Chem， 1995，270∶ 17588-17593

［6］Lorkovi? Z J， Schr?der W P， Pakrasi H B， Irrgang K D， Herrmann R G， Oelmuller R.Molecular characterization of PsbW， a nuclearencoded component of the photosystem-II reaction-center complex in spinach.Proc Natl Acad Sci USA， 1995， 92∶8930-8934

［7］Shi L X， Schr?der W P.Compositional and topological studies of the PsbW protein in spinach thylakoid membrane.Photosynth Res， 1997， 53∶ 45-53

［8］Bishop C L， Purton S， Nugent J H.Molecular analysis of the Chlamydomonas nuclear gene encoding PsbW and demonstration that PsbW is a subunit of photosystem II， but not photosystem I.Plant Mol Biol， 2003， 52∶ 285-289

［9］Shi L X， Lorkovic Z J， Oelmuller R， Schr?der W P.The low molecular mass PsbW protein is involved in the stabilization of the dimeric photosystem II complex in Arabidopsis thaliana.J Biol Chem， 2000， 275∶ 37945-37950

［10］Rokka A， Suorsa M， Saleem A， Battchikova N， Aro E M.Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes∶ multiple assembly steps of photosystem II.Biochem J， 2005， 388∶ 159-168

［11］Thidholm E， Lindstrom V， Tissier C， Robinson C， Schr?der W P，Funk C.Novel approach reveals localisation and assembly pathway of the PsbS and PsbW proteins into the photosystem II dimer.FEBS Lett， 2002， 513∶ 217-222

［12］Granvogl B， Zoryan M， Ploscher M， Eichacker L A.Localization of 13 one-helix integral membrane proteins in photosystem II subcomplexes.Anal Biochem， 2008， 383∶ 279-288

［13］Dobáková M， Sobotka R， Tichy M， Komenda J.Psb28 protein is involved in the biogenesis of the photosystem II inner antenna CP47 （PsbB） in the cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803.Plant Physiol， 2009， 149∶ 1076-1086

［14］García-Cerdán J G， Kovács L， Tóth T， Kere?che S， Aseeva E，Boekema E J， Mamedov F， Funk C， Schr?der W P.The PsbW protein stabilizes the supramolecular organization of photosystem II in higher plants.Plant J， 2011， 65∶ 368-381

［15］Massoz S， Larosa V， Horrion B， Matagne R F， Remacle C， Cardol P.Isolation of Chlamydomonas reinhardtii mutants with altered mitochondrial respiration by chlorophyll fluorescence measurement.J Biotechnol， 2015， 215∶ 27-34

［16］Genty B， Briantais J M， Baker N R.The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence.Biochim Biophys Acta （BBA）-General Subjects， 1989， 990∶ 87-92

［17］van Kooten O， Snel J F.The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology.Photosynth Res， 1990， 25∶ 147-150

［18］Clough S J， Bent A F.Floral dip∶ a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J， 1998， 16∶ 735-743

［19］Yoo S D， Cho Y H， Sheen J.Arabaidopsis mesophyll protoplasts∶A versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Prot， 2007， 2∶ 1565-1572

［20］Wang P T， Liu H， Hua H J， Wang L， Song C P.A vacuole localized β-glucosidase contributes to drought tolerance in Arabidopsis.Chin Sci Bull， 2011， 56∶ 3538-3546

［21］Sun Q， Emanuelsson O， van Wijk K J.Analysis of curated and predicted plastid subproteomes of Arabidopsis∶ subcellular compartmentalization leads to distinctive proteome properties.Plant Physiol， 2004， 135∶ 723-734

［22］Baker N R.Chlorophyll fluorescence∶ a probe of photosynthesis in vivo.Annu Rev Plant Biol， 2008， 59∶ 89-113

［23］Murchie E H， Lawson T.Chlorophyll fluorescence analysis∶ a guide to good practice and understanding some new applications.J Exp Bot， 2013， 64∶ 3983-3998

［24］Maxwell K， Johnson G N.Chlorophyll fluorescence∶ a practical guide.J Exp Bot， 2000， 51∶ 659-668

DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00690

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 王棚濤， E-mail∶ wangpt126@126.com

收稿日期Received（）∶ 2015-06-09； Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11； Published online（網絡出版日期）∶ 2016-01-25.

Map-based Cloning and Functional Analysis of Low Chlorophyll Fluorescence Gene LCF3 in Arabidopsis thaliana

LIU Ling-Yun， LIU Hao， ZHAO Jing， WANG Yan-Xia， and WANG Peng-Tao*
Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology/State Key Laboratory of Cotton Biology/College of Life Sciences， Henan University， Kaifeng 475004， China

Abstract：Chlorophyll fluorescence has exclusive role for determining the kinetics of light energy absorption， transmission， dissipation and distribution in leaf photosynthesis.In this study， a mutant was screened by chlorophyll fluorescence equipment from EMS mutagenesis of wild-type Arabidopsis Col-0， which showed lower Fv/Fmthan wild-type and was named lcf3-1 （lower chlorophyll fluorescence 3-1）.Genetic analysis of lcf3-1 mutant suggested that the mutation was controlled by single recessive gene.LCF3 gene， which encodes PsbW protein， was isolated by map-based cloning.The T-DNA insertion mutant lcf3-2 showed low chlorophyll fluorescence phenotype as lcf3-1， and this phenotype could be complemented by LCF3 gene of wild-type.These experiments implied that the phenotype of low-chlorophyll-fluorescence resulted from LCF3 gene mutation.Furthermore， our results indicated that LCF3 protein is located in chloroplast and LCF3 gene is expressed in various tissues.PsbW protein is important for the contact and stability between several PSII-LHCII supercomplexes.

Keywords：Arabidopsis thaliana； Chlorophyll fluorescence； Photosynthesis； Map-based cloning