普通小麥類胡蘿卜素組分的超高效液相色譜分離方法

李文爽夏先春何中虎，2，*

1中國農業科學院作物科學研究所/國家小麥改良中心， 北京100081；2CIMMYT中國辦事處， 北京100081

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普通小麥類胡蘿卜素組分的超高效液相色譜分離方法

李文爽1夏先春1何中虎1，2，*

1中國農業科學院作物科學研究所/國家小麥改良中心， 北京100081；2CIMMYT中國辦事處， 北京100081

摘 要：類胡蘿卜素是影響小麥面粉及面制品顏色和營養品質的重要因素。本研究以中麥 175 （軟質麥）和中優 206（硬質麥）的面粉為試驗材料， 旨在優化小麥類胡蘿卜素提取方法， 建立超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography， UPLC）測定其組分的技術體系。研究表明， 用含0.1% BHT的正己烷∶丙酮（80∶20， v/v）混合液作為提取液， 結合恒溫振蕩法（300轉 min-1， 35℃， 振蕩1 h）的提取效果最好。以YMC C30胡蘿卜素分析專用色譜柱（高100 mm， 直徑4.6 mm， 粒徑3 μm）洗脫， 乙腈∶甲醇∶水∶三乙胺（81∶14∶5∶0.05， v/v/v/v）為流動相A， 甲醇∶乙酸乙酯∶三乙胺（68∶32∶0.05， v/v/v）為流動相B， 流速0.4 mL min-1， 柱溫35℃， 分離時間25 min； 以二極管陣列檢測器（photodiode array， PDA）在450 nm波長下， 能有效檢測葉黃素、玉米黃質和β-胡蘿卜素3種組分。該技術體系可作為普通小麥類胡蘿卜素組分及營養品質研究的有效方法。

關鍵詞：普通小麥； 類胡蘿卜素組分； 超高效液相色譜

本研究由引進國際先進農業科學技術計劃（948計劃）項目［2011-G（3）4］和科技部小麥玉米高效分子標記體系的研發和應用項目（2013DFG30530）資助。

This study was supported by the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology ［2011-G（3）4］and Ministry of Science and Technology （2013DFG30530）.

第一作者聯系方式∶ E-mail∶ lwshuang2012@163.com

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1605.008.html

類胡蘿卜素是呈紅色、黃色和橙色的一類碳氫化合物及其氧化衍生物， 屬脂溶性色素， 其結構由8個類異戊二烯單位通過首尾連接而成， 包括 700多個家族成員。類胡蘿卜素在人類營養和健康方面有重要作用， 一些類胡蘿卜素是維生素 A的前體物質。維生素 A又稱視黃醇， 是脂溶性維生素， 其動物性來源的稱維生素 A， 而植物性來源的稱維生素A原， 即類胡蘿卜素， 人體攝入后可以轉化成有生理活性的維生素A。維生素A有很多重要生理功能，能維持正常視覺功能， 預防老年性黃斑變性和夜盲癥的發生， 維持骨骼正常生長發育以及抑制腫瘤生長。維生素 A缺乏癥在第三世界國家非常嚴重， 導致死亡率上升［1］。同時， 所有類胡蘿卜素都具有抗氧化能力， 可以降低慢性病發生， 增強免疫［2-3］。人類和動物自身不能合成類胡蘿卜素， 必須從外界攝取［4-5］。近年來， 谷物籽粒中的類胡蘿卜素組分及其含量研究受到越來越多的關注［6］， 已克隆了一些與類胡蘿卜素生物合成相關的基因［7-10］， 并定位了與類胡蘿卜素含量相關的QTL［11-12］。大部分研究集中在類胡蘿卜素含量較高的玉米， 主要做法是通過遺傳育種方法提高類胡蘿卜素的含量或改變籽粒中不同類胡蘿卜素組分的比例。通過轉入與胡蘿卜素合成相關的基因， 已獲得外表為金黃色的轉基因大米， 被稱為“黃金大米”， 可幫助人體增加維生素A的吸收［13-15］。

普通小麥是世界性的重要谷物， 約占全球作物種植面積的 17%， 為人類提供了約20%的能量和蛋白［16］。我國是全球小麥生產和消費量最大的國家，常年種植面積約為2400萬公頃， 總產量約為1.2億噸［17］。隨著經濟發展、生活質量提高， 面粉及面制品的營養和外觀品質越來越受到重視， 并已成為小麥品質改良的重要方向［18-19］。黃色素是小麥籽粒中最主要的天然色素， 其含量高低是評價面粉色澤的重要指標， 與面粉及面團黃度的相關系數高達 0.8～0.9［20］。類胡蘿卜素是黃色素的主要成分， 影響面粉顏色和營養品質。雖已對黃色素含量進行QTL定位，并發掘驗證了相關功能標記［21-22］， 但國內有關小麥類胡蘿卜素組分及其含量的研究尚未見報道。

測定植物類胡蘿卜素的常用方法有分光光度法和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）， 其中， 分光光度法易操作且對類胡蘿卜素提取純度要求不高， 但該方法只能測定類胡蘿卜素總量， 不能檢測各組分的含量； 高效液相色譜法可用于多種類胡蘿卜素組分的分離， 但分離非極性的類胡蘿卜素（如 β-胡蘿卜素）時， 分析時間過長， 并且尚未建立測定普通小麥類胡蘿卜素的通用方法［23-24］。隨著色譜學的發展， 超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）應運而生， UPLC是在HPLC理論與原理的基礎上形成的， UPLC所配套的分析柱， 使用的填料更小， 整個 UPLC系統體積降低， 從而提高了色譜峰容量、靈敏度及分析通量。Hung等［25］利用UPLC檢測了硬粒小麥類胡蘿卜素組分， 但僅獲得了葉黃素和 β-胡蘿卜素含量， 沒有檢測到玉米黃質含量， 而有關普通小麥類胡蘿卜素組分含量的UPLC分析尚未見報道。

針對上述問題， 本研究旨在建立靈敏、快速的普通小麥類胡蘿卜素組分定量分析的 UPLC方法，為類胡蘿卜素的遺傳改良及相關研究提供表型測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及磨粉方法

中麥175 （軟質麥）和中優206 （硬質麥）用于體系建立， 2011—2012年度種植于北京。20份冬小麥品種用于UPLC與HPLC方法比較， 其中北部冬麥區品種6個， 包括晉麥61、晉麥67、京冬8號、CA9719、CA9722和京9428； 黃淮麥區品種12個， 包括晉麥45、煙農18、煙優361、魯麥23、高優503、豫麥50、85中33、蘭考24、豫麥49、豫麥63、皖麥19和皖麥38； 長江中下游麥區品種2個， 包括徐州25和揚麥158。這20份品種于2011—2012年度分別種植于北京、河南安陽和安徽濉溪， 沒有發生穗發芽，收獲后將籽粒自然曬干， 低溫貯藏。

用Perten Instruments North America公司（Reno，NV， Sweden）生產的4100型單籽粒谷物特性測試儀（Single Kernel Characterization System， SKCS）測定籽粒硬度和水分含量。用 Brabender Quandrmat Junior （Brabender Inc.， Duisberg， Germany）磨， 按AACC 26-50 （1995）方法潤麥和制粉。為避免色素被一些酶類氧化， 將面粉儲存于18℃暗光環境。

1.2 類胡蘿卜素組分及混合樣品制備

谷物中類胡蘿卜素主要有玉米黃質、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素［26］。葉黃素（純度≥90%）、玉米黃質（純度≥95%）和β-胡蘿卜素（純度≥95%）標樣購自Sigma公司， α-胡蘿卜素（純度≥97%）標樣購自CaroteNature公司。

葉黃素、玉米黃質、α-胡蘿卜素和 β-胡蘿卜素的固體標準樣品先用四氫呋喃徹底溶解， 再用甲醇稀釋獲得0.1 mg mL-1葉黃素、0.1 mg mL-1玉米黃質、0.1 mg mL-1α-胡蘿卜素和0.05 mg mL-1β-胡蘿卜素標準溶液， 葉黃素、玉米黃質、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素按體積比為 8∶2∶4∶6配置成混合標準樣品。利用HPLC和UPLC對4種單組分標樣和混合標樣進行分析， 根據單組分標準樣品的保留時間，確定混合標樣中各組分。將配好的混合標準樣品用甲醇稀釋為原濃度的1/2、1/4、1/8、1/10， 制作標準曲線， 峰面積為縱坐標， 樣品濃度為橫坐標。

1.3 試驗樣品提取方法

從提取類胡蘿卜素的常用溶劑中選取 5種混合溶劑， 其成分組成和比例（v/v）分別是正己烷∶丙酮（80∶20）、丙酮∶甲醇（70∶30）、丙酮∶石油醚（50∶50）、甲醇∶四氫呋喃（50∶50）和甲醇∶二氯甲烷（45∶55）。混合溶劑中加入 0.1%的抗氧化劑——丁羥甲苯（butylated hydroxytoluene， BHT）。

用超聲波法提取時， 先準確稱取8.0 g面粉， 置于三角瓶中， 加入 40 mL樣品提取液， 漩渦振蕩 2 min， 然后放入KQ-500DB數控超聲清洗器中， 在20℃、100 Hz條件下超聲提取1 h。然后， 將上清液轉移到50 mL塑料離心管中， 23 500 × g離心15 min；上清液過0.45 μm的油性濾膜后轉入液相小瓶中。

用恒溫振蕩法提取時， 先稱取8.00 g小麥面粉，加入40 mL樣品提取液， 漩渦振蕩2 min， 再于35℃恒溫振蕩器中300轉 min-1振蕩1 h； 然后將上清液轉移到50 mL塑料離心管中， 23 500 × g條件下離心 15 min； 將上清液轉移到 100 mL燒杯中， 用TTL-DCII型氮吹儀（北京同泰聯公司）將溶劑吹干，所得殘渣即為類胡蘿卜素。再用1.5 mL含0.1% BHT的甲醇∶乙酸乙酯（68∶32， v/v）溶解， 置于2 mL棕色離心管中， 在分析使用之前置于-20℃條件下保存， 經4℃條件下15 000 × g離心20 min后， 取上清液過 0.22 μm油性濾膜至進樣小瓶中， 進樣量為 8 μL。所有提取樣品需在24 h內完成分析。

1.4 洗脫條件及類胡蘿卜素組分含量計算

1.4.1 HPLC法 流動相A為乙腈∶甲醇∶三乙胺（85∶15∶0.05， v/v/v）， 流動相B為甲醇∶乙酸乙酯∶三乙胺（68∶32∶0.05， v/v/v）， 配制的流動相應以 0.45 μm油性濾膜過濾， 流動相使用前超聲脫氣20 min。洗脫梯度為0 min時100%流動相A， 5 min 時100%流動相A， 45 min時0%流動相A， 55 min時100%流動相A。胡蘿卜素分析專用色譜柱YMC C30 （4.6 mm × 250.0 mm， 粒徑5 μm）， 流速為1.0 mL min-1， 檢測波長450 nm。HPLC色譜系統為Waters 2695， 利用工作站軟件 Millennium 32， 根據標準樣品的保留時間判斷樣品中類胡蘿卜素的組分。

1.4.2 UPLC法 流動相A為乙腈∶甲醇∶水∶三乙胺=81∶14∶5∶0.05 （v/v/v/v）， 流動相 B為甲醇∶乙酸乙酯∶三乙胺=68∶32∶0.05 （v/v/v）， 配制的流動相應以 0.22 μm油性濾膜過濾， 流動相在使用前超聲脫氣20 min。洗脫梯度為0 min時100%流動相A， 0.3 min時100%流動相A， 12 min時0%流動相A， 20 min時0%流動相A， 22 min時100%流動相A， 25 min時100%流動相A。YMC C30胡蘿卜素分析專用色譜柱（高100 mm， 直徑4.6 mm， 粒徑3 μm）， 流速為0.4 mL min-1， PDA檢測波長450 nm。UPLC色譜系統為Waters Acquity系統， 利用工作站軟件Empower Pro （version 2.0）， 根據標準樣品的保留時間判斷樣品中類胡蘿卜素的組分， 并采用不同濃度的混合標準樣品與對應的峰面積值間的關系制作標準曲線（R2＞ 0.9990）， 采用自動積分獲取樣品的峰面積， 再根據標準曲線計算樣品相關組分含量。

1.5 統計分析

用Statistical Analysis System （SAS9.1）進行基本統計量分析和差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 提取液選擇

選擇5種類胡蘿卜素提取溶液（均含0.1%的BHT）， 分別提取中麥175和中優206面粉樣本的類胡蘿卜素， 用葉黃素含量來判斷提取效果。結果表明，正己烷∶丙酮（80∶20， v/v）的提取效果最好， 而另4種提取方法沒有顯著差異。因此， 本試驗選用正己烷∶丙酮（80∶20， v/v）作為小麥類胡蘿卜素的提取溶劑（表1）。

2.2 提取方法選擇

比較超聲和恒溫振蕩兩種常用方法的提取效果，可以看出， 兩種對中麥175面粉中葉黃素提取量的影響差異不顯著， 而對中優206面粉葉黃素提取量有顯著影響（P＜0.05）； 從提取量看， 恒溫振蕩法在2個品種提取到的葉黃素含量均高于超聲法。同時，恒溫振蕩法對溫度控制較穩定， 而超聲法中水溫會逐漸升高， 降低了樣品間提取條件的重復性。因此，本文最終選用恒溫振蕩法作為小麥類胡蘿卜素的提取方法（表2）。

2.3 保留時間確定

根據類胡蘿卜素4種組分（葉黃素、玉米黃質、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素）單個標準樣品的保留時間確定混合標準樣品的保留時間， 如圖 1所示， 各組分的保留時間可明顯區分， 其中葉黃素的保留時間為12.173 min， 玉米黃質為13.203 min， α-胡蘿卜素為18.472 min， β-胡蘿卜素為20.836 min。在檢測4種組分時， 沒有檢測到 α-胡蘿卜素， 玉米黃質和 β-胡蘿卜素分離出的峰形小且響應值較低。

2.4 UPLC分析方法重復性驗證

對制作標準曲線的 5種不同濃度的標準樣品連續進樣進行測定， 檢測到的峰形從左到右依次為葉黃素、玉米黃質、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素（圖2）。可以看出， 類胡蘿卜素的4種組分在UPLC洗脫梯度下保留時間重復性相對穩定。加樣回收率， 葉黃素為 92.3%， 玉米黃質為 94.8%， β-胡蘿卜素為51.0%， 3種組分總量為85.9%。為了便于觀察提取及分離量化的穩定性， 在多樣品分析中需增加對照樣品， 每20個樣品增加一個對照。根據對照樣品中測定的類胡蘿卜素各組分峰形圖的保留時間及含量的分析， 判斷系統的穩定性及檢測的準確性， 從而保證所有樣品測定結果的一致性。

表1 不同提取液提取小麥樣品葉黃素含量比較Table 1 Lutein contents in samples using different solvents

表2 不同提取方法提取小麥樣品葉黃素含量比較Table 2 Lutein contents in samples using different methods

圖1 樣品中葉黃素（a）、玉米黃質（b）、α-胡蘿卜素（c）和β-胡蘿卜素（d）的UPLC峰形圖Fig.1 UPLC chromatograms of lutein （a）， zeaxanthin （b）， α-carotene （c）， and β-carotene （d）

2.5 UPLC與HPLC法比較

選取晉麥61等20份小麥品種， 分別利用UPLC體系與 HPLC體系測定其面粉葉黃素含量， 兩種方法的決定系數為0.96 （圖3）， 說明本研究建立的UPLC方法用于小麥類胡蘿卜素組分含量測定可行。HPLC體系對玉米黃質和 β-胡蘿卜素無法進行定量分析， 而 UPLC體系則可以將這兩種組分分離并定量。因此， UPLC方法具有分析通量高、檢測靈敏度高的特點， 與 HPLC相比， 還提高了葉黃素與玉米黃質的分離度。

圖2 連續5次進標準樣品峰形圖Fig.2 Consecutive UPLC separations of carotenoids standards in calibration curves with optimized conditions

3 討論

3.1 類胡蘿卜素提取方法優化

普通小麥類胡蘿卜素各組分定量研究尚無統一提取方法， 以水飽和正丁醇提取法較為常用［28-29］，但所使用的有機溶劑——水飽和正丁醇與UPLC體系中使用的流動相不兼容， 且該溶劑黏度大， 氮氣吹干過程時間很長， 因此， 本研究建立了能夠適應UPLC檢測體系并能大批量提取小麥類胡蘿卜素的方法。Burkhardt和B?hm［30］曾使用甲醇和四氫呋喃混合液提取硬粒小麥類胡蘿卜素， 但我們發現該方法的提取效果不及丙酮與甲醇混合液和正己烷與丙酮混合液。Oliver等［31］還使用過皂化方法進行提取類胡蘿卜素， 但提取時間長， 且可能破壞類胡蘿卜素的結構。Hung和Hatcher［25］用水飽和正丁醇作為提取溶劑， 需在黑暗環境下過夜提取； 與之相比，本研究的提取過程更短、效率較高、重復性好， 兩次提取相關性為 0.99， 因此認為， 該方法可用于提取普通小麥類胡蘿卜素。

圖3 UPLC體系與HPLC體系提取類胡蘿卜素相關性分析Fig.3 Correlation between lutein contents in wheat flour extracts from UPLC and HPLC systems

3.2 UPLC體系建立

利用HPLC體系測定小麥籽粒中類胡蘿卜素含量， 單個樣品所用時間約為60 min［30， 32-34］， UPLC體系測定類胡蘿卜素的分離度、測定速度和靈敏度更高， 本文中的UPLC測定體系檢測時間僅為25 min。HPLC體系進樣量為50 μL， 而UPLC僅為8 μL， 用量減少約80%。同時HPLC法每針進樣所需流動相總用量約為60 mL， 而UPLC法僅需約10 mL， 約為HPLC法的1/6。通過計算加樣回收率， 該體系對葉黃素和玉米黃質的回收率較高， 達到 90%以上， 但對于 β-胡蘿卜素回收率相對較低， 這是由于 β-胡蘿卜素極不穩定， 在樣品處理和分離過程中都會有一定損失。

色譜柱是液相色譜分離分析的關鍵硬件［35］， 本研究選用YMC C30胡蘿卜素分析專用色譜柱， 與傳統的 C18色譜柱比， 它提供了足夠的相位厚度， 可增強與長鏈分子之間的相互作用， 利于分離雙鍵鍵合系統的異構體。葉黃素與玉米黃質為同分異構體，區別僅在一個雙鍵位置的不同， 因此使用YMC C30胡蘿卜素分析色譜柱能將兩者很好分離。

本研究中， UPLC法使用是高100 mm、直徑4.6 mm、粒徑3 μm的色譜柱， 一般認為粒徑低于2 μm的小顆粒作為固定相， 可以增加色譜柱的效能， 提高分離度。但小顆粒不僅要求系統能承受高于目前極限壓力（6000 psi/400 bar）， 更小的死體積， 并且能適應只有幾秒峰寬的高速檢測器。目前尚無用于檢測類胡蘿卜素的固定相粒徑更小的色譜柱， 我們曾使用現有的小顆粒填充的 UPLC色譜柱（ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm × 100.0 mm， 粒徑1.7 μm），但并不能很好分離葉黃素和玉米黃質兩種組分， 且 β-胡蘿卜素出峰時間比較靠后， 所以最終選用了粒徑為3 μm的YMC C30胡蘿卜素專用分析色譜柱。在本試驗中， 實際小麥樣品 β-胡蘿卜素保留時間較之標準樣品有些提前， 不過在誤差范圍內， 這是由于有機溶劑直接提取得到的類胡蘿卜素中會有雜質影響。隨著技術的發展以及 UPLC使用的普及， 若未來能設計一款專門測定類胡蘿卜素的固定相粒徑小于2 μm的色譜柱， 可更有效分析研究植物中類胡蘿卜素。

流動相可影響相關組分的分離效果， UPLC體系的流動相與 HPLC體系流動相組分相同， 只是在流動相 A中加入 5%純水， 目的是在超高壓的環境下，減少流動相的黏度。Hung和Hatcher［25］利用UPLC方法測定硬粒小麥類胡蘿卜素， 洗脫時間為 6 min，但只檢測到葉黃素與β-胡蘿卜素， 且根據Kean等［36］的研究推測色譜圖中的玉米黃質色譜峰， 并沒有利用標準樣品或是質譜檢測到玉米黃質。本研究可以將4種組分分離， 但多次進樣之后， β-胡蘿卜素的保留時間會延后， 這是由于類胡蘿卜素的提取過程相對簡單， 而 UPLC對樣品的前處理要求較高， 會因一些雜質殘留而使出峰時間延后。經過多次試驗，最終選定25 min的洗脫時間， 保證在最短的時間內更穩定地測定類胡蘿卜素組分。

4 結論

以類胡蘿卜素組分的 HPLC測定方法為基礎，通過技術條件改進和參數優化， 建立了 UPLC測定技術體系。該體系以含有0.1% BHT的正己烷∶丙酮（80∶20， v/v）混合溶液作為提取液， 利用恒溫振蕩法（300轉 min-1， 35℃， 振蕩1 h）提取面粉中的類胡蘿卜素， 采用胡蘿卜素分析專用色譜柱 YMC C30 （4.6 mm × 100.0 mm， 粒徑3 μm）； 流動相A為乙腈∶甲醇∶水∶三乙胺（81∶14∶5∶0.05， v/v/v/v）；流動相B為甲醇∶乙酸乙酯∶三乙胺（68∶32∶0.05，v/v/v）， PDA檢測波長450 nm， 流速0.4 mL min-1。流動相洗脫梯度為0 min時100%流動相A， 0.3 min 時100%流動相A， 12 min時0%流動相A， 20 min時0%流動相A， 22 min時100%流動相A， 25 min時100%流動相A。

致謝： 江蘇省農業科學院農業生物技術研究所張平平副研究員對本文提出了寶貴修改建議。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00706

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 何中虎， E-mail∶ zhhecaas@163.com

收稿日期Received（）∶ 2015-09-07； Accepted（接受日期）∶ 2016-03-02； Published online（網絡出版日期）∶ 2016-03-11.

Establishment of Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC） Protocol for Analyzing Carotenoids in Common Wheat

LI Wen-Shuang1， XIA Xian-Chun1， and HE Zhong-Hu1，2，*

1Institute of Crop Science/National Wheat Improvement Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences （CAAS）， Beijing 100081， China；2CIMMYT-China Office， c/o CAAS， Beijing 100081， China

Abstract：Carotenoids is an important criterion in the assessment of color and nutritional qualities of end-use products in common wheat.In this study， grain powders of Zhongmai 175 （soft wheat） and Zhongyou 206 （hard wheat） were used as samples to develop an optimal procedure for extraction and separation of carotenoids compositions extracted from flours using ultra performance liquid chromatography （UPLC）.The most effective extraction of carotenoids extraction was obtained using the solvent system of N-hexane； acetone of 80∶20 （v/v， 0.1% BHT w/v） under the oscillation condition of 300 r min-1， 35oC， and 1 h.The separation was conducted using YMC C30 Carotenoid column （100.0 mm × 4.6 mm， 3 μm） with photodiode array （PDA） detector， and the column was thermostated at 35°C.Under a gradient system consisting of acetonitrile∶methanol∶water∶triethylamine （81∶14∶5∶0.05， v/v/v/v） （A） and methanol∶ ethylacetate∶triethylamine （68∶32∶0.05， v/v/v） （B） at a constant flow rate of 0.4 mL min-1， the carotenoids of common wheat flour samples can be well separated in less than 25 min.Carotenoids were detected at 450 nm.All the present results provided useful information for carotenoids compositions and quality improvement.

Keywords：Triticum aestivum L.； Carotenodis compositions； UPLC