氨烷基磷酸鈉及其改性的羥基磷灰石對MG63細胞功能的影響*

劉　帥，孫富華，江依柔，謝興益

(四川大學 高分子科學與工程學院， 成都 610065)

?

氨烷基磷酸鈉及其改性的羥基磷灰石對MG63細胞功能的影響*

劉帥，孫富華，江依柔，謝興益

(四川大學 高分子科學與工程學院， 成都 610065)

摘要：氨烷基磷酸鈉(AAP-n-Na, n=2～6，為氨烷基的碳原子數)可用于制備羥基磷灰石(HA)膠體，是新型的HA表面改性劑，我們的前期研究已證實其無細胞毒性。進一步研究APP-n-Na及其改性HA(Cn-HA)對成骨樣細胞MG63功能的影響。研究結果表明，在0.1%濃度下，n=3,4,5的APP-n-Na對MG63細胞的堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OCP)的表達無不良影響，和陰性對照(空白培養基)的表達水平一致；所有APP-n-Na對礦化結節的形成無不良影響。Cn-HA的浸提液(0.1g/mL，以培養基為浸提介質)對ALP的表達和生物礦化均無不良影響，和對照樣(未改性HA和空白培養基)相比無顯著差異。研究預示APP-n-Na及其改性的HA用于骨修復材料是安全的。

關鍵詞：氨烷基磷酸；羥基磷灰石；成骨細胞；堿性磷酸酶；骨鈣素；鈣化結節

0引言

天然骨含有60%～70%的無機成分，主要為羥基磷灰石(HA)。因此HA在骨替代和修復材料中得到了廣泛的應用，比如作為人工髖關節的涂層來提高相容性[1]，作為頜面外科修復用的支架材料[2]，以及作為骨組織替代材料[3-4]等等。但單純的HA性脆，不能用于承力骨的部位。為此，許多研究者開發了HA/聚合物納米復合材料[5-8]，期望模仿天然骨的力學和生物學性能。

HA納米粒子在聚合物中的良好分散以及兩相界面間強的相互作用力是得到性能優異的骨修復用納米復合材料的關鍵[9-10]。迄今為止，這兩個問題均未得到很好的解決，因為親水性的HA很難均勻分散在疏水的聚合物材料中(如聚乳酸、聚己內酯等)。廣大的研究者對HA進行表面改性，接上了烷基鏈[11-12]、聚乙二醇鏈[7，13]、聚酯齊聚物[14-16]等等。這些方法對改進HA在聚合物中的分散性有一定的作用，但所得的復合材料與天然骨相比，無論是力學還是生物學性能均有很大差距。

我們最近開發了一類氨烷基磷酸NH2-(CH2)n-OPO4H2(AAP-n)[17-19]及其鹽,其磷酸根能夠和HA納米粒子表面的鈣離子以離子鍵結合，其氨基能夠電離成銨離子，使HA表面帶上正電荷，從而得到在水中穩定分散的HA膠體[18]。其顆粒表面的可反應的官能團氨基，為HA的進一步改性提供了廣闊的空間，有望制備性能優異的HA納米復合材料。但AAP-n及其鹽是一類新的HA改性劑，其對細胞功能的影響還未見報道。本文研究氨烷基磷酸鈉[NH2-(CH2)n-OPO4HNa,AAP-n-Na]及其改性的HA(Cn-HA，n為改性劑中C原子個數)對類成骨細胞MG63功能的影響。這些研究對AAP-n-Na及其改性的HA在骨修復材料中的應用具有重要的意義。

1實驗

1．1氨烷基磷酸鈉(APP-n-Na)的合成

APP-n-Na(n=3～6，為結構中C原子數)的合成過程主要分為3步：首先，用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)與氨基醇(H2N(CH2)nOH)上的氨基反應，生成Fmoc保護的氨基醇；其次，用POCl3將其磷酰化并水解，得到Fmoc保護的氨烷基磷酸單酯；最后，將該磷酸單酯用哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合液脫Fmoc保護基，用NaOH調pH值為8.6～8.9，在V(水)/V(乙醇)=3∶2中重結晶即得目標產物。具體合成方法已有文獻報道[19]。

氨乙基磷酸NH2-CH2CH2-OPO4H2(AAP-2)購自Sigma-Aldrich公司，其鈉鹽(APP-2-Na)由AAP-2與NaOH(摩爾比1∶1)中和而得。

1．2APP-n-Na改性HA(Cn-HA)的合成

Cn-HA是通過含鈣和磷的水溶液快速混合的濕化學過程制備的[18]。鈣溶液由0.006molCaCl2溶于15mL水中制的；磷溶液由0.0021molNaH2PO4和0.0036molAAP-n-Na(n=2，3，4，5或6)也溶于15mL水中制得。兩者混合后得白色沉淀，用NaOH調pH值為9～10，80 ℃陳化16h得淺藍色水膠體。將水膠體用BeckmanL8-80M超高速離心機在50 000r/min下離心10min，得到凝膠狀的半透明沉淀，用水清洗3遍以除去水溶性雜質。最后，將所有樣品冷凍干燥(-50 ℃，10Pa)24h，并在60 ℃下干燥10h，最終制得粉末狀Cn-HA(n=2～6)。元素分析表明所得HA的表面含有16%～30%的氨烷基磷酸鈣NH2-(CH2)n-OPO4Ca[18]。

1．3用含APP-n-Na的培養基培養MG63細胞

1.3.1堿性磷酸酶(ALP)檢測

將每種AAP-n-Na溶于PBS溶液中(1 %，質量分數)，過濾除菌，然后用細胞培養液稀釋到濃度0.1%，0.05%和0.01%作為待測液，其中細胞培養液是含10%胎牛血清和0.1%雙抗(青、鏈霉素)的DMEM培養基(FisherScientific，北京)。采用24孔板培養細胞，每孔加入培養基1mL，種植2×104個MG63細胞(華西醫學院，四川大學)；陰性對照組為不含AAP-n-Na的空白培養液。每組4個復孔。接種細胞的孔板放入37 ℃的CO2培養箱中。6d后，吸出孔中液體，用PBS緩沖液洗滌一次，每孔加入100μL1%RIPA強裂解液(碧云天，上海)，置于4 ℃裂解細胞膜30min。然后4 ℃ 14 000g離心15min，取上清液，用人堿性磷酸酶(ALP)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(碧云天，上海)來測量ALP含量。

用上述方法檢測了含0.1%AAP-n-Na的培養基對MG63細胞的堿性磷酸酶活性影響。測試時間為6和12d。

1.3.2骨鈣素含量及礦化結節染色

選取含0.1%AAP-n-Na的培養基作為待測液，用1.3.1節的方法培養細胞6、12d，裂解細胞膜，用人骨鈣素(OCN)ELISA試劑盒(碧云天，上海)來測量OCN含量。

為了觀察MG63細胞礦化結節的形成，將培養14d的細胞用PBS洗滌，再用10%福爾馬林固定30min。用0.1%茜素紅溶液(Solarbio，北京)染色30min，用去離子水洗滌3次，在OlympusIX71相差顯微鏡下(Olympus，日本)觀察并拍照。

1．4Cn-HA浸提液用于MG63細胞的培養

將Cn-HA粉末用無菌PBS浸泡(pH值=7.4)4h，棄去液體。然后用三蒸水浸提Cn-HA1d(0.1g/mL)，將浸提液用超濾離心管(截留分子量10 000，Minipore，美國)過濾，除去任何懸浮粒子(懸浮的納米粒子有細胞毒性[20])。濾液用于溶解DMEM粉末(FisherScientific，北京)，調pH值到7.2，然后用0.22μm濾膜過濾除菌，再加入0.1%雙抗、10%胎牛血清，成為待測細胞培養液。商品HA(Aldrich，美國)的浸提液制備的培養基和空白培養基作為對照培養液。

按照1.3.1節的方法培養MG63細胞6、12d后，裂解細胞，測定ALP活性。按照1.3.2節中礦化結節染色的操作，觀察培養了25d的MG63細胞的礦化結節。

2結果與討論

2.1AAP-n-Na對MG63細胞功能的影響

MG63細胞為人骨肉瘤細胞，能夠表達成骨細胞表型，是體外細胞培養常用的成骨樣細胞[21]。圖1(a)表明APP-n-Na的濃度在0.01%～0.1%范圍內對MG63細胞表達ALP幾乎沒有什么影響，與不加APP-n-Na的空白培養基差別不大。部分樣品與空白對照樣相比有統計學上的差異，但其表達的ALP量仍有對照樣的70%以上，顯示所有樣品在6d培養時間內均能正常表達ALP。為此，我們在較高的濃度下(0.1%)，培養更長的時間，來觀察MG63細胞功能蛋白的表達(圖2(b)和(c))。ALP和OCP的表達是類似的，在第6d，兩者的表達量和對照樣無明顯差異；而在第12d，含APP-2-Na和APP-6-Na的培養基培養的細胞ALP和OCP的表達量均低于對照樣；而n=3,4,5的APP-n-Na的樣品與對照樣相比，ALP和OCP的表達量與對照樣相比是相當的，其中APP-4-Na的骨鈣素的表達甚至高于對照樣。這些結果表明，n=3,4,5的APP-n-Na對MG63細胞功能蛋白的表達無不良影響。

圖1AAP-n-Na對MG63 細胞功能蛋白表達的影響。*: 和空白培養基相比有顯著差異

Fig1TheeffectsofAAP-n-NaonproteinexpressionsinMG63cells. *: P<0.05,comparedwiththeblankmedium(Student’sttest)

成骨細胞在體內最重要的功能就是促進骨的鈣化，其中ALP的作用是將有機磷轉化為磷酸根，參與HA的形成[22]；而骨鈣素能與鈣結合，直接參與鈣結節的形成，是骨礦化的標志性蛋白[23]。雖然APP-2-Na和APP-6-Na對ALP和OCP的表達有一定的抑制，但礦化情況未見明顯差異(圖2)，所有樣品均顯示明顯的礦化鈣結節；說明所有細胞釋放的ALP和OCP對于礦化都是足夠的。

圖2MG63細胞在含0.1%AAP-n-Na的培養基中培養14d后茜素紅染色照片。礦化鈣結節染成紅色。標尺：100μm

Fig2AlizarinredstainingofMG63cellsafter14daysofcultureinmediacontaining0.1%AAP-n-Na.Allthesamplesshowedcalciumnodulesthathavebeenstainedred.Scalebar: 100μm

2.2Cn-HA對MG63細胞功能的影響

圖3進一步研究了Cn-HA的浸提液對成骨細胞MG63ALP表達的影響。

圖3Cn-HA浸提液對MG63細胞ALP表達的影響。*：和未改性HA相比有顯著差異

Fig3TheextractsfromCn-HAhadaminoreffectontheALPexpressioninMG63cells.

*: P<0.05,comparedwiththeHAcontrol(Student’sttest)

在6d時間內，所有樣品對ALP的表達量無顯著差異；第12d時，C2-HA和C5-HA和對照樣HA相比，ALP表達無顯著差異；其余樣品C3-，C4-以及C6-HA雖與對照樣相比有統計學差異，但ALP表達的量仍達到了HA的約80%。考慮到實驗誤差，可以說AAP-n-Na改性HA對MG63細胞表達ALP幾乎沒有什么影響。

值得注意的是，雖然在ALP的表達上不同樣品有一定差異，但最終的礦化結果，不同樣品均能正常礦化，說明MG63細胞的功能并未受到很大影響。雖然改性劑本身以及不同Cn-HA對功能蛋白的表達有一定的差異，但隨著時間的增長，所有功能蛋白的表達都是增加的(圖1和3)，即長期看來，不同培養基培養的MG63細胞所表達的ALP對于鈣化都是足夠的，即不同樣品對MG63生物礦化沒有顯著影響。

我們以前的研究已證實，AAP-n-Na及其改性HA對MG63細胞的增殖和形貌是沒有影響的(即無細胞毒性)[19]。本研究經一步表明AAP-n-Na及其改性HA對MG63細胞的成骨功能也是沒有影響的。因此APP-n-Na及其改性HA在骨修復材料中的使用是安全的。

圖4MG63細胞在含Cn-HA浸提液的培養基中培養25d后茜素紅染色照片。礦化鈣結節染成紅色。標尺：100μm

Fig4AlizarinredstainingofMG63cellsafter25dofcultureinmediacontainingCn-HAextracts.Allthesamplesshowedcalciumnodulesthathavebeenstainedred.Scalebar: 100μm

3結論

在0.1%濃度下，n=3,4,5的APP-n-Na對MG63細胞的ALP和OCP表達和對照樣(空白培養基)相比無顯著差異，所有樣品(n=2～6)對MG63細胞礦化無不良影響。將APP-n-Na接枝到HA表面所得到的Cn-HA對MG63細胞的功能(ALP表達和礦化)無不良影響，預示APP-n-Na及其改性HA在骨修復材料中的使用是安全的。

參考文獻：

[1]GeesinkRGT,HoefnagelsNHM.Six-yearresultsofhydroxyapatite-coatedtotalhipreplacement[J].JBoneJointSurg(Br), 1995, 77(4): 534-547.

[2]QiuHJ,YangJ,KodaliP,etal.Acitricacid-basedhydroxyapatitecompositefororthopedicimplants[J].Biomaterials, 2006, 27: 5845-5854.

[3]RathboneCR,GudaT,SingletonBM,etal.Effectofcell-seededhydroxyapatitescaffoldsonrabbitradiusboneregeneration[J].JBiomedMaterResPartA, 2014, 102: 1458-1466.

[4]GaraiS,SinhaA.Threedimensionalbiphasiccalciumphosphatenanocompositesforloadbearingbioactivebonegrafts[J].MaterSciEngC, 2016, 59: 375-383.

[5]GaraiS,SinhaA.Biomimeticnanocompositesofcarboxymethylcellulose-hydroxyapatite:novelthreedimensionalloadbearingbonegrafts[J].ColloidsSurfB:Biointerfaces, 2014, 115: 182-190.

[6]NiuYF,CaoLH,WeiJ,etal.Developmentofabioactivecompositeofnanofluorapatiteandpoly(butylenesuccinate)forbonetissueregeneration[J].JMaterChemB, 2014, 2:1174-1181.

[7]LuoJB,QiuSX,WangYL,etal.Preparationandphysicochemicalpropertiesofhydroxyapatite/polyurethanenanocomposites[J].ChinJPolymSci, 2014, 32(4): 467-475.

[8]BasileMA,d’AyalaGG,MalinconicoM,etal.FunctionalizedPCL/HAnanocompositesasmicroporousmembranesforboneregeneration[J].MaterSciEngC, 2015, 48: 457-468.

[10]ShokrollahiP,MehmanchiM,AtaiM,etal.EffectofinterfaceonmechanicalpropertiesandbiodegradationofPCLHApsupramolecularnano-composites[J].JMaterSciMaterMed, 2014, 25: 23-35.

[11]TanakaH,YasukawaA,KandoriK,etal.Surfacemodificationofcalciumhydroxyapatitewithhexylanddecylphosphates[J].ColloidSurfA1997, 125: 53-62.

[12]LiYB,WengWJ.Surfacemodificationofhydroxyapatitebystearicacid:characterizationandinvitrobehaviors[J].JMaterSciMaterMed, 2008, 19: 19-25.

[13]LuoJB,QiuSX,ZhouXY,etal.Insitugraftingpolyethyleneglycolchainsontoamorphouscalciumphosphatenanoparticlestoimprovethestoragestabilityandorganicsolventredispersibility[J].ColloidSurfA, 2014, 444: 81- 88.

[14]HuY,GuXY,YangY,etal.Facilefabricationofpoly(L-lacticacid)-graftedhydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolicacid)scaffoldsbypickeringhighinternalphaseemulsiontemplates[J].ACSApplMaterInterfaces, 2014, 6: 17166-17175.

[15]TangYF,LiuJG,WangZL,etal.Invivodegradationbehaviorofporouscompositescaffoldsofpoly(lactide-co-glycolide)andnano-hydroxyapatitesurfacegraftedwithpoly(L-lactide) [J].ChinJPolymSci, 2014, 32(6), 805-816.

[16]PengWH,ZhengW,ShiK,etal.AninvivoevaluationofPLLA/PLLA-gHAnano-compositeforinternalfixationofmandibularbonefractures[J].BiomedMater, 2015, 10: 065007.

[17]KongWB,ZhouXY,YangY,etal.Afacilesynthesisofω-aminoalkylammoniumhydrogenphosphates[J].ChinChemLett, 2012, 23: 923-926.

[18]JiangYR,SunFH,ZhouXY,etal.Waterdispersiblehydroxyapatitenanoparticlesfunctionalizedbyafamilyofaminoalkylphosphates[J].ChinChemLett, 2015, 26: 1121-1128.

[19]SunFH,LongYZ,ZhouXY,etal.Aciddissociationconstantsandcytotoxicitytestofaseriesofomega-aminoalkylphosphates[J].ChinChemLett, 2016,accepted.

[20]MotskinM,WrightDM,MullerK,etal.Hydroxyapatitenanoandmicroparticles:correlationofparticlepropertieswithcytotoxicityandbiostability[J].Biomaterials, 2009, 30: 3307-3317.

[21]PautkeC,SchiekerM,TischerT,etal.CharacterizationofosteosarcomacelllinesMG-63,Saos-2andU-2OSincomparisontohumanosteoblasts[J].AnticancerRes, 2004, 24: 3743-3748.

[22]ColemanJE.Structureandmechanismofalkalinephosphatase[J].AnnuRevBiophysBiomolStruct, 1992, 21: 441-483.

[23]LianJB,SteinGS.Developmentoftheosteoblastphenotype:molecularmechanismsmediatingosteoblastgrowthanddifferentiation[J].LowaOrthopJ, 1995, 15: 118-140.

TheeffectsofaminoalkylphosphatesandtheirmodifiedhydroxyapatitesonMG63cellfunctions

LIUShuai,SUNFuhua,JIANGYirou,XIEXingyi

(CollegeofPolymerScienceandEngineering，SichuanUniversity，Chengdu610065，China)

Abstract:Omega-aminoalkylsodiumhydrogenphosphates(AAP-n-Na, n=2-6,representingthecarbonnumberinthealkylgroup)canbeusedtopreparehydroxyapatite(HA)hydrocolloids,whicharenewsurfacemodifiersforHAandhavenocytotoxicityasconfirmedpreviously.Inthisstudy,theeffectsofAAP-n-NaandtheirmodifiedHAs(Cn-HA, n=2-6)onthefunctionsofhumanosteoblast-likeMG63cellswerefurtherinvestigated.Theresultsshowedthatthealkalinephosphatase(ALP)andosteocalcin(OCN)expressionsincellstreatedwith0.1% (w/v)APP-n-Na(n=3, 4or5)intheculturemediawerecomparabletotheexpressionsintheblankmedium(DMEMsupplementedwith10%fetalbovineserum)asanegativecontrol;andallAAP-n-Na’s(n=2-6)didnotinhibitthecalciumnoduleformation.TheextractsfromcorrespondingCn-HAs(preparedat0.1g/mLinthecellculturemedium)didnotsignificantlyaltertheALPexpressionandcalciumnoduleformationinMG63cellsaswell,incomparisonwiththebareHAextractandtheblankmedium.TheseresultsimplythatAAP-n-Na’sandtheirmodifiedHAsaresafewhenusedinbonegraftingmaterials.

Keywords:Aminoalkylphosphates;hydroxyapatite;osteoblast;alkalinephosphatase;osteocalcin;calciumnodule

文章編號：1001-9731(2016)06-06108-05

* 基金項目：國家自然科學基金資助項目(50973069)

作者簡介：劉帥(1989-)，男，四川雅安人，在讀碩士，師承謝興益教授，從事生物材料研究。

中圖分類號：R318；TQ132.3

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.019

收到初稿日期：2016-03-21 收到修改稿日期：2016-05-13 通訊作者：謝興益，E-mail:xiexingyi@263.net