Foxp3基因多態性與廣東地區產后抑郁相關性的初步探討*

馮桂玲，潘昆貽，鄧小燕△

(1.廣州醫科大學附屬第二醫院檢驗科　510260；2.中山大學孫逸仙紀念醫院，廣東中山 510235)

·論著·

Foxp3基因多態性與廣東地區產后抑郁相關性的初步探討*

馮桂玲1，潘昆貽2，鄧小燕1△

(1.廣州醫科大學附屬第二醫院檢驗科510260；2.中山大學孫逸仙紀念醫院，廣東中山 510235)

目的探討中國廣東地區女性叉頭狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)-6054(deletion/ATT，rs5902434)、Foxp3-3279(A/C,rs376158)、Foxp3-924(A/G,rs2232365)與產后抑郁癥(PPD)發病的相關性。方法用聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)分析法對69例PPD確診患者(PPD組)和140例健康產后女性(對照組)的外周血提取DNA樣本，進行Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924點突變分析，比較兩群體該基因多態性的差異。結果Foxp3基因Foxp3-6054位點在PPD組AA基因型頻率和對照組間差異有統計學意義(P<0.05)，Foxp3-6054位點等位基因頻率、Foxp3-3279、Foxp3-924位點單核苷酸多態性基因型頻率和等位基因頻率在PPD組和對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論中國廣東地區Foxp3-6054與PPD的發病具有一定的相關性，中國廣東地區Foxp3-3279、Foxp3-924與PPD的發病未發現相關性。

叉頭狀螺旋轉錄因子3；單核苷酸多態性；產后抑郁

產后抑郁癥(PPD)被世界衛生組織(WHO)和美國精神病協會定義為產后4～6周內第一次發病(既往無精神障礙史)，癥狀類似普通抑郁，嚴重影響產婦身心健康的產褥期精神綜合征。近年來，有關PPD和免疫系統的相互作用逐步受到重視，抑郁癥一方面可引起各種軀體疾病相關的免疫改變；另一方面，免疫炎癥也是抑郁癥的發病機制之一[1]。許多研究表明調節性T細胞(Treg)在抑郁癥的發生、發展中起重要作用，而叉頭狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)可特異表達于CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+Treg)亞群上，是其獲得免疫調節特性的關鍵轉錄因子，該基因的正常表達是CD4+CD25+Treg發揮作用的前提[2-3]。關于PPD與Foxp3基因多態性的相關研究少有報道。因此，本課題組試圖探討Foxp3基因的突變是否與 PPD的發生有關，通過查閱文獻，可發現Foxp3-6054(deletion/ATT，rs5902434)、Foxp3-3279(A/C,rs376158)和Foxp3-924(A/G,rs2232365)這3個基因單核苷酸多態性位點的突變與銀屑病等疾病的發生相關[4]。因此，本研究選取Foxp3上述3個基因單核苷酸多態性位點來研究其與 PPD的相關性，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料隨機選擇2013年6月至2014年9月在廣東省越秀區詩書街社區醫療中心的產后回訪產婦進行愛丁堡 PPD癥評估量表(EPDS)調查。并根據EPDS診斷標準，大于或等于10分提示存在不同程度的抑郁癥狀，則視為篩查陽性，共篩選出35例PPD患者，總分越高，抑郁程度越高[5]，另34例來自廣州市腦科醫院確診為PPD患者，共69例PPD患者納入PPD組。對照組為140例足月產婦，平均年齡(29.4±4.6)歲，均為廣東籍貫漢族人，既往無精神障礙史，無原發性高血壓、心血管疾病、肝腎疾病、糖尿病等病史。產婦分別采集所有研究對象清晨空腹靜脈采血2～3 mL，以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，保存于4 ℃冰箱中備用，用于基因組DNA抽提。

1.2儀器與試劑Taq DNA聚合酶、飽和酚、LadderⅠ、0.5 g/mL 溴化乙啶(EB)為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品，引物由生工生物(上海)有限公司合成[6]。儀器為PC480熱循環PCR分析儀和數字凝膠成像分析儀。Foxp3基因特異性引物序列為如下。Foxp3-6054，F1：5′-ACC TTT AAG TCT TCT GCC ATT TAT TCT ATT ATT T-3′;F2：5′-CCT TTA AGT CTT CTG CCA TTT ATT CTA TTA TTA-3′;R：5′-TGA TTA TCA GCG CAC ACA CTC AT-3′。Foxp3-3279,F1：5′-CTG GCT CTC TCC CCA ACT GA-3′；F2：5′-TGG CTC TCT CCC CAA CTG C-3′;R：5′-ACA GAG CCC ATC ATC AGA CTC TCT A-3′。Foxp3-924，F1：5′-CCC AGC TCA AGA GAC CCC A-3′；R1：5′-GGG CTA GTG AGG AGG CTA TTG TAA C-3′；F2：5′-CCA GCT CAA GAG ACC CCG-3′；R2：5′-GCT ATT GTA ACA GTC CTG GCA AGT G-3′。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的抽提按照Gentra公司的苯酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，置于-20 ℃保存備用。

1.3.2Foxp3基因三位點多態性檢測根據設計的Foxp3基因特異性引物，用聚合酶鏈反應-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測3個等位基因。PCR反應體系為：DNA 2.5 μL,加入10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，20 μmol/L 的上下游引物各1.0 μL，5×106μ/L Taq DNA聚合酶1.0 μL，滅菌雙蒸水將反應體系補足至25 μL。TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice型PCR儀進行擴增。擴增條件為：Foxp3-6054，預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s；共35個循環，最后延伸7 min。Foxp3-3279/Foxp3-924，預變性96 ℃ 5 min；變性96 ℃ 20 s,退火70 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 25 s，5個循環；變性96 ℃ 25 s，退火65 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 50 s，25個循環；變性96 ℃ 30 s，退火55 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 90 s，5個循環；最后延伸5 min。PCR 產物行2.0%的瓊脂糖凝膠(含 0.5 g/mL EB，100∶5)，取 9 μL擴增產物與1 μL溴酚藍緩沖液混勻后加樣于 0.5×TBE 緩沖液中，180伏電泳約22 min，在紫外凝膠分析系統中觀察擴增條帶并照相。

1.4統計學處理采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計分析。用基因計數法計算基因型和等位基因頻率，等位基因頻率=(2×純合子數+雜合子數)/(2×受檢人數)，用Hardy-Weinberg檢測樣本是否符合孟德爾遺傳規律；基因型和等位基因頻率差異比較分別采用χ2檢測，以P<0.05為差異有統計學意義(雙側檢驗)。

2結果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗在Hardy-Weinberg遺傳平衡定律中，如P<0.05，則樣本人群該基因頻率不符合遺傳平衡法則；如P>0.05，則樣本人群該基因頻率符合遺傳平衡法則，具有恒定性。首先對 PPD組及對照組 Foxp3基因型分布進行檢驗，統計PPD組和對照組不同位點基因型并用Hardy-Weinberg平衡原理估測樣本的群體代表性，本組研究對象檢驗結果為:SNP-6054χ2=1.58；SNP-3279χ2=1.21；SNP-924χ2=2.57,顯示PPD組基因型分布差異無統計學意義(P>0.05)，說明研究對象所在人群實際基因頻率和期望基因頻率的差異不明顯，其分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳遺傳平衡，具有群體代表性。

表1　Foxp3基因3個SNP位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2Foxp3基因多態性檢測結果

2.2.1Foxp3-6054位點多態性檢測TT基因型只可見T組引物擴增PCR產物條帶，為del/del純合子；AA(ATT/ATT)基因型只可見A 組引物擴增PCR產物條帶，為ATT/ATT純合子；TA基因型可見T組A組兩組引物擴增 PCR 產物條帶，為del/ATT雜合子。見圖1-A。

2.2.2Foxp3-3279位點多態性檢測CC基因型只可見C組引物擴增PCR產物條帶，CC為CC純合子；AA基因型只可見A組引物擴增 PCR產物條帶，AA為AA純合子；AC 基因型可見C組 A 組兩組引物擴增PCR產物條帶，AC為AC雜合子。見圖1-B。

2.2.3Foxp3-924位點多態性檢測AA基因型只可見A組引物擴增PCR產物條帶，AA為AA純合子；GG基因型只可見G組引物擴增PCR產物條帶，GG為GG純合子；GA基因型可見G組A組兩組引物擴增 PCR產物條帶，GA為GA雜合子。見圖1-C。

注：M為標準參照物DL600 bp。

圖1Foxp3-6054、Foxp3-3279和Foxp3-924位點

基因型PCR-SSP分析電泳

2.3重復性實驗隨機選取10%的樣本進行重復性實驗，結果與之前實驗結果符合率為100%。

2.4基因型及等位基因分布頻率

2.4.1Foxp3-6054位點多態性基因型及等位基因分布頻率Foxp3-6054位點ATT插入型等位基因頻率在 PPD組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。TT、TA和AA 3種基因型頻率在PPD患者中分別占39.1%、50.7%和10.1%；在對照組中分別占34.3%、64.3%和1.4%。兩組間TT基因型和TA基因型頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)，而AA基因型頻率明顯高于對照組(P<0.05)。兩組間T等位基因和A等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　Foxp3-6054位點多態性基因型及等位基因在

2.4.2Foxp3-3279位點多態性基因型及等位基因分布頻率Foxp3-3279位點A等位基因頻率在 PPD組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。AA、AC和CC 3種基因型頻率在 PPD患者中分別為8.7%、23.2%和68.1%；在對照組中分別為5.0%、36.4%和58.6%。3種基因型頻率在 PPD組和對照組的分布差異無統計學意義(P>0.05)。兩組間等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　Foxp3-3279位點多態性基因型及等位基因在

2.4.3Foxp3-924位點多態性基因型及等位基因分布頻率Foxp3-924位點G等位基因頻率在 PPD患者和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。AA、AG和GG 3種基因型頻率在 PPD患者中分別占39.1%、39.1%和21.7%；在健康對照中分別占36.4%、45.0%和18.6%。3種基因型頻率在 PPD患者和對照組的分布差異無統計學意義(P>0.05)。兩組間等位基因頻率，差異無統計學意義(P>0.05)。

表3　Foxp3-924位點多態性基因型及等位基因在人群中

3討論

PPD屬于神經癥性抑郁癥，目前對抑郁發病機制的研究證實，抑郁癥并不是由單一的神經遞質失衡引起，而是受多因素影響。研究顯示抑郁癥患者體內炎癥前細胞因子、急性期反應蛋白、化學增活素及細胞黏附分子等水平明顯升高，影響抑郁癥的特征性改變，如神經遞質代謝、神經內分泌的改變和突出可塑性改變等，證實炎性反應在抑郁癥的發生、發展中起重要作用。近幾年，許多臨床和動物實驗研究表明大部分抑郁癥的患者存在免疫系統激活的表現，如在給予細胞因子治療的非抑郁癥患者可以出現抑郁行為，一些患有免疫功能異常的自身免疫性疾病患者易出現抑郁行為，某些細胞因子可以激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPA軸)，可以使中樞腎上腺系統功能亢進，或者導致血清素系統的活化，引起抑郁癥的相關血液生化改變[1]。由此可見，免疫調節的失衡是PPD的發病機制之一。

人類Foxp3基因定位于XP11.23，含有11個外顯子和10個內含子，其cDNA全長1 869 bp，表達于CD4+CD25+Treg，目前大多數學者認為Foxp3可作為CD4+CD25+Treg特異性標志物，而Treg是T細胞的一個亞群，對免疫反應具有抑制效應[6]。目前在其他免疫紊亂的疾病中，有關Treg的研究很多，而對于存在免疫失衡的抑郁癥Treg的作用研究較少。鑒于Treg廣泛的免疫調節作用，同時考慮到抑郁癥患者體內存在明顯的免疫功能紊亂，尤其是免疫激活，筆者推測在抑郁癥中很可能存在Treg的功能紊亂，其功能的恢復及免疫穩態的維持可能有利于抑郁癥的治療。

本研究中使用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，發現Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924三位點基因具有群體代表性，證實抽樣與分型結果可靠。以PCR-SSP法對所選擇的全部樣本進行Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924三位點基因多態性與中國廣東地區 PPD相關性分析。通過分析發現Foxp3-6054單核苷酸基因多態性與中國廣東地區PPD發病相關。攜帶Foxp3-6054 位點基因型AA基因型頻率明顯升高(P<0.05)，提示Foxp3-6054A/A位點可能是中國廣東地區漢族人群 PPD發生的危險因子。而另外兩個突變基因位點Foxp3-3279和Foxp3-924的研究發現其單核苷酸基因多態性與中國廣東地區 PPD發病之間無顯著相關(P>0.05)，因而推斷Foxp3-3279和Foxp3-924位點可能不是 PPD發病的獨立危險因素，與中國廣東地區 PPD的發病未發現相關性。

基于基因型決定表型的理論，本文未對 PPD的嚴重程度進行分級，為科學驗證Foxp3基因是否為廣東地區 PPD的易感基因，建議增加樣本量，擴大樣本收集范圍，檢測該基因的多態性位點，進一步證實Foxp3基因型可能直接或間接改變細胞內Foxp3的表達水平導致或加重 PPD疾病的嚴重程度，檢測CD4+CD25+Treg的表達數量，監測相關激素水平和激素受體基因多態性的變化，同時關注基因多態性與疾病臨床表型多樣性的內在聯系。

[1]楊樂.抑郁癥免疫失衡機制中多巴胺受體D3與調節性T細胞的關聯作用[D].湖南：中南大學，2007.

[2]李藝,楊歡,肖波，等.5-羥色胺受體與調節性T細胞在抑郁癥免疫功能紊亂中的關聯作用[J].中華行為醫學與腦科學雜志，2009,18(4)：308-310.

[3]劉冰,李曉瑜,萬禮霞.FOXP3基因在人類變應性鼻炎中的表達[J].實用醫學雜志,2010,39(22):4065-4067.

[4]湯月芬,王立偉,施慎遜.產后抑郁癥生物學病因及評估的研究進展[J].中華精神科雜志,2005,38(2):126-128.

[5]高琳.Foxp3_Fas_FasL_COMT基因多態性與漢族尋常型銀屑病相關性分析[D].西安：第四軍醫大學，2008.

[6]Gao L，Li K，Li F，et al．Polymorphisms in the FOXP3 gene in HAN chinese psoriasis patients[J]．J Dermatol SCI，2010，57(1):51-56．

Explore the association between the polymorphism of Foxp3 gene and postpartum depression in Guangdong Province*

FENGGuilin1，PANKunyi2，DENGXiaoyan1△

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510260,China;2.SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong510235,China)

ObjectiveTo investigate the association of Fork shaped spiral gene transcription factor 3(Foxp3)-6054(deletion/ATT，rs5902434),Foxp3-3279(A/C,rs376158),Foxp3-924(A/G,rs2232365)with the morbidity of postpartum depression among the populations in Guangdong province.MethodsThe peripheral blood DNA samples were identified by means of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP)analysis among 69 cases which were confirmed to be postpartum depression and 140 cases of healthy control of postpartum women,and then we analyzed the point mutation of Foxp3-6054,Foxp3-3279,Foxp3-924 as well as compare the differences between the two groups in gene polymorphisms.ResultsThe SNP gene frequency and genotype frequency of Foxp3-6054 was statistical significant among the group of postpartum depression and the control group(P<0.05),and the SNP gene frequency and genotype frequency of Foxp3-3279,Foxp3-924 was not statistical significant among the group of postpartum depression and the control group(P>0.05).ConclusionFrom the current investigation cases,the Foxp3-6054 could be proved to associated with the morbidity of postpartum depression among the populations in Guangdong province,and the Foxp3 gene Foxp3-3279,Foxp3-924 could not be proved to associated with the morbidity of postpartum depression among the population in Guangdong province.

forkhead helix transcription factor 3;single nucleotide polymorphism;postpartum depression

2016-01-10修回日期：2016-03-18)

廣東省廣州市屬高校學科平臺建設臨床檢驗診斷學項目(穗教科2011-34)。

馮桂玲，女，主管技師，主要從事醫學檢驗研究。△

， E-mail:dxyzgy@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.003

A

1673-4130(2016)12-1598-04