靈芝多糖對番茄抗灰霉病的誘導效應

寧玉波，王紅艷，喬　康，劉秀梅，王開運

（1山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018；2山東省農業科學院棉花研究中心，濟南 250100）

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靈芝多糖對番茄抗灰霉病的誘導效應

寧玉波1，王紅艷2，喬康1，劉秀梅1，王開運1

（1山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018；2山東省農業科學院棉花研究中心，濟南 250100）

摘要：【目的】誘導抗病劑可以誘導寄主植株產生系統抗病性，具有持效性和廣譜性的特點。論文以番茄植株為模式植物，番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）為目標菌，進行溫室盆栽試驗，以期明確靈芝多糖誘導劑對番茄灰霉病的誘導抗性。【方法】用一定質量濃度的靈芝多糖溶液（50、100、200和400 mg·L-1）噴霧處理盆栽番茄植株第1、2片真葉（正反面），每2 d噴施1次，共誘導3次，最后一次誘導2 d后全株噴霧接種供試菌孢子懸浮液（（1—2）×106個孢子/mL），對照組施用等量清水代替靈芝多糖溶液，與各處理平行噴霧接種番茄灰霉菌孢子懸浮液。在接種孢子懸浮液之前用注射器將番茄苗莖基部刺傷，注意傷口不能太大。然后再罩上塑料薄膜保濕24 h，接種孢子懸浮液2 d內植株遮陰處理，并用加濕器提高溫室內的相對濕度，相對濕度控制在不低于90％，溫度控制在（15±5）℃，接種后第 3 天正常光照。通過調查植株病情指數，計算相對防治效果以評價靈芝多糖對番茄抗灰霉病的誘導效果，并且從防御酶活性、丙二醛（MDA）和葉綠素含量的變化角度評價其誘導抗性的作用機制。同時用一定質量濃度的靈芝多糖溶液（50、100、200和400 mg·L-1）處理番茄種子并育苗，20 d后測定番茄幼苗株高、鮮重等多項生長指標。【結果】與直接施用等量清水后挑戰接菌的對照組病情指數49.25相比，靈芝多糖處理組的番茄植株病情指數明顯下降，在 32.96—43.85。其中經400 mg·L-1靈芝多糖處理的番茄植株病情指數最低為32.96，相對防效達到33.07％。經靈芝多糖處理的番茄植株，其體內與抗病有關的防御酶活性也發生顯著變化，過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）的活性在多糖誘導第3天達到最高，分別達到162和98 U·min-1·g-1FW，是對照組的2.13和1.71倍；過氧化物酶（POD）的活性在誘導后第4天達到最高值434 U·min-1·g-1FW，是對照處理組的3.29倍。靈芝多糖能夠系統地誘導番茄體內 CAT、POD 及 PPO 活性，顯著抑制了感染灰霉菌后番茄植株葉片葉綠素含量的下降。靈芝多糖處理組的MDA含量與對照組相比有所下降，對照處理組在取樣期間內MDA含量持續上升，而靈芝多糖處理組在取樣期間內MDA含量呈先上升后趨于平穩的變化趨勢。各質量濃度靈芝多糖對番茄種子的發芽率、芽長和幼苗株高、植株的鮮重均有不同程度的促進作用。其中200 mg·L-1靈芝多糖浸泡的番茄種子發芽率最高，達87.3％，比對照組的發芽率77.3％提高了10.0％；且該處理對番茄幼苗的株高和地上部分鮮重的促進作用也最大，分別較對照增加了12.9％和33.3％；經100 mg·L-1靈芝多糖處理后番茄幼苗的芽長和地下部分鮮重變化最大，與對照組相比分別提高了0.16 cm和 0.33 g。【結論】靈芝多糖能夠誘導番茄植株對灰霉病產生系統抗病性，同時對番茄種子發芽和番茄植株幼苗生長具有一定的促進作用。

關鍵詞：靈芝多糖；番茄；灰霉病；誘導抗性；防御酶

聯系方式：寧玉波，E-mail：nyb408908401@163.com。王紅艷，E-mail：78931220@qq.com。寧玉波和王紅艷為同等貢獻作者。通信作者王開運，E-mail：kywang@sdau.edu.cn

0 引言

【研究意義】番茄灰霉病（致病菌為灰葡萄孢Botrytis cinerea）是中國番茄上發生的重要病害，每年都因該病的發生造成番茄大量減產，甚至絕產［1-2］。該病發病時間早，持續時間長，現已成為制約番茄生產的主要障礙。目前生產上防治番茄灰霉病以多菌靈、嘧霉胺和腐霉利等化學藥劑為主，但是化學防治會帶來農藥使用量不斷增大、花費成本高、環境污染嚴重等問題［3］。生物農藥因其具有高效、無公害的特點，符合現代農業可持續發展的方向，所以倍受關注，已成為當前農藥研究的熱點。植物誘導劑作為生物農藥的一種，具有持效性和廣譜性的特點，可以誘導寄主植物獲得系統抗病性，成為解決農業可持續發展的有效途徑。【前人研究進展】生物多糖誘導子由于具有綠色無污染和廣譜高效的特點被稱為新型生物農藥。靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，含有多種生物活性成分，其中靈芝多糖是靈芝的關鍵藥效成分［4-5］，靈芝多糖主要構型特征為β-（1→3）-D-線性連接的骨架結構［6-7］，與許多已經報道的真菌多糖結構相一致，同屬于β-（1→3）-葡聚糖類［8］。研究表明海帶多糖、殼寡糖、香菇多糖等多種功能糖能夠通過刺激植株體內產生防御反應，增強植物對病害的抵抗能力，從而誘導植株對植物真菌和病毒病害產生抗性［9-11］，王文霞等［12］將這類具有調節植物免疫功能的糖類定義為糖鏈植物疫苗。近年來，國內外學者對于靈芝多糖的研究主要致力于醫學方面的功效［13-14］，白丹等［15］采用紙片瓊脂法測定了100 mg·mL-1靈芝多糖對供試菌的抑菌強度，結果表明靈芝多糖對細菌的抑菌活性強于真菌，同時指出靈芝多糖不能抑制灰葡萄孢的生長。【本研究切入點】關于靈芝多糖作為誘導子在植物抗病害上的應用目前尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】以溫室盆栽的番茄植株為研究對象，用靈芝多糖作為誘導子，探討靈芝多糖對番茄抗灰霉病的誘導效果及其誘導抗性的作用機制，為靈芝多糖作為誘導劑的開發和在植物病害防治上的有效應用提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于 2014—2015年在山東農業大學植物保護學院完成。

1.1 供試材料

番茄（Solanum lycopersicum）品種為東風4號，購自山東省泰安市房村鎮豐源種苗有限公司。

1.2 試驗方法

供試培養基：PDA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，分裝，滅菌）。PD培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，分裝，滅菌）。

供試菌種：從山東農業大學植物保護學院日光溫室內的盆栽番茄植株上采集發病比較典型的番茄灰霉病葉，用無菌水沖洗葉片，剪取葉片發病部位浸于80％無水乙醇中1 min消毒處理，將消毒后的葉片貼放于無菌PDA培養基上培養，置于25℃恒溫培養箱內培養，7 d后挑取菌落邊緣的菌絲接于新的平板上繼續培養。

孢子懸浮液的配置：打取直徑7 mm上述供試菌餅，置于盛有100 mL PD培養基的三角瓶中，放于搖床中振蕩培養10 d后，病原菌培養物用無菌水兩層紗布過濾，將濾液經10 000 r/min離心10 min，去沉淀加適量蒸餾水稀釋，在顯微鏡下用血球計數板統計濾液孢子數，最終配成孢子懸浮液濃度為（1—2）×106個孢子/mL，用于接種。

1.2.1 靈芝多糖的制備 以靈芝子實體粉末為原料，以水為溶劑，采用水提醇沉法提取靈芝多糖。稱取粉碎后干燥靈芝子實體粉末100 g，加入15倍體積蒸餾水加熱回流2 h，殘渣加蒸餾水回流提取2次，合并上清液，過濾，真空濃縮至200 mL。采用Sevage法除去蛋白，濃縮液置于分液漏斗中，每100 mL濃縮液加20 mL氯仿正丁醇液（v∶v= 4∶1 ），振蕩30 min后靜止放置12 h，去除水相與溶劑相中間的白色膠狀物，溶液離心15 min（12 000 r/min），去除雜質。向溶液中加入4倍體積無水乙醇，靜置24 h后收集白色絮狀物，用丙酮洗滌2次，所得白色絮狀物在冷凍干燥箱中冷凍干燥即得粉末狀粗多糖。采用苯酚-硫酸法測定靈芝多糖的含量。

（1）葡萄糖標準曲線的制備 準確量取0.1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL試管中，加蒸餾水定容至1 mL，向每個試管中加入1 mL 現配的濃度為6％苯酚溶液，迅速加入5 mL濃硫酸溶液，搖勻，將所得溶液沸水浴顯色15 min，冷水冷卻至室溫，于490 nm處檢測吸光度值（OD）。以吸光度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，繪制標準曲線，得出葡萄糖標準曲線方程。

（2）樣品含量測定 稱取靈芝多糖樣品10 mg，定容至100 mL容量瓶中，吸取上述溶液1.0 mL，按上述步驟操作，在490 nm處測吸光度，以標準曲線計算多糖含量。

1.2.2 靈芝多糖對番茄抗灰霉病誘導作用的測定 番茄幼苗4葉期時，選取生長狀態一致的番茄幼苗，將一系列質量濃度（50、100、200和400 mg·L-1）的靈芝多糖溶液（含0.03％的Tween-80）用噴霧法處理番茄第1、2片真葉（正反面），罩上塑料薄膜，每2 d噴施一次，共噴施3次。最后一次噴施2 d后全株噴霧接種供試菌孢子懸浮液（（1—2）×106個孢子/mL），在接種孢子懸浮液之前用注射器將番茄苗莖基部刺傷，注意傷口不能太大。然后再罩上塑料薄膜保濕24 h，接種后2 d內植株遮陰處理，并用加濕器提高溫室內的相對濕度，相對濕度控制在不低于90％，溫度為（10±5）℃，第3天正常光照。接種后15 d調查番茄植株發病情況，計算病情指數和相對防效。對照組以蒸餾水代替靈芝多糖處理植株后接種孢子懸浮液，各個處理組均設3組重復，每組重復10株植株。番茄灰霉病發病程度分級標準參照陸家云等［16］的標準。0級：無病斑，葉片無癥狀，植株健康；1級：病斑面積占總葉片的10％以下，葉脈間黃化；2級：病斑面積占總葉片的10％—50％，葉脈變黃且萎蔫；3級：病斑面積占總葉片的50％以上，整個植株萎蔫；4級：植株死亡。

1.2.3 靈芝多糖浸種下番茄種子和幼苗生長活性的測定 選取籽粒飽滿一致的番茄種子分別在50、100、200和400 mg·L-1靈芝多糖溶液中浸泡8 h后置于鋪有3層濾紙的培養皿（內徑9.0 cm）中，每個處理50粒種子，3次重復，加5 mL蒸餾水，對照組用等量蒸餾水處理，定時補充定量的蒸餾水保持濾紙濕潤，在（25±1）℃恒溫箱內催芽7 d后記錄不同處理組番茄種子的發芽率和芽長。將不同處理組的番茄種子播種到育苗盤中育苗，當2片子葉完全展開后挑選生長一致的番茄幼苗移栽到塑料花盆中（育苗基質∶土壤=1∶1）。每個處理設置3次重復，每個重復10株番茄幼苗。番茄幼苗生長20 d后記錄番茄幼苗的株高和鮮重等生長參數。

1.2.4 靈芝多糖對番茄相關防御酶活性影響的測定參照1.2.2的方法，選取誘導效果最佳濃度的靈芝多糖處理番茄植株以及2 d后接種供試菌種孢子懸浮液。對靈芝多糖誘導番茄抗灰霉病的生理機制進行研究，試驗設計如下4個處理：清水（CK）；不經靈芝多糖處理接種番茄灰霉菌（CK-接種）；經靈芝多糖處理但不接種番茄灰霉菌（GLP）；經靈芝多糖處理并接種番茄灰霉菌（GLP-接種）。粗酶液的制備參照劉太國等［17］略有改動。于植株接種番茄灰霉菌后1—7 d，分別取番茄植株第3—4片展開葉（未經誘導處理）用于測定過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）的活性。

（1）CAT活性的測定 參照鄒琦［18］的方法。測定240 nm下的吸光度，以1 min內OD值變化0.01為1個酶活單位（U·min-1·g-1FW）。

（2）PPO活性的測定 參考鄰苯二酚法［19］。PPO以每克葉片鮮質量每分鐘OD值變化0.01為1個酶活單位（U·min-1·g-1FW）。

（3）POD活性的測定 參考愈創木酚法［20］。POD以每克葉片鮮質量每分鐘OD值變化0.01為1個酶活單位（U·min-1·g-1FW）。

1.2.5 靈芝多糖對番茄丙二醛含量影響的測定 參照李合生［21］的方法采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛的含量（μmol·g-1）。

1.2.6 靈芝多糖對番茄葉片葉綠素含量影響的測定葉綠素含量測定參考彭運生等［22］的方法，接種番茄灰霉菌后第15天取樣測定葉綠素含量，包括葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量。具體過程為取不同處理番茄植株同一部位葉片0.1 g（未經多糖誘導），液氮研磨后置于盛有9 mL丙酮和無水乙醇配置的混合浸提液（v∶v=2∶1）中，置于暗處觀察葉片完全變白為準，以混合浸提液作為空白調零，測定663、645 nm處吸光度值。

1.3 數據處理

采用 Excel 2003和 SPSS16.0軟件 One-Way ANOVA中LSD法對數據進行處理和分析。

2 結果

2.1 靈芝多糖含量的測定

葡萄糖標準曲線如圖 1所示，線性回歸方程為y=0.0088x+0.2929，線性方程相關系數為0.9933，線性關系良好。根據待測靈芝多糖溶液的吸光度0.52，計算靈芝多糖的有效含量為25.8％。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig. 1 Standard curve of glucose

2.2 靈芝多糖對番茄抗灰霉病的誘導作用

在50—400 mg·L-1靈芝多糖處理后，番茄感染灰霉病的程度有所降低，病情指數均較對照有所下降，但在較低濃度靈芝多糖范圍內病情指數與對照組間差異不顯著。其中400 mg·L-1靈芝多糖病情指數最小為32.96，相對防效達到33.07％，誘導效果最佳（表1）。

2.3 靈芝多糖浸種對番茄種子發芽和幼苗生長的影響

50—400 mg·L-1靈芝多糖對番茄種子發芽率、芽長、幼苗株高、植株質量均表現出一定的促進作用。其中 200 mg·L-1靈芝多糖浸泡的番茄種子發芽率最高，達87.3％，比對照的發芽率77.3％提高了10.0％；且該處理對番茄幼苗的株高和地上部分鮮重的促進作用也最大，分別較對照增加了12.9％和33.3％；經100 mg·L-1靈芝多糖處理后番茄幼苗的芽長和地下部分鮮重變化最大，分別比對照組提高了0.16 cm和0.33 g。但是經不同濃度多糖處理后的番茄種子芽長和地下部分鮮重之間差異性不顯著（表2）。

2.4 靈芝多糖對番茄抗灰霉病誘導機制

2.4.1 靈芝多糖處理對番茄幼苗葉片保護酶活性的影響 由圖2-A可知，在整個取樣過程中，CK組的CAT活性變化平穩，變化范圍在 60—85 U·min-1·g-1FW；在取樣第2天，GLP處理組CAT活性達到最大（122 U·min-1·g-1FW），是CK組的1.69倍；在取樣第3天，GLP-接種處理組CAT活性達到峰值（162 U·min-1·g-1FW），是CK組的2.13倍；之后緩慢下降，在取樣的7 d內，GLP和GLP接種處理組CAT活性均明顯高于CK組。表明GLP具有誘導CAT活性升高的作用，GLP-接種處理的誘導效果明顯高于GLP單獨處理。CK接種處理組CAT活性在前4 d比CK組增加，且在接種第2天達到峰值，是CK組的1.29倍，之后逐漸降低。可見接種病原菌可以短時間內刺激番茄植株體內CAT活性的表達，但是持續時間較短。

表1　不同濃度靈芝多糖的誘導效果Table 1 The induced resistance with different concentrations of GLP

由圖2-B可知，在整個取樣過程中，CK組的POD活性呈緩慢上升的趨勢；在取樣第4天，GLP-接種處理組POD活達到最大（434 U·min-1·g-1FW），是CK組的3.29倍。GLP處理組在整個處理過程中呈持續上升的趨勢，但明顯低于GLP-接種處理組的POD活性，兩處理組在處理的7 d內，POD活性升高值比CK組高得多。表明GLP具有誘導POD活性升高的作用，GLP-接種處理的誘導效果明顯高于 GLP單獨處理，GLP-接種處理的最佳誘導時間為接種后第 4天；CK接種處理組POD活性變化顯著，在取樣的7 d，POD活性顯著高于CK處理組，可見接種病原菌可以有效刺激番茄植株體內POD活性的表達。

由圖2-C可知，在整個取樣過程中，CK組的PPO活性呈先上升后下降的趨勢，PPO活性變化范圍在40 —60 U·min-1·g-1FW，保持在一個平穩的水平；在取樣第 3天，GLP-接種處理組 PPO活性達到最大（98 U·min-1·g-1FW），是CK組的1. 71倍，之后略有下降，但基本上維持在恒定水平，第7 天時PPO活性為90 U·min-1·g-1FW。GLP處理組在處理第3天時，PPO活性達到最大（80 U·min-1·g-1FW），是CK組的1.37倍，之后PPO活性迅速下降，明顯低于GLP-接種處理組的PPO活性，兩處理組在處理的7 d內，PPO活性均明顯高于CK組。表明GLP具有誘導PPO活性升高的作用，GLP-接種處理的誘導效果明顯高于GLP單獨處理，GLP-接種處理的最佳誘導時間為接種后第3天，經GLP-接種處理的番茄植株PPO活性的持效期明顯比GLP單獨處理的持效期長，在第7天取樣時，PPO仍保持一定的活性；CK接種處理組PPO活性在處理3 d內變化顯著，PPO活性較CK組迅速上升，于第3天達到峰值76 U·min-1·g-1FW，明顯高于CK組PPO活性。之后PPO活性迅速下降，與CK組PPO活性基本一致。可見接種病原菌對番茄植株體內PPO的活性有明顯的刺激作用，但是作用時間短，持續期不長。

2.4.2 靈芝多糖處理對番茄幼苗葉片丙二醛含量的影響 由圖2-D可知，接種處理組中丙二醛的含量較未接種處理組變化顯著，CK-接種處理組在取樣期間內MDA含量持續上升，而GLP-接種處理組在取樣期間內MDA含量呈先上升后趨于平穩的趨勢變化，且CK-接種處理組在取樣期間內MDA含量顯著高于GLP-接種處理組的MDA含量。而未接種處理組CK、GLP處理組MDA含量變化平穩，在取樣前5 d內，GLP處理組MDA含量較CK處理組有明顯下降的趨勢。

圖2　靈芝多糖處理對番茄葉片保護酶活性及丙二醛含量的影響Fig. 2 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after GLP treatment in tomato

2.4.3 靈芝多糖處理對番茄幼苗葉片葉綠素含量的影響 接種番茄灰霉菌處理組的葉片葉綠素含量明顯低于未接種處理組，其中只接種灰霉菌（接種處理組）的葉綠素含量又明顯低于經 GLP處理后又接種灰霉菌的植株（GLP-接種）；未經GLP處理而接種番茄灰霉菌的植株葉片內葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量比經 GLP處理后接種的植株分別下降 26.5％、33.3％和45.6％，而噴施靈芝多糖后接種的番茄植株葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量比健康植株（CK組）處理組分別下降19％、6.6％和1.6％（圖3）。

3 討論

迄今為止，國內外已有許多文獻報道食藥菌多糖具有激活植物機體免疫、誘導植株自身產生抗病性，使植株獲得系統抗病性（systemic acquired resistance，SAR）［23-27］。前期研究發現靈芝多糖與香菇多糖、殼寡糖等激發子具有同一基本骨架β-1，3 glucan結構，而β-1，3 glucan在對煙草花葉病、葡萄灰霉病的防治方面已表現出顯著的誘導抗病活性。本文通過葉面噴霧法噴施不同濃度的靈芝多糖，均可有效誘導番茄對灰霉病的抗病性，400 mg·L-1的靈芝多糖誘導效果最佳，相對防效為33.07％，產生系統抗病性反應。番茄灰霉病是保護地番茄生產的毀滅性病害，在田間生產上已造成大面積的減產，嚴重威脅著番茄產業的發展。本研究通過噴施靈芝多糖能夠對番茄抗灰霉病起到一定的誘導效應，提高了番茄葉片保護酶的活力，而番茄葉片保護酶活力的水平在一定程度上反映了植株的抗病能力。CAT和POD具有清除自由基，延緩植物衰老的功能［28-29］。PPO是植保素、木質素、酚類和醌類等物質的合成過程的關鍵酶，促使細胞壁木質化從而減少病原菌對植物的損傷［30］，已有研究證明PPO活性的變化是植物抗病性的重要生理指標［31］。本試驗中經靈芝多糖誘導后接種番茄灰霉病病原菌的植株體內CAT、POD和PPO活性均較對照組有所提高，相應增強了番茄植株防御灰霉病侵染的能力，在靈芝多糖誘導7 d內，番茄植株體內CAT、POD和PPO保持較高的活性，說明靈芝多糖的誘導作用不僅能夠阻止番茄灰霉病菌對植株的侵染，同時還具有一定的持效性，這在一定程度上降低了灰霉病的發展，以便采取其他綜合防治策略來控制病害。MDA是膜脂過氧化作用的產物之一，作為膜脂過氧化的一個重要指標，反映細胞膜損傷程度和植物對逆境條件反應的強弱［32］。本試驗中經靈芝多糖誘導后接種番茄灰霉病病原菌的植株MDA含量明顯低于CK接種處理組的含量，表明經靈芝多糖處理番茄植株接種病原菌后對MDA含量有一定的抑制作用，從而可減少膜質過氧化作用對細胞的傷害，提高植株對病害的抗逆能力，這一結果也與其他誘抗劑作用植株中MDA含量變化相一致［33-34］；由于沒有病原菌的作用，所以CK組與GLP處理組MDA含量變化不顯著。本研究中，經靈芝多糖處理后，番茄葉片保護酶的活力有所提高并在一定程度上抑制了丙二醛含量的積累，而保護酶活性的增強和丙二醛含量的抑制均可減輕病原菌對番茄植株的損傷，從而起到誘導植株抗病的作用。植株葉綠素含量的高低直接反映著光合作用的強弱，含量越高，光合作用越強。光合作用是植株的重要代謝過程，是衡量植株抗病性強弱的一個重要指標［35］。本試驗中經過靈芝多糖處理的番茄植株接種灰霉菌（GLP-接種組）15 d后，植株葉片內葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量與對照接種組（CK-接種組）相比均有所上升，其原因可能是經靈芝多糖誘導后刺激了番茄體內木質素和植保素的合成，而木質素和植保素均可對病原菌的浸染起到保護作用，從而減小了真菌對植株組織葉綠體的破壞。醫用靈芝多糖是從靈芝子實體中提取得到，因靈芝子實體既是醫藥原料［36-37］，也是具有保健作用的食材［38］，所以靈芝多糖作為抗病誘導劑及生物農藥的開發，勢必與前兩者存在原料上的競爭性。為此，本研究還從栽培靈芝的廢棄物菌糠中提取靈芝多糖進行了試驗，成功從菌糠中提取制備了靈芝多糖，其提取率可達 0.36％，從靈芝子實體和菌糠中提取的靈芝多糖，在相同濃度下其誘導活性基本一致。提取靈芝多糖后的菌糠能用于有機肥生產，可形成靈芝栽培、多糖提取和菌糠充分利用的高效循環產業體系。不僅實現了資源的充分利用，還大大降低了制取靈芝多糖的成本，同時也為靈芝培養基廢棄物的綜合利用，變“廢”為“寶”開辟一條新的途徑，具有廣闊的應用前景。

柱上不同小寫字母表示各處理經LSD多重比較在P=0.05水平差異顯著Means followed by different lowercases in each column indicated significant differences at P=0.05 level by LSD's multiple comparison圖3　靈芝多糖處理對番茄葉片葉綠素含量的影響Fig. 3 Effects of GLP treatment in tomato leaves on the chlorophyll content

由于番茄灰霉病發病迅速，從發病到蔓延一般只需7—12 d。誘導劑的效果不易發揮，靈芝多糖作為抗病誘導劑單獨使用防治番茄灰霉病效果不十分顯著，實踐證明香菇多糖誘導劑與殺菌劑氟醚菌酰胺混用，在黃瓜霜霉病的預防中比單獨使用香菇多糖誘導劑或殺菌劑氟醚菌酰胺效果好，在達到相同防治效果的前提下，殺菌劑氟醚菌酰胺的用藥量減少25％，不僅可以有效減少殺菌劑的使用量，還可以提高對有害生物的防治效果［39］。表明多糖類誘導劑與殺菌劑混用具有提高防效、減少殺菌劑用藥量的顯著效果。符合當代農業減少農藥用量，降低產品中農藥殘留的發展戰略，將成為將來病害防治的主要方向。

4 結論

對靈芝多糖的誘導活性試驗證明一定質量濃度的靈芝多糖能夠誘導番茄抗灰霉病，顯著提高了番茄植株體內保護酶的活性；經靈芝多糖誘導的番茄植株體內葉綠素和丙二醛含量與對照組相比也有顯著的變化；適量濃度的靈芝多糖對番茄種子發芽率和番茄幼苗生長均表現出一定的促進作用。

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（責任編輯 岳梅）

Induced Resistance by Polysaccharides Isolated from Ganoderma lucidum in Tomato Against Gray Mold

NING Yu-bo1， WANG Hong-yan2， QIAO Kang1， LIU Xiu-mei1， WANG Kai-yun1
（1College of Plant Protection， Shandong Agriculture University， Tai'an 271018， Shandong；2Cotton Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100）

Abstract：【Objective】The systemic long-lasting and broad-spectrum resistance was induced with natural or synthetic compounds. The objective of this study is to investigate the induced resistant effect of polysaccharide extracted from the fruiting body of Ganoderma lucidum （GLP） in tomato against gray mold.【Method】The 1-2 true leaf of tomato plants were sprayed with polysaccharides （50， 100， 200 and 400 mg·L-1）for 3 times once every 2 days and inoculated spore suspension of Botrytis cinerea after 2 days later of the last time GLP treatment （（1-2）×106spores/mL）， meanwhile， the plants treated with the same volume of distilled water used as control instead of GLP solution and inoculated spore suspension of B. cinerea. A syringe stabbed the stem of tomato plant before inoculated spore suspension. Covering plastic film in order to moisturize 24 h and keeping humidity the 2 days of inoculating spore suspension of B. cinerea， the greenhouse relative humidity was not less than 90％ and temperature was （15±5） ℃，normal light was recovered 3 days later. The disease index and disease reduction against gray mold in tomato plants was investigated. Simultaneously， the tomato seedlings were soaked in the concentration （50， 100， 200 and 400 mg·L-1） of polysaccharides and then cultivated in pots. The germination rate， root length and plant height， shoot weight， fresh weight of tomato seedlings were measured 20 days after treatment with polysaccharides. 【Result】Compared with the clear water control's disease index 49.25， the GLP treatment groups' disease index were between with 32.96-43.85， significantly reduced， it was found that the lowest disease index 32.96 at the concentration of 400 mg·L-1GLP treatment and the disease reduction was 33.07％. The activity of protective enzyme in leaves showed different dynamic changes after GLP treatment， catalase （CAT） and polyphenoloxidase （PPO） activities remarkably increased， and the activities reached the highest peak after 3 days of induction. The highest CAT （162 U·min-1·g-1FW） and PPO （98 U·min-1·g-1FW） were 2.13 and 1.71 times compared with the control group， respectively. Peroxidase （POD） activity reached the highest peak after 4 days of induction then decreased gradually， significantly higher than the control. The highest POD （434 U·min-1·g-1FW） was 3.29 times compared with the control groups. MDA content after application of GLP showed a down trend compared to that of control. When the seed was treated with polysaccharides， the germination rate， root length and plant height， shoot weight， root weight of tomato seedlings all increased to a certain degree. The treatment at the concentration of 200 mg·L-1GLP showed the highest germination rate 87.3％， 10.0％ higher than the control group germination rate 77.3％. Simultaneously， the treatment at the concentration of 200 mg·L-1GLP showed the highest promotion in the tomato plant height and shoot weight，enhanced 12.9％ and 33.3％ respectively than the control. The tomato seed germinal length and root weight enhanced 0.16 cm and 0.33 g respectively than the control at the concentration of 100 mg·L-1GLP.【Conclusion】GLP at appropriate concentration had the ability to induce systematic resistance against gray mold. In addition， GLP promoted the growth of tomato seedlings.

Key words：Ganoderma lucidum polysaccharides； tomato； gray mold； induced resistance； defensive enzymes

收稿日期：2016-01-25；接受日期：2016-03-25

基金項目：國家科技支撐計劃（2014BAD05B03）、山東省自然科學基金青年基金（ZR2015CQ024）