接種枯萎病菌對甜瓜木質素合成相關酶活性及CmCADs表達的影響

劉賀娟，李悅鵬，劉　威，邵　琪，齊紅巖

（沈陽農業大學園藝學院/設施園藝省部共建教育部重點實驗室/環渤海灣地區設施蔬菜優質高效生產協同創新中心，沈陽 110866）

?

接種枯萎病菌對甜瓜木質素合成相關酶活性及CmCADs表達的影響

劉賀娟，李悅鵬，劉威，邵琪，齊紅巖

（沈陽農業大學園藝學院/設施園藝省部共建教育部重點實驗室/環渤海灣地區設施蔬菜優質高效生產協同創新中心，沈陽 110866）

摘要：【目的】明確接種枯萎病菌對甜瓜幼苗植株表型、木質素含量、木質素合成相關酶活性及肉桂醇脫氫酶（cinnamy alcohol dehydrogenase，CAD）基因表達的影響，找出響應枯萎病菌的CmCADs成員。【方法】選用抗枯萎病品種薄皮甜瓜‘彩虹 7號’為試驗材料。在甜瓜幼苗長至“三葉一心”時接種枯萎病菌-尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）。以長勢相同的健康植株澆灌等量無菌水為對照。在接種后0、1、3、5、7和9 d觀察甜瓜植株表型變化，并測定其營養器官中的木質素含量、木質素合成關鍵酶（苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和CAD）活性及CmCADs的表達量。【結果】接種枯萎病菌后，甜瓜植株表型發生明顯變化。在接種枯萎病菌后5 d甜瓜植株葉片出現輕微萎蔫，接種后9 d植株全部葉片均已萎蔫。甜瓜營養器官中木質素含量及木質素合成相關酶PAL、POD和CAD活性在接種枯萎病菌后與對照相比均有不同程度的升高。其中木質素含量在根、莖和葉中呈現出一致的變化趨勢，即木質素含量均隨著接種枯萎病菌后天數的延長而增加，且顯著高于對照。PAL活性在甜瓜根和莖中呈現先升高后下降的變化趨勢,在葉片中整體呈現升高的趨勢且顯著高于對照。POD活性在各時期均高于對照并呈現出不同的變化趨勢。CAD活性在甜瓜根、莖、葉中變化趨勢一致，均呈現先升高后下降的趨勢。接種枯萎病菌后，CmCADs各成員在甜瓜營養器官中的表達表現出組織特異性。根中除CmCAD4外，其他4個成員均在接種后7 d受強烈誘導。莖中各成員均無表達，而葉中CmCAD2和CmCAD5在接種后5 d受到強烈誘導。【結論】與對照相比，甜瓜營養器官中木質素含量及木質素合成相關酶PAL、POD和CAD活性在接種后均升高，表明木質素合成途徑可能在甜瓜抵御枯萎病中起重要作用，根和葉中均受枯萎病菌誘導表達的 CmCAD2和CmCAD5可能是響應枯萎病菌的CmCADs成員，并在甜瓜抗枯萎病中起一定作用。

關鍵詞：薄皮甜瓜；枯萎病；木質素；肉桂醇脫氫酶；基因表達

聯系方式：劉賀娟，E-mail：512198509@qq.com。通信作者齊紅巖，Tel：024-88342305；E-mail：hyqiaaa@126.com

0 引言

【研究意義】薄皮甜瓜（Cucumis melo var. makuwa Makino）在中國有著悠久的栽培歷史，是深受消費者喜愛的盛夏消暑果品。隨著其在設施內栽培面積的增大及連作栽培，各種病蟲害對甜瓜的生產造成了不同程度的損失，而枯萎病是甜瓜設施生產中的重要病害，且病害一旦發生，常發展迅速，嚴重影響到甜瓜的產量和品質。肉桂醇脫氫酶（CAD）是參與木質素合成途徑的關鍵酶［1］。此途徑由苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化苯丙氨酸（或酪氨酸）脫氨形成肉桂酸起始，后經一系列由CAD等酶參與的羥基化、甲基化及還原反應生成木質素的3種主要單體（紫丁香基木質素、愈創木基木質素、對-羥基苯基木質素），單體再在過氧化物酶（POD）等的催化下脫氫聚合形成木質素并最終沉積在導管等部位［2-3］。因此，研究接種枯萎病菌對甜瓜木質素合成途徑相關酶活性及肉桂醇脫氫酶基因表達的影響，對于明確該途徑在甜瓜抗病中重要性及通過基因工程提高甜瓜的抗病能力均具有重要意義。【前人研究進展】1992年從煙草（Nicotiana tabacum）中分離出第一個真正（bona fide）的 CAD基因［4］，接著又從火炬松（Pinustaeda）中分離得到（GenBank accession No.Z37992），目前已從多種植物中分離和克隆了 CADs，并且該基因多以基因家族形式存在且基因成員之間存在功能差異［5-7］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）CAD基因家族有9個成員［8］，水稻（Oryza sativa）的CAD基因家族有12個成員［9］，楊樹（Populus）有15個［10］。CAD基因家族成員主要通過促進木質素生物合成來調節植物對病菌脅迫的適應性［11-12］。擬南芥中，AtCAD4和AtCAD5與木質素合成有關，且AtCAD5受番茄細菌性葉斑病的誘導［13-14］，AtCAD7和AtCAD8均受十字花科細菌性葉斑病的誘導［15］。楊樹接種立枯絲核病（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、蘋果腐爛病菌（Cytospora sp）后，除 Poptr3、Poptr4和Poptr12外，其他基因均受病菌侵染后而被強烈誘導［16］。此外，在棗椰樹中，易碎葉病誘導了根中PdCAD1和PdCAD2的表達和葉片中PdCAD3的表達［17］。這些均表明不同的CAD基因家族成員在響應抗病性方面存在功能差異。筆者實驗室從甜瓜全基因組數據庫（http：//melonomics.net）中鑒定出5個甜瓜CAD，分別命名為CmCAD1—CmCAD5，目前已經完成了所有基因家族成員在甜瓜生長發育期的時空表達分析［18］，但這5個成員在木質素合成及抗病中的響應及作用還不明確。【本研究切入點】用 Plant CARE軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/ html/）對已鑒定出的5個甜瓜CmCADs的啟動子進行分析發現均含有響應防御和脅迫的順式作用元件：TC-rich Repeats、B0X-W1、CCAAT-box和MBS等，但這5個成員是否響應枯萎病菌接種引起的生物脅迫，還需進一步試驗驗證。【擬解決的關鍵問題】本試驗通過接種枯萎病菌來探討甜瓜木質素合成途徑在抗病中的可能作用及CAD基因家族在枯萎病菌侵染中的響應。為進一步明確甜瓜CAD基因成員在抗生物脅迫中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2014年在沈陽農業大學園藝學院進行。

1.1 材料與處理

供試材料為薄皮甜瓜（Cucumis melo var. makuwa Makino）‘彩虹7號’（黑龍江省富拉爾基瓜菜研究所），為抗枯萎病品種。接種所用甜瓜枯萎病菌株為沈陽農業大學植保學院高增貴教授所贈，菌株為單孢菌株 JIE-4。人工接種枯萎病試驗：2014年 7月 27日于沈陽農業大學科研基地溫室內進行甜瓜穴盤播種，長至“兩葉一心”時分苗，“三葉一心”時進行枯萎病菌接種。事先制作PDA培養基并進行繁菌，待菌絲布滿整個培養基時用無菌水沖洗，以獲取孢子懸浮液并用血球計數板進行計數，調整孢子濃度為1×107個/mL。接種方法為灌根法，以每株10 mL孢子懸浮液為標準，分別選取200棵正常生長且長勢一致的甜瓜植株，以接種枯萎病菌的植株為處理（F），以同時澆施等量無菌水的植株為對照（CK）。接種后保濕24 h，分別在接種后0、1、3、5、7和9 d取長勢相一致的對照與處理植株的根、莖和葉，迅速液氮保存。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 木質素含量 稱取0.5 g樣品，在95％乙醇中用玻璃勻漿器勻漿后離心7 min（3 000×g）；沉淀物以95％乙醇沖洗3次，再用乙醇∶正己烷=1∶2（v/v）沖洗3次，收集沉淀物使其干燥。干燥物溶在25％溴乙酰冰醋酸溶液中，在 70℃恒溫水浴加塞保溫30 min，然后加0.2 mol·L-1NaOH終止反應，再加5 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol·L-1的羥胺鹽酸，并以冰醋酸定容至10 mL，取上清液在280 nm處測定吸收值。以每克鮮重在280 nm處的吸收值表示木質素含量［19］。

1.2.2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性 稱取0.5 g樣品，放入預冷研缽中，加入少許硼酸緩沖液（pH 8.8）和PVP，在冰浴中研磨成勻漿，然后移入10 mL容量瓶中定容，4℃條件下離心30 min（4 000 r/min），取上清液即為粗酶液。取0.02 mol·L-1L-苯丙氨酸l mL，pH 8.8的硼酸緩沖液2 mL，酶液0.2 mL，作為反應體系，以不加酶液的作為對照，搖勻后立即在分光光度計290 nm處測定起始OD值，將第一次測定后的各支試管于30℃恒溫水浴鍋中保溫，精確計時，30 min后再分別測定OD值，將第二次測得的OD值減去第一次測得的OD值即為反應的酶活性，以OD值變化0.01為一個酶活單位［20］。

1.2.3 過氧化物酶（POD）活性 稱取0.5 g樣品于研缽中，加5 mL 磷酸緩沖液（pH 7.8）冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，冷凍離心20 min（10 000 r/min）。上清液即為酶液，4℃保存待用。取0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.0）50 mL于燒杯中，加入愈創木酚28 μL，磁力攪拌器加熱攪拌使之完全溶解，冷卻后加入 19 μL 30％ H2O2混合，保存于冰箱中為反應液。20 μL酶液+3 mL反應液于比色皿中，20s后在470 nm下開始計數，每隔20 s讀數一次，共讀兩次，以每分鐘吸光度變化值表示酶活力的大小［21］。

1.2.4 肉桂醇脫氫酶（CAD）活性 蛋白提取緩沖液：0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）；5％乙二醇（W/V）；2％PVP（W/V）；0.1 mol·L-1β-巰基乙醇。將150 mg材料粉末溶解在裝有225 μL蛋白提取緩沖液的1.5 mL微離心管中，冰上放置10 min；4℃下，離心10 min（13 000×g）；將上清液轉入新的離心管中，放置于冰上。在酶標板的孔中，270 μL（總體積）的 Tris-HCl 0.1 mol·L-1（pH 8.8）溶液中；含有 2 mmol·L-1的coniferyl alcohol和2 mmol·L-1的β-NADP；12.5 μg 的蛋白提取物；在340 nm下每1 min測一次，共15 min［22］。

蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250比色法測定［23］。以上測定指標均進行3次生物學重復。

1.2.5 CmCAD1-5實時熒光定量基因表達分析 用Ultrapure RNA Kit（北京康為世紀生物科技有限公司，北京）試劑盒中提供的操作方法，提取甜瓜組織中的總RNA。用NanoDrop分光光度計ND-1000測定RNA的濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳進行總RNA質量檢測（28S rRNA/18S rRNA比值）。用 M-MLV RTase cDNA SynthesisKit（Cat#D6130，TaKaRa，Tokyo，Japan）合成cDNA。

采用 SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）（Cat.FP205，天根，北京，中國）試劑盒進行qRT-PCR，并使用ABI PRISM7500熒光定量PCR儀進行測定。qRT-PCR的反應條件如下：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，45個循環，15 s；60℃，1 min；每個樣品的qRT-PCR都進行3次重復，cDNA來自3個生物學重復的樣品。在進行qRT-PCR的過程中，每個96孔板中的每份樣品設置3次重復。試驗中以18s rRNA的DNA（148 bp）作為內參基因（表1），樣品Ct值由擴增曲線計算獲得。

表1　實時熒光定量基因表達分析的引物序列Table 1 Sequence of primers used for gene expression analysis by real-time quantitative PCR

1.2.6 數據處理與分析 試驗所得數據采用 Excel處理、DPS 軟件進行相關數據分析，Duncan's 多重差異進行顯著分析，Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 接種枯萎病菌后不同天數甜瓜植株表型的變化

由圖1可見，甜瓜在接種枯萎病菌后5 d表現出葉片輕微萎蔫，接種后9 d植株全部葉片都已萎蔫，表現出枯萎病的發病癥狀，而對照植株長勢正常，說明接種枯萎病菌后植株發生了反應。

2.2 接種枯萎病菌對甜瓜營養器官中木質素含量的影響

甜瓜營養器官中木質素含量呈現出一致的變化趨勢，即根、莖、葉中的木質素含量均隨著接種枯萎病菌后天數的延長而增加，且與對照之間的差距隨時間延長越來越大（圖2）。根中，在接種后7 d，木質素含量顯著高于對照（圖2-a），莖和葉在接種后5 d，木質素含量就開始顯著高于對照（圖2-b、c）。

圖1　對照（A）與人工接種枯萎病菌（B）后不同天數甜瓜植株表型Fig. 1 Oriental melon seedlings symptom infected with F. oxysporum after different days of controlled （A） and inoculated with F. oxysporum （B）

2.3 接種枯萎病菌對甜瓜營養器官PAL酶活性的影響

接種枯萎病菌后，甜瓜根和莖中PAL活性呈現先升高后下降的變化趨勢。其中根在接種后1 d后，活性趨于平穩且均顯著高于對照，而從接種7 d后PAL活性開始急劇下降，接種后9 d時其活性甚至低于對照，而莖中PAL活性在接種1 d達到峰值后有所下降，此后趨于平穩且均顯著高于對照（圖3-a、b）。甜瓜葉片中 PAL活性在接種枯萎病后整體呈現升高的趨勢且顯著高于對照，在接種后3 d出現峰值，此后其活性趨于平穩（圖3-c）。

圖2　接種枯萎病菌對甜瓜根（a）、莖（b）、葉（c）中木質素含量的影響Fig.2 Effects of inculation with F. oxysporum on lignin content in roots （a）， stems （b） and leaves （c） of oriental melon seedlings

圖3　接種枯萎病菌對甜瓜根（a）、莖（b）、葉（c）PAL活性的影響Fig.3 Effects of inculation with F. oxysporum on PAL activity in roots （a）， stems （b） and leaves （c） of oriental melon seedlings

2.4 接種枯萎病菌對甜瓜營養器官POD酶活性的影響

接種枯萎病菌后，甜瓜營養器官中POD活性在各時期均高于對照并呈現出不同的變化趨勢（圖 4）。其中根和莖呈現出先升高后下降再升高的趨勢，并分別在接種后3 d和7 d達到峰值（圖4-a、b）。與根和莖不同的是葉片中POD活性呈現出整體升高的趨勢，在接種后3、5和7 d保持平穩高于對照，接種后9 d達到峰值（圖4-c）。

圖4　接種枯萎病菌對甜瓜根（a）、莖（b）、葉（c）POD活性的影響Fig. 4 Effects of inoculation with F. oxysporum on POD activity in roots （a）， stems （b） and leaves （c） of oriental melon seedlings

2.5 接種枯萎病菌對甜瓜營養器官中 CAD酶活性的影響

由圖5可以看出，接種枯萎病菌后，甜瓜根、莖和葉中CAD活性變化趨勢一致，均呈現先升高后下降的趨勢，分別在接種后5、3和7 d出現峰值，此后急劇下降（圖5-a、b、c）。

2.6 接種枯萎病菌對甜瓜根系和葉片中CmCAD1-5表達的影響

由圖6可以看出，相比于對照，接種枯萎病菌后，甜瓜根系中CmCAD1—3和CmCAD5呈現出相似的表達模式，均在接種后7 d天出現表達峰值，分別為對照的16、17、37和15倍左右，但在接種后的其他時期不表達或表達量很低。值得注意的是，CmCAD4除在接種后9 d有一定表達外，在其他各時期均無明顯表達（圖 6）。

與對照相比，甜瓜葉片中CmCAD2和CmCAD5有相似的表達模式，分別在接種枯萎病菌后7 d和3 d開始呈現明顯的上調表達，且表達量隨接種時間的延長而升高，CmCAD1、CmCAD3和CmCAD4的表達量均較低而且無明顯變化（圖7）。

3 討論

許多研究表明，木質素參與構建植物防御體系是植物防止或減輕受病菌和害蟲侵害的重要屏障［24］。許多報道表明，植物遭受病菌侵染后，木質素含量增加。小麥在接種白粉病后，木質素含量顯著升高［25］。枯萎病菌侵染西瓜后，幼苗葉片和根莖部組織中木質素含量也有所增加［26］。葡萄葉片和黃瓜葉片中的木質素含量與抗病性呈正相關［27-28］。本試驗中，接種枯萎病后，甜瓜營養器官中木質素含量的變化趨勢一致，即根、莖和葉中的木質素含量均隨著接種枯萎病菌后天數的延長而增加，且與對照之間的差距隨時間延長越來越大。這與前人報道結果相一致，說明在甜瓜抵御枯萎病侵染過程中，木質素參與構建了防御體系。

圖5　接種枯萎病菌對‘彩虹7號’根（a）、莖（b）、葉（c）CAD活性的影響Fig. 5 Effects of inoculation with F. oxysporum on CAD activity in roots （a）， stems （b） and leaves （c） of oriental melon seedlings

圖6　接種枯萎病菌對甜瓜根中CmCAD1-5表達的影響Fig.6 Effects of inoculation with F. oxysporum on expressions of CmCAD1-5 in roots of oriental melon seedlings

圖7　接種枯萎病菌對甜瓜葉片中CmCAD1—5表達的影響Fig. 7 Effects of inoculation with F. oxysporum on expressions of CmCAD1-5 in leaves of oriental melon seedlings

木質素的合成首先是通過莽草酸途徑形成的 L-苯丙氨酸，在PAL的作用下形成反式肉桂酸，再經過CAD參與的甲基化等一系列反應，形成木質素單體，最后在POD作用下沉積在導管等部位［2-3］。PAL是木質素主要合成途徑的起始酶。研究表明，植物在感染病原菌后，均伴隨著PAL活性的升高，并有木質素的積累［25-26］。桃果實接種軟腐病菌（R. stolonifer）后，PAL活性升高［29］。本試驗中，接種枯萎病菌后，甜瓜根和莖中PAL活性呈現先升高后下降的變化趨勢。其中根在接種后1 d達到峰值后，活性趨于平穩且均顯著高于對照，而在接種后7 d PAL活性進入衰退期。這與有關研究表明的在侵染初期PAL可以重新合成，而后期植物細胞中則積累了鈍化 PAL的大分子物質這一結果相一致。作為木質素合成途徑下游的酶，POD活性被證實與植物抗病性成正相關。對接種條銹菌（Puccinia striiformis）的小麥的研究中發現，接種后POD活性比未接種的對照有明顯的提高［30］。水稻白葉枯病和棉花枯萎病感病植株中的 POD活性均呈升高的趨勢［31-33］。接種褐腐病菌（M. fructicola）能誘導甜櫻桃果實 POD活性升高［34］。本試驗中，接種枯萎病菌后，甜瓜營養器官中 POD活性在各時期均高于對照。這表明甜瓜植株產生抗病反應且一直有木質素的積累。木質素合成途徑中，CAD催化羥基肉桂醛（主要包括香豆醛、松柏醛和芥子醛）轉變為對應的醇（香豆醇、松柏醇和芥子醇），促進木質素合成前體物質的形成［35-36］。CAD是木質素合成途徑中的關鍵酶。在高粱中降低CAD酶活性則使木質素總量減少［37］。水稻gh2木質素缺失突變體中CAD酶活及木質素缺失［38］。玉米COMT突變體中，CAD酶活下降，木質素含量減少，防御能力降低［39］。本試驗中，接種枯萎病菌后，甜瓜根、莖和葉中CAD活性分別在接種后5、3和7 d出現峰值。結合PAL、POD和CAD酶活性變化趨勢，表明木質素合成途徑可能在甜瓜抵御枯萎病侵染過程中發揮了重要作用。

CAD是多基因家族，許多研究表明CADs易受病菌侵染的誘導。擬南芥中AtCAD7和AtCAD8受細菌性黑斑病的誘導［15］，AtCAD4和AtCAD5被證實與木質素合成相關，而在番茄細菌性葉斑病侵染擬南芥過程中，AtCAD5受到誘導表達［13-14］。這說明CAD基因可能通過植物木質素防御途徑來響應病菌侵染且不同的 CAD基因家族成員在響應植物抗病性方面發揮不同的功能。本試驗中，接種枯萎病后對根、莖和葉中CmCADs表達的分析表明，莖中所有CmCADs均不受誘導。根系中，除 CmCAD4無明顯表達外，其他CmCADs均受強烈誘導，呈上調表達。而葉中CmCAD2 和CmCAD5受誘導，呈上調表達。這表明CmCADs中有響應枯萎病侵染的家族成員且其表達具有組織特異性。系統進化樹中把CmCAD2歸于包含AtCAD4、AtCAD5和SbCAD2在內的1類CAD，即已明確參與植物木質素生物合成的 bona fide CAD［35］。同時把CmCAD5歸于包含SAD和AtCAD7、AtCAD8在內的2 類CAD，這類均受病原體的誘導［15］。由此推測甜瓜接種枯萎病菌后，在根、葉中均受誘導的 CmCAD2和CmCAD5可能是通過植物木質素防御途徑來響應枯萎病菌侵染的特異基因。根據筆者前期試驗，CmCAD4在時空表達和各種激素處理過程中均不表達，推測其可能是假基因，在本研究中，該基因也在接種枯萎病菌后表達較少（僅在根中接種后9 d有一定表達），該結果有待進一步驗證。另外，其他4個CmCADs具體在生物脅迫中起什么作用，還需要通過原核表達或轉基因技術對相關基因深入研究其抗病的分子機制。

4 結論

甜瓜營養器官中木質素含量及木質素合成相關酶（PAL、POD和CAD）活性在接種后均升高，表明木質素合成途徑可能在甜瓜抵御枯萎病中起重要作用。不同CmCADs成員的功能目前還不明確，通過對接種枯萎病菌后不同天數甜瓜營養器官中木質素含量及其合成相關酶活性及CmCADs表達的分析，推測木質素合成途徑在甜瓜抵御枯萎病過程中可能起重要作用，而且在甜瓜根和葉片中均受枯萎病誘導的 CmCAD2 和CmCAD5可能在甜瓜抗枯萎病侵染過程中起作用。

References

［1］ MOLLER R， STEWARD D， PHILLIPS L， FLINT H， WAGNER A. Gene silencing of cinnamyl alcoholdehy drogenase in Pinus radiata callus cultures. Plant Physiology and Biochemistry， 2005， 43：1061-1066.

［2］ CHRISTENCE J H， BAUW G， WELINDER K G. Purification and characterization of peroxidases correlated with lignification in poplar xylem. Plant Physiology， 1998， 118： 25-135.

［3］ 魏建華， 宋艷茹. 木質素生物合成途徑及調控的研究進展. 植物學報， 2001， 43（8）： 771-779. WEI J H， SONG Y R. Recent advances in study of lignin biosynthesis and manipulation. Acta Botanica Sinica， 2001， 43（8）： 771-779. （in Chinese）

［4］ KNIGHT M E， HALPIN C， SCHUCH W. Identification and characterisation of cDNA clones encoding cinnamyl alcohol dehydrogenase from tobacco.Plant Molecular Biology， 1992， 19（5）：739-810.

［5］ KIM S J， KIM M R. BEDGAR D L， MOINUDDIN S G A，CARDENAS C L， DAVIN L B， KANG C L， LEWIS N G.. Functional reclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 2004， 101： 1455-1460.

［6］ MA Q H. Functional analysis of a cinnamyl al cohol dehyd rogenase involved in lign in biosynthesis in wheat. Journal of Experimental Botany， 2010， 61（10）： 2735-2744.

［7］ BUKH C， NORD-LARSEN P H， RASMUSSEN S K. Phylogeny and structure of the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Brachypodium distachyon. Journal of Experimental Botany， 2012， 17：6223-6236.

［8］ SIBOUT R， EUDES A， POLLET B， GOUJON T， MILA I， GRANIER F， SEGUIN A. Expression pattern of two paralogs encoding cinnamyl alcohol dehydrogenases in Arabidopsis. Isolation andcharacterization of the corresponding mutants. Plant Physiology， 2003， 132（2）：848-860.

［9］ TOBIAS C M， CHOW E K. Structure of the cinnamyl-alcohol dehydrogenase gene family in rice and promoter 305 activity of a member associated with lignification. Planta， 2005， 220（5）： 678-688.

［10］ EUDES A， GEORGE A， MUKERJEE P， KIM， JS， POLLET B，BENKE PI， YANG F， MITRA P， SUN L， CETINKOL OP， CHABOUT S， MOUILLE G， SOUBIGOU-TACONNAT L， BALZERGUE S，SINGH S， HOLMES BM， MUKHOPADHYAY A， KEASLING JD，SIMMONS BA， LAPIERRE C， RALPH， LOQUE D. Biosynthesis and incorporation of side-chain-truncated lignin monomers to reduce lignin polymerization and enhance saccharification. Plant Biotechnology Journal， 2010， 10（5）： 609-620.

［11］ BOUDET A M. Lignins and lignifications： Selected issues. Plant Physiology Biochemistry， 2000， 38（l/2）： 81-96.

［12］ COELHO A C， HORTA M， NEVES D， CRAVADOR A. Involvement of a cinnamyl alcohol dehydrogenase of Quercus suber in the defence response toinfection by Phytophthora cinnamomi. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2006， 69： 62-72.

［13］ SIBOUT R， EUDES A， MOUILLE G， POLLET B， LAPIERRE C，JOUANIN L， SEGUIN A. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE -C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in thefloral stem of Arabidopsis. Plant Cell， 2005， 17（7）： 2059-2076.

［14］ TRONCHET M， BALAQUé C， KROJ T， JOUANIN L， ROBY D. Cinnamyl alcohol dehydrogenases-C and D， key enzymes in lignin bio-synthesis， play an essential rolein disease resistance in Arabidopsis. Mo1ecular Plant Pathology， 2010， 11（1）： 83-92.

［15］ Kiedrowski S， Kawalleck P， Hahlbrock K， Somssich I E， Dangl J L. Rapid activation of a novel plant defense gene is strictly dependent on the Arabidopsis RPMl disease resistance locus. The EMBO Journal，1992， 11： 4677-4684.

［16］ Agnieszka Bagniewska-Zadworna， Abdelali Barakat， Piotr ?akomy，Dariusz J. Smoli′nski， Marcin Zadworny. Lignin and lignans in plant defence： Insight from expression profiling of cinnamyl alcohol dehydrogenase genes during development and following fungal infection in Populus. Plant Science， 2014， 229： 111-121.

［17］ SAIDI M N， BOUAZIZ D， HAMMAMI I， NAMSI A， DRIRA N，GARGOURI-BOUZID R. Alterations in lignin content and phenylpropanoids pathway in date palm （Phoenix dactylifera L.）tissues affected by brittle leaf disease. Plant Set， 2013， 211： 8-16.

［18］ JIN Y Z， ZHANG C， LIU W， QI H Y， CHEN H， CAO S X. The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in melon （Cucumis melo L.）： Bioinfo rmatic analysis and expression patterns. PLoS ONE， 2014，9（7）： e101730. doi：10.1371/journal.pone.0101730.

［19］ SYROS T， YUPSANIS T， ZAFIRIADIS H， ECONOMOU A. Activity and isoforms of peroxidase， lignin and anatomy during adventitious rooting in cuttings of Ebenus cretical. Plant Physiology， 2004，16（11）：67-77.

［20］ 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術. 北京： 高等教育出版社，2000： 167-169， 213-214. LI H S. Principles and Techniques of Plant Physiological Biochemical Experiment. Beijing： Higher Education Press， 2000： 167-169， 213-214. （in Chinese）

［21］ 朱光廉， 鐘文海， 張愛琴. 植物生理學實驗. 北京： 北京大學出版社， 1990， 38-39. ZHU G L， ZHONG W H， ZHANG A Q. Experiments of Plant Physiology. Beijing： Beijing Univeisity Press， 1990， 38-39. （in Chinese）.

［22］ GOFFNER D， JOFFROY I， GRIMA-PETTENATI J， HALPIN C，KNIGHT M E， SCHUCH W， BOUDET A M. Purification and characterization of isoforms of cinnamyl alcohol dehydrogenase from Eucalyptus xylem. Planta， 1992， 188： 48-53.

［23］ THOMAS S. Refimement of the coomassie blue method of proteim quantitation： A simple and linear spectrophotometric assay for ≤0.5 to 50 μg of protein. Analytical Biochemistry， 1978， 86（1）： 142-146.

［24］ BOUDET A M. Lignins and lignifications： Selected issues. Plant Physiology and Biochemistry， 2000， 38 （1/2）： 81-96.

［25］ 楊家書， 吳畏， 吳友三， 薛應龍. 植物苯丙酸類代謝與小麥對白粉病抗性的關系. 植物病理學報， 1986， 16（3）： 169-172. YANG J S， WU W， WU Y S， XUE Y L. Relationship of metabolism of plant phenylalanine and resistance of wheat topowderym ildew. Acta Phytopathologica Sinica， 1986， 16（3）： 169-172. （in Chinese）

［26］ 許勇， 王永健， 葛秀春， 宋鳳鳴， 鄭重. 枯萎病菌誘導的結構抗性和相關酶活性的變化與西瓜枯萎病抗性的關系. 果樹科學， 2000，17（2）： 123-127. XU Y， WANG Y J， GE X C， SONG F M， ZHENG Z. The relation between the induced constriction resistance and changes in activities of related enzymes in water melon seedlings after infection by fusarium oxysporum f.sp. niveum. Journal of Fruit Science， 2000，17（2）： 123-127. （in Chinese）

［27］ 石雪暉， 王淑英， 吳艷純， 楊國順， 劉昆玉， 呂長平. 葡萄葉片中單寧、木質素、PPO活性與抗黑痘病的關系. 葡萄栽培與釀酒，1997（4）： 8-12. SHI X H， WANG S Y， WU Y C， YANG G S， LIU K Y， Lü C P. The relationship between PPO activity. Lignine content and tannic contentin vitisleaves and resistance to Sphaeloma ampelinum. Viticultubre & Enology， 1997（4）： 8-12. （in Chinese）

［28］ 駱桂芬， 崔俊濤， 張莉. 黃瓜葉片中糖和木質素含量與霜霉病誘導抗性的關系. 植物病理學報， 1997， 27（1）： 65-69. LUO G F， CUI J T， ZHANG L. Relationship between sugar， lignin content and resistance to downym ildew of cucumber. Acta Phytopathologica Sinica， 1997， 27（1）： 65-69. （in chinese）

［29］ 秦國政， 田世平， 劉海波， 徐勇. 拮抗菌與病原菌處理對采后桃果實多酚氧化酶、過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶的誘導. 中國農業科學， 2003， 36（1）： 89-93. QIN G Z， TIAN S P， LIU H B， XU Y. Polyphenol oxidase， peroxidase and phenylalanine ammonium lyase in postharvest peach fruits induced by inoculation with pichia membranefaciens or rhizopus stolonifer. Scientia Agricultura Sinica， 2003， 36（1）： 89-93. （in Chinese）

［30］ 于孝如， 袁文煥. 條銹病菌侵染小麥不同時期過氧化物酶同工酶的變化. 西北農業大學學報， 1993， 2（2）： 27-30. YU X R， YUAN W H. Changes of peroxidase isoenzyme at different stages of whert caused by wheat yellow stripe rust. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica， 1993， 2（2）： 27-30. （in Chinese）

［31］ 吳岳軒， 曾富華， 王榮臣. 雜交稻對白葉枯病的誘導抗性與細胞內防御酶系統關系的初步研究. 植物病理學報， 1996， 26（21）：127-131. WU Y X， ZENG F H， WANG R C. A preminary study on therelationship between induced resistance to bacterial blight and defense enzymes inhybrid rice seedlings. Acta Phytopathologica Sinica， 1996，26（21）： 127-131. （in Chinese）

［32］ 靳華芬， 郭凌漢， 陳軍. 不同生態條件下小麥籽粒蛋白質賴氨酸含量的變化. 貴州農業科學， 1991（5）： 9-13. JIN H F， GUO L H， CHEN J. Variation of grain protein and lysine content of wheat in different environment conditions. Guizhou Agricultural Sciences， 1991（5）： 9-13. （in chinese）

［33］ 李妙. 不同抗枯萎類型棉花品種超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性研究. 華北農學報， 1993， 8（增刊）： 119-122. LI M. A study on activities of superoxide dismutase and peroxidase in leaves of cotton （Gossypium hirsutum） with different resistance to fusarium wilt. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 1993， 8（Suppl.）：119-122. （in Chinese）

［34］ 王友升， 田世平. 羅倫隱球酵母、褐腐病菌與甜櫻桃果實在不同溫度下的互作效應. 中國農業科學， 2007， 40（12）： 2811-2820. WANG Y S， TIAN S P. Interaction between Cryptococcus laurentii，Monilinia fructicola and sweet cherry fruit at different temperatures. Scientia Agricultura Sinica， 2007， 40（12）： 2811-2820. （in Chinese）

［35］ 龔琰， 許夢秋. 木質素合成關鍵酶肉桂醇脫氧酶的研究進展. 生物技術通報， 2010， 4： 47-49. GONG Y， XU M Q. Advance in cinnamyl alcohol dehydrogenase as a key enzyme of lignin biosynthesis. Biotechnology Bulletin， 2010， 4：47-49. （in Chinese）

［36］ SUN Y， WU Y F， ZHAO Y， HAN X J， LOU H X， CHENG A X. Molecular cloning and biochemical characterization of two cinnamyl alcohol dehydrogenases from a liverwort Plagiochasma appendiculatum. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 70： 133-141.

［37］ SABALLOS A， EJETA G， SANCHEZ E， KANG CH， VERTNERRIS W. A genomewide analysis of the cinnamyl alcohol dehydrogenase family in sorghum ［Sorghum bicolor （L.） Moench］ identifies SbCAD2 as the Brown midrib6 gene. Genetics， 2009， 181（2）： 783-795.

［38］ HIRANO K， AYA K， KONDO M， OKUNO A， MORINAKA Y，MATSUOKA M. OsCAD2 is the major CAD gene responsible for monolignol biosynthesis in rice culm. Plant Cell Reports， 2012， 31：91-101.

［39］ VIGNOLS F， RIGAU J， TORRES MA， CAPELLADES M，PUIGDOMENECH P. The brown midrib3 （bm3） mutation in maize occurs in the gene encoding caffeic acid O-methyltransferase. Plant Cell， 1995， 7： 407-416.

（責任編輯 趙伶俐）

Effects of Fusarium oxysporum f. sp. melonis on Lignin， Activities of Lingin-Related Enzymes and Genes Expressions of CmCADs in Oriental Melon （Cucumis melo var. makuwa Makino）

LIU He-juan， LI Yue-peng， LIU Wei， SHAO Qi， QI Hong-yan
（College of Horticulture， Shenyang Agricultural University/Key Laboratory of Protected Horticulture， Ministry of Education/ Collaborative Innovation Center of Protected Vegetable Surround Bohai Gulf Region， Shenyang 110866）

Abstract：【Objective】The purpose of this study is to investigate the effects of Fusarium oxysporum on symptom， lignin content， activities of lignin-related enzymes and real-time fluorescent quantitative PCR analysis of CmCADs gene expression of CmCADs in oriental melon seedlings and to find out the gene family members of CmCADs that can respond to the Fusarium oxysporum. 【Method】The oriental melon ‘Caihong 7' which is resistant to Fusarium oxysporum was used as experimental materials. Then the melon seedlings were inoculated with F. oxysporum at 3 true leaves stage. The control plants were dealt with equivalentsterile water. The changes of phenotype were observed and lignin content， activities of lingin-related enzymes （PAL， POD and CAD）and genes expressions of CmCADs in the vegetative organs of oriental melon seedlings were determined at 0， 1， 3， 5， 7 and 9 days after inoculation.【Result】The symptom of oriental melon seedlings showed obvious changes. The leaves began to wilt slightly 5 days after inoculation and wilt badly 9 days after inoculation. The results showed that compared with the control， the lignin content and the activities of lignin-related enzymes were all increased to a certain extent. The change trend of lignin content in roots， stems and leaves was basically identical with keeping increasing and higher than the control treatment. The activities of PAL which increased first and then decreased in roots and stems while exhibited a global increased trend in the leaves were obviously higher than the control treatment. The activities of POD presented different changes with higher activities than control in each period. The activities of CAD presented a trend of earlier increase and later decrease in roots， stems and leaves. In the study， CmCADs showed tissue-specific expression after inoculation. CmCAD1， CmCAD 2， CmCAD 3 and CmCAD 5 were strongly induced in roots 7 days after inoculation， except CmCAD4， while only CmCAD2 and CmCAD5 in leaves were induced strongly 5 days after inoculation. No CmCADs expressions were observed in stems of melon. 【Conclusion】 It was found that the increase of the lignin content， activities of lignin-related enzymes （PAL， POD， CAD） caused by F. oxysporum suggested that the lignin biosynthesis pathway may play an important role in defending the oriental melon from the F. oxysporum. It was also inferred that CmCAD2 and CmCAD5 which were both induced by F. oxysporum may the members of CmCADs which can response to the F. oxysporum and play a role in resistance to F. oxysporum in oriental melon.

Key words：oriental melon； Fusarium oxysporum f. sp. melonis； lignin； CAD； genes expressions

收稿日期：2015-10-12；接受日期：2015-12-23

基金項目：國家現代農業產業技術體系建設專項（Nycytx-35-gw23）、遼寧省高等學校優秀人才支持計劃（LR2014020）