歸脾湯對支氣管哮喘的抑制作用研究

河北省辛集市獻血辦公室

張　峰　穆在荷△　王　燁△△　李銀寬△　范國鋒△△△(辛集 052360)

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方 藥 研 究

歸脾湯對支氣管哮喘的抑制作用研究

河北省辛集市獻血辦公室

張峰穆在荷△王燁△△李銀寬△范國鋒△△△(辛集 052360)

提要目的：研究歸脾湯對支氣管哮喘小鼠的治療效果。方法：昆明小鼠60只隨機分為對照組、哮喘組、低劑量歸脾湯治療組(0.5 g/kg)及高劑量歸脾湯治療組(2.0 g/kg)。以30 μg腹腔注射雞卵清蛋白和1%雞卵清蛋白霧化吸入建立慢性哮喘模型。治療組霧化激發后，連續5 d給予不同劑量歸脾湯干預。造模及治療結束24 h后，檢測各組小鼠經不同濃度乙酰甲膽堿激發后的呼氣間歇(Penh)值反應氣道敏感性；計數支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞；ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中細胞因子及IgE的濃度；再對支氣管肺組織進行組織病理學檢查。結果：與哮喘組相比，低劑量治療組與高劑量治療組的Penh值明顯降低；支氣管肺泡灌洗液中Th2相關細胞因子(IL-4, IL-5, IL-13)、IgE及嗜酸性粒細胞含量明顯降低(均P<0.05)；治療組肺及支氣管組織中嗜酸性粒細胞明顯減少(均P<0.05)。結論：歸脾湯對支氣管哮喘具有明顯抑制作用。

關鍵詞歸脾湯；支氣管哮喘；氣道高反應性；支氣管肺泡灌洗液；組織病理學；變態反應

支氣管哮喘已經成為嚴重危害公共健康的疾病，氣道慢性炎癥被認為在該病發病過程中起著重要作用，[1-3]其主要特點是突發的氣道高反應性(AHR)及以嗜酸性粒細胞為主的炎細胞浸潤，[4-6]Th2淋巴細胞的激活在哮喘發病過程中發揮著重要作用。[7]被激活的Th2細胞能產生IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，[7-8]并引起一系列生物學反應，[9-12]導致嗜酸性粒細胞的聚集，從而加重哮喘病情。以往的研究證實抑制Th2所釋放的細胞因子可以減輕支氣管炎癥，從而控制哮喘病情。[8]

由人參、白術、黃芪、當歸、茯苓、甘草、遠志、酸棗仁、木香、龍眼肉、生姜、大棗等中藥組成的歸脾湯是一種治療變態反應性疾病的驗方。[13]近年來，常有人報道該方在治療免疫異常疾病方面的案例,[14]但其在減輕哮喘炎癥及癥狀方面的研究鮮有報道，因此本實驗采用歸脾湯對支氣管哮喘進行治療，結果發現，歸脾湯可以明顯改善AHR，有效控制慢性炎癥過程。

1資料與方法

1.1實驗動物與藥物無特定病原體級雄性昆明小鼠60只，6～8周齡，購自河北省實驗動物中心[合格證號：1507010]，于室溫(22±2)℃、濕度(55±5)%、12 h 晝/夜循環照明環境中飼養，自由攝食、飲水。實驗過程符合河北省實驗動物倫理委員會規定。歸脾湯丸劑購自河北神威藥業有限公司，并以2 g/mL濃度溶解于25℃的蒸餾水中。

1.2實驗動物模型的制備60只實驗小鼠被隨機分為4組: ⑴ 對照組(10只)以等滲鹽水致敏，實驗期間飼以蒸餾水；⑵ 雞卵清蛋白(OVA)組即哮喘組(10只)先以30 μg OVA胸腔內注射致敏，在實驗第36～40天以1% OVA鼻內霧化吸入激惹，實驗期間飼以蒸餾水；⑶ 低劑量歸脾湯組(20只)先以OVA致敏并激惹，在實驗第41～45天以胃管灌入0.5 g/kg的歸脾湯液；⑷ 高劑量歸脾湯組(20只)先以OVA致敏并激惹，在實驗第41～45天以胃管注入2.0 g/kg的歸脾湯液。

1.3AHR檢測在試驗結束后24 h，各組小鼠霧化吸入 6.25～50 mg/mL的乙酰甲膽堿以激發，用無創性小鼠肺功能儀測定不同濃度下增強的呼氣間歇(Penh)值，Penh=(增強呼氣間歇時間)×(PEP/PIP)。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子、IgE及嗜酸性粒細胞的測定在AHR檢測完成后，以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉并處死小鼠，然后以2 mL生理鹽水沖洗肺支氣管3次，收集BALF液，室溫3 000 r/min離心5 min，取上清液送檢驗科以酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定IL-4、IL-5、IL-13及IgE的表達，取沉淀物濕法制片后計數嗜酸性粒細胞。

1.5肺及氣管組織病理學檢查分離肺及氣管，10%中性福爾馬林液固定1周，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制備層厚5 μm的組織切片，常規HE染色，在光學顯微鏡下觀察并計數嗜酸性粒細胞。

1.6統計學方法應用SPSS18.0統計學軟件進行數據分析，實驗數據均以均值±標準差的形式表示，以組間比較用Bonferroni方差分析和卡方分析進行統計。

2結果

2.1歸脾湯對AHR的影響4組小鼠霧化吸入6.25～50 mg/mL 的乙酰甲膽堿后，AHR的檢測結果顯示，當吸入濃度為0～25 mg/mL時，4組小鼠的penh值差異無顯著性；當吸入濃度為50 mg/mL時(最高濃度)，OVA組小鼠的penh值與對照組、低劑量歸脾湯組及高劑量歸脾湯組的差異均有顯著性(P<0.05)，但低劑量歸脾湯組的penh值與高劑量歸脾湯組間差異無顯著性(P>0.05)。提示歸脾湯能明顯抑制卵清白蛋白所誘導的AHR，詳見圖1。

圖1　乙酰甲膽堿吸入后各組間Penh的改變

2.2各組歸脾湯對BALF中Th2細胞因子及IgE的影響比較收集BALF的上清液對Th2細胞釋放的IL-4、IL-5、IL-13及IgE因子進行檢測。與對照組小鼠相比，OVA組的IL-4 、IL-5 、IL-13均明顯高于對照組(均P<0.05)；與OVA組小鼠相比，低、高劑量歸脾湯組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IgE濃度明顯降低，且差異有顯著性(均P<0.05)，低劑量歸脾湯組小鼠BALF中IL-4、IL-5的濃度降低更為明顯，差異有顯著性(P<0.05)；與低劑量歸脾湯組比較，高劑量歸脾湯組小鼠BALF中IL-13及IgE濃度明顯降低，而且差異有顯著性(均P<0.05)，詳見表1。

2.3歸脾湯對BALF中嗜酸性粒細胞的影響取BALF離心沉淀物，濕法制片并進行HE染色，在生物顯微鏡下計數嗜酸性粒細胞，以嗜酸性粒細胞數/500BALF細胞表示，結果顯示OVA組嗜酸性粒細胞百分比為37.9%，明顯高于對照組；而服用歸脾湯后，無論是低劑量組(5.2%)還是高劑量組(18.1%)的嗜酸性粒細胞百分比均明顯低于OVA組，且差異具有顯著性(P<0.05)。

2.4歸脾湯對肺組織內嗜酸性粒細胞的影響用生物顯微鏡觀察小鼠肺組織病理切片，隨機選取10個視野計數浸潤的嗜酸性粒細胞，結果以每mm2嗜酸性細胞總數來表示。結果顯示，OVA組肺組織中嗜酸性粒細胞計數(51.1±1.2/HPF)明顯高于低劑量歸脾湯組(23.4±2.1)和高劑量歸脾湯組(4.8±2.1/HPF)P<0.05，差異有顯著性。

表1　各組小鼠Th2細胞因子和IgE值 　　 　

注：與對照組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05；與低劑量歸脾湯組比較,△P<0.05

3討論

支氣管哮喘的發病機制包括Th2淋巴細胞及其所釋放的細胞因子，還包括發揮著重要作用的氣道炎癥。當患者吸入過敏原后，Th2淋巴細胞通過釋放IL-4、IL-5及IL-13等細胞因子,[15]不僅加強了AHR，而且增加了炎細胞浸潤(如嗜酸性粒細胞)和IgE分泌。[16]筆者研究顯示，哮喘模型鼠中同樣發生了上述病理改變。此外，有人用Th2細胞因子刺激細胞因子基因敲除小鼠后發現支氣管哮喘癥狀明顯加重，[17-18]間接證明上述觀點。筆者實驗證實歸脾湯對哮喘小鼠AHR及Th2細胞因子表達具有藥理學作用。卵清蛋白致敏的哮喘小鼠AHR明顯增高，IgE以及肺嗜酸性粒細胞表達增加；應用歸脾湯后，各項指標均明顯降低，這種改善作用部分依賴于藥物濃度的變化。

IL-5對嗜酸性粒細胞的分化、成熟及存活起著非常重要的作用，能促進嗜酸性粒細胞向炎癥部位的回歸。[10，12]有研究認為IL-5缺失小鼠即便受到抗原刺激也不會產生AHR和嗜酸性粒細胞聚集，[19-20]抗IL-5治療可以明顯降低哮喘小鼠的AHR，減少其體內的嗜酸性粒細胞含量。[20-21]臨床研究也證實抗IL-5治療能夠通過改變嗜酸性粒細胞含量，顯著改善一部分重癥哮喘患者的病情。[22-23]本研究顯示，歸脾湯同樣能通過降低BALF和肺組織中的IL-5，達到控制嗜酸性粒細胞增殖的作用。盡管歸脾湯的詳細藥理機制還有待深入研究，但我們的結果顯示：歸脾湯可以通過降低Th2細胞因子水平及嗜酸性粒細胞數量來發揮其抗哮喘作用。

IL-4不僅能夠促進Th2細胞的成熟與分化，還能刺激B細胞分泌IgE。[10，23]反之，抑制IL-4能夠減輕哮喘小鼠氣道中嗜酸性粒細胞的浸潤和IgE的分泌，[24]另有研究顯示IL-4缺失小鼠不會患支氣管哮喘和支氣管炎，[25]提示IgE的產生與IL-4的刺激密切相關。Th2細胞因子(尤其是IL-4)是支氣管哮喘和嗜酸性粒細胞的關鍵調節因子，還有證據表明嗜酸性粒細胞含量與AHR和哮喘嚴重程度密切相關。筆者的研究證實歸脾湯能夠有效地減少哮喘小鼠BALF中IgE和IL-4表達，肺的組織病理學檢查顯示歸脾湯能抑制嗜酸性粒細胞在肺組織中的浸潤。這些結果均提示歸脾湯能夠通過下調IL-4而降低支氣管哮喘小鼠的IgE水平，該方劑對IL-4的抑制作用還能夠減輕肺嗜酸性粒細胞浸潤和AHR。

歸脾湯作為一種著名的傳統中藥方劑，被應用于臨床已經有數百年的歷史了，其在變態反應性疾病的治療中發揮著重要的免疫調節作用。前人的臨床研究顯示用歸脾湯具有明顯的抗炎作用，可以治療過敏性紫癜、變應性鼻炎等免疫性疾病，能夠降低血清中IgE、PGE2、LTC的濃度。[13]它還可以通過抑制CD4+T細胞，降低小鼠血清中IgE水平。[26]與臨床治療結果相符的是，口服歸脾湯能夠降低I型變態反應小鼠體內IgE的產生和組胺的釋放。[27]筆者的實驗結果表明歸脾湯能降低AHR，減輕哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤，這種治療作用是通過降低Th2細胞因子及IgE來實現的。但是由于中藥方劑中化學成分極其復雜，筆者尚不能確認哪一種(些)化學成分發揮了上述抗炎作用。

總之，歸脾湯能夠通過降低AHR和氣道嗜酸性粒細胞浸潤而有效控制變態反應性哮喘小鼠的病情，其潛在的藥理學機制尚需要進一步的研究。

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(2016-01-04收稿)

中圖分類號：R285.6

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5615(2016)02-0042-04

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